阅读说明：本技术 一种酶法生产抗坏血酸棕榈酸酯的方法 (Method for producing ascorbyl palmitate by enzyme method ) 是由 韩忠睦 曾启明 梁冰 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法生产抗坏血酸棕榈酸酯的方法,包括向生物反应容器中加入棕榈酸甲酯、L-抗坏血酸、吸附剂和固定化脂肪酶；控制反应体系的温度为40℃～45℃,经酶催化转酯化反应获得L-抗坏血酸棕榈酸酯；其中,所述固定化脂肪酶为疏水无纺布复合膜固定化皱褶假丝酵母脂肪酶；且将氨基功能化介孔硅分子筛加作为吸附剂和脂肪酶的辅助固定化载体。本发明制备方法制备的L-抗坏血酸棕榈酸酯在进行较短的酯化反应时间,且在固定化脂肪酶的添加量极少时,所得L-抗坏血酸棕榈酸酯转化率仍然很高；所采用的NH2-MSU-H分子筛吸附剂和疏水无纺布复合膜固定化褶皱假丝酵母脂肪酶使固定化酶的活性较高,有效催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯。(The invention discloses a method for producing ascorbyl palmitate by an enzyme method, which comprises the steps of adding methyl palmitate, L-ascorbic acid, an adsorbent and immobilized lipase into a biological reaction container; controlling the temperature of the reaction system to be 40-45 ℃, and obtaining L-ascorbyl palmitate through enzyme catalysis transesterification; wherein the immobilized lipase is a hydrophobic non-woven fabric composite membrane immobilized candida rugosa lipase; and the amino functionalized mesoporous silicon molecular sieve is added as an adsorbent and an auxiliary immobilized carrier of lipase. The L-ascorbyl palmitate prepared by the preparation method has shorter esterification reaction time, and the conversion rate of the obtained L-ascorbyl palmitate is still high when the addition amount of the immobilized lipase is very small; the adopted NH2-MSU-H molecular sieve adsorbent and hydrophobic non-woven fabric composite membrane are used for immobilizing candida rugosa lipase, so that the immobilized enzyme has higher activity, and L-ascorbyl palmitate is effectively synthesized through catalysis.)

一种酶法生产抗坏血酸棕榈酸酯的方法

技术领域

本发明属于棕榈酸酯合成技术领域，尤其涉及一种酶法生产抗坏血酸棕榈酸酯的方法。

背景技术

L-抗坏血酸棕榈酸酯是一种脂溶性抗氧化剂,具有良好的自由基清除、抗氧化、抗衰老、抗癌抗肿瘤等营养保健功能，是国内外保健品市场上深受欢迎的产品之一。目前市场上销售的L-抗坏血酸棕榈酸酯基本上为化学催化合成法生产，传统的化学法虽然技术成熟，转化率较高，但与生物酶催化合成法相比存在环境污染大、副反应多、对设备抗腐蚀性要求高等诸多缺点。

生物酶催化法反应条件温和、能耗低，符合国家经济发展所倡导的节能减排和低碳经济政策。但是在酶催化L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成反应中还存在着一些问题，如实验规模小、酶制剂操作稳定性较差、商业固定化酶价格昂贵等问题，在一定程度上阻碍了酶催化反应的大规模工业应用。

发明内容

为克服相关技术中存在的问题，本发明提供一种酶法生产抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括：

向生物反应容器中加入棕榈酸甲酯、L-抗坏血酸、吸附剂和固定化脂肪酶；其中，所述固定化脂肪酶的脂肪酶组分为皱褶假丝酵母脂肪酶；所述固定化脂肪酶的载体为疏水无纺布复合膜；

