阅读说明：本技术 一种基于苯乙醇胺-n-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法 (Method for producing epinephrine based on catalysis of phenylethanolamine-N-methyltransferase ) 是由 陈可泉 程莎莎 王昕� 冯娇 高思远 何雪峰 王思源 陆秋豪 许晟 张阿磊 欧阳 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法,该方法具体包括以下步骤：生成表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶(PNMT)的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PNMT；培养基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PNMT和诱导表达PNMT；收集上述菌体,用缓冲液重悬菌体后,匀浆破碎,离心消除杂质,得PNMT的粗酶液；以去甲肾上腺素和S-腺苷-蛋氨酸(SAM)为底物,加入PNMT粗酶液反应得产物肾上腺素。本发明方法是首次系统的做出从去甲肾上腺素到肾上腺素的酶催化生产工艺,催化效率高达2g/l,转化率高达95％以上,环境友好,原料易得,生产成本低,工艺简单,反应条件温和,具有很好的工业化生产前景。(The invention discloses a method for producing epinephrine based on the catalysis of phenylethanolamine-N-methyltransferase, which specifically comprises the following steps: generating genetically engineered bacteria BL21 (DE 3)/pET 28a-PNMT for expressing phenylethanolamine-N-methyltransferase (PNMT); culturing genetically engineered bacteria BL21 (DE 3)/pET 28a-PNMT and inducing expression PNMT; collecting the thalli, re-suspending the thalli by using a buffer solution, homogenizing and crushing, and centrifuging to remove impurities to obtain a crude enzyme solution of PNMT; noradrenaline and S-adenosine-methionine (SAM) are used as substrates, and crude PNMT enzyme solution is added for reaction to obtain the product adrenaline. The method of the invention is a first-time systematic enzyme catalysis production process from noradrenaline to adrenaline, the catalysis efficiency is as high as 2g/l, the conversion rate is as high as more than 95%, the method is environment-friendly, the raw materials are easy to obtain, the production cost is low, the process is simple, the reaction condition is mild, and the method has good industrial production prospect.)

一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法

技术领域

本发明属于肾上腺素的制备技术领域，具体涉及一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法。

背景技术

肾上腺素从中枢神经系统的肾上腺释放，当外界环境使人体处于恐惧和紧张等状态时，机体便就会迅速分泌肾上腺素。它会使机体呼吸紧促、瞳孔扩大，为身体运动提供大量的能量。此外，肾上腺素还可以使心脏、肝脏的血管舒张；皮肤、粘膜血管收缩，缓解病危患者的痛苦，为他们带来生的希望。在生物体内，合成肾上腺素的速度较快，首先是在肾上腺髓质中生成去甲肾上腺素，然后在PNMT的作用下，甲基化生成肾上腺素。

肾上腺素作为急危重症药物，具有重要的应用价值，因此必须加强对肾上腺素作用机理、合成途径的研究，寻找相对安全、廉价、高效的肾上腺素合成途径。目前常见肾上腺素的的化学合成方法反应条件剧烈、不易控制，肾上腺素的产率较低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，产率高，避免使用对环境或者人体有毒有害的有机试剂，解决化工方法产生的污染问题，环境友好度良。

一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/ pET28a-PNMT

根据已报导的人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-PNMT，将构建好的重组质粒pET28a- PNMT用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到苯乙醇胺-N-甲基转移酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a- PNMT；

步骤2，培养PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT

挑取表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃培养10-18小时，离心收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT；

步骤3，收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT，用pH2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得PNMT粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤4，选取去甲肾上腺素及SAM作为底物，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至2-9，最后加入PNMT粗酶液0.5-20g/l，20-60℃反应0.5h-24h，得到产物肾上腺素。

作为改进的是，步骤2中所述产酶条件为：加入IPTG的量为 0.75mM、诱导温度为25℃。

作为改进的是，步骤4中所述的催化条件为：温度50℃、pH=5；所述去甲肾上腺素：SAM的摩尔比为1:3。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法具有如下优势：该方法是首次系统的做出从去甲肾上腺素到肾上腺素的酶催化生产工艺，催化效率高达2g/l，转化率高达95％以上，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

附图说明

图1为本发明催化产物的液相色谱图，其中，1-去甲肾上腺素，2-肾上腺素。

具体实施方式

实施例1

步骤一，构建表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/ pET28a-PNMT

根据已报导的人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶（PNMT）的氨基酸序列进行密码子优化后（优化处理的步骤委托金斯瑞完成），全基因合成该序列，（序列如SEQ NO.1所示）亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-PNMT，将构建好的重组质粒pET28a- PNMT用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到苯乙醇胺-N-甲基转移酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a- PNMT。

步骤2，培养PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT

挑取表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.75mM的IPTG，25℃培养10-12小时，离心收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT。

步骤3，收集步骤2中的基因工程菌，用pH 2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得PNMT粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤4，选取去甲肾上腺素及SAM作为底物，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至5，最后加入PNMT粗酶液0.5-20g/l，,20-50℃反应0.5h-24h，得到产物肾上腺素；

其中，去甲肾上腺素：SAM的摩尔比为1:3，

催化产肾上腺素，具体操作步骤为反应体系为5ml，取初始浓度为2g/l的去甲肾上腺素和SAM作为底物，用PBS缓冲液调节体系pH为5，再加入10g/l的粗酶浓度，50℃震荡反应。

反应结束后，利用高效液相色谱法（采用Agilent TC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）；以0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（96:4）为流动相；流速0.8 ml·min-1;检测波长为280nm;柱温:室温）检测肾上腺素的生成量。肾上腺素的产量达到2g/l ,转化率高达95%以上。

上述实施例中，LB培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产肾上腺素的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatga gcggtgcgga ccgtagcccg aacgcgggtg cggcgccgga tagcgcgccg 60

ggtcaggcgg cggtggcgag cgcgtaccaa cgtttcgaac cgcgtgcgta cctgcgtaac 120

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