控制反应体系的温度为40℃～45℃，经酶催化转酯化反应获得L-抗坏血酸棕榈酸酯。

优选的，所述固定化脂肪酶的固定工艺包括：

用磷酸缓冲溶液作溶剂，加入皱褶假丝酵母脂肪酶配制成15-20mg/mL的溶液，室温下搅拌30min，制成脂肪酶溶液；

剪取一定面积的疏水无纺布复合膜，用磷酸缓冲溶液清洗、沥干，将沥干后复合膜放入过滤容器中，采用过滤一吸附一交联的组合固定化方式制得固定脂肪酶；

制得固定脂肪酶在30℃条件下烘干即可。

优选的，所述磷酸缓冲溶液为pH＝7.4、25mM的磷酸缓冲溶液。

优选的，所述棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸的摩尔比为1:1～1:8。

优选的，所述吸附剂的添加量为棕榈酸甲酯添加质量的18％～22％。

优选的，所述吸附剂为氨基功能化介孔硅分子筛。

优选的，所述固定化脂肪酶的添加量为棕榈酸甲酯添加质量的1％～7％。

优选的，所述生物反应容器是摇床反应器、旋转填料床反应器、真空搅拌式反应器或固定床式反应器中的一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用棕榈酸甲酯作为反应底物，且反应体系除底物外无其他有机溶剂，代替传统的酸和醇为原料合成L-抗坏血酸棕榈酸酯，使得反应迅速，且能够实现连续化高效生产，此外，本发明还寻找到适配于用棕榈酸甲酯做反应底物，加入L-抗坏血酸的合成反应体系的疏水无纺布复合膜固定化脂肪酶、改性的NH₂-MSU-H分子筛吸附剂，本发明所采用的NH₂-MSU-H分子筛吸附剂和疏水无纺布复合膜固定化褶皱假丝酵母脂肪酶能够很好的适配，使固定化酶的活性较高，热稳定较好，从而能够有效催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯。

本发明制备方法制备的L-抗坏血酸棕榈酸酯在进行较短的酯化反应时间，且在固定化脂肪酶的添加量仅为底物棕榈酸甲酯的7％时，所得L-抗坏血酸棕榈酸酯转化率能够高达99.73％。

本发明提出的固定化脂肪酶在参加了四次L-抗坏血酸棕榈酸酯合成反应后，L-抗坏血酸棕榈酸酯的酯化率仍能保持64.53％，这说明固定化脂肪酶的稳定性很高。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前的酶法催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯，一般是直接以酸和醇为原料，通过脂肪酶的催化合成酯，整个反应进程较慢，无法实现连续化高效生产，且酶的选取不合适，造成其催化稳定性、催化活性均不能达到理想的要求，且产物L-抗坏血酸棕榈酸酯的转化率并不高。

为解决上述问题，本发明提出将反应底物替换为廉价易得的棕榈酸甲酯，且反应体系除底物外无其他有机溶剂，使得反应迅速，且能够实现连续化高效生产，此外，本发明还寻找到适配于用棕榈酸甲酯做反应底物，加入L-抗坏血酸的合成反应体系的新型固定化脂肪酶。

褶皱假丝酵母脂肪酶相对于其它脂肪酶廉价易得，广泛应用于食品生产中，但由于游离的褶皱假丝酵母脂肪酶在使用中存在分离回收困难，酶利用回收率低等问题，限制了褶皱假丝酵母脂肪酶的在酯类合成中的应用，而固定化的褶皱假丝酵母脂肪酶可以提高酶的利用率，有利于其连续生产；

因此，本发明采用以疏水无纺布复合膜为载体，经吸附—过滤—交联的复合固定化方法制备出固定化假丝酵母脂肪酶作为转酯化的催化剂。

由于有机相中酶催化醋合成反应是热力学控制的反应，水是反应的副产物。适量的水能提高酶的活性，促进反应的进行，但水过量时其是一种抑制剂，与底物竞争酞基酶中间体，降低平衡转化率，促进逆反应—水解反应的进行，因此本发明中引进吸附剂进行脱水处理，抑制副产物-水的产生；

本发明人发现相对于传统的硫酸镁、硫酸铝、3A/4A分子筛脱水剂，在纯硅介孔分子筛的孔道内引入氨基后，不仅能保持介孔分子筛原有的结构，同时又改善了介孔孔道界面的疏水性，有助于提高介孔分子筛的水热稳定性，有效解决未改性的介孔分子筛存在着热稳定性差和反应活性低的缺陷；

介孔硅有机功能化的方法主要有后嫁接法和共缩聚法，其中共缩聚法可以将有机官能团锚定在介孔材料的墙壁上，并且使有机官能团的分布相对较均匀，因此本发明采用共缩聚法将氨基锚定在介孔分子筛MSU-H上，形成改性的NH₂-MSU-H分子筛。

此外，本发明中改性的NH₂-MSU-H分子筛在反应体系中还能起到脂肪酶的固定化辅助载体的作用，且当酶分子尺寸与载体的孔径相匹配时，固定化酶的活性较高，热稳定较好；当酶分子尺寸大于载体的孔径时，酶分子不易进入载体的孔道内，吸附容易发生在载体的外表面，酶的活性较低，而且操作过程中吸附的酶容易脱落；本发明所采用的NH₂-MSU-H分子筛和褶皱假丝酵母脂肪酶能够很好的适配，使固定化酶的活性进一步提高，热稳定较好。

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案加以解释。

实施例1

一种固定化脂肪酶的固定工艺，包括：

用pH＝7.4、25mM磷酸缓冲溶液作溶剂，加入皱褶假丝酵母脂肪酶配制成15mg/mL的溶液，室温下搅拌30min，制成脂肪酶溶液；

剪取长宽为0.5cm*0.1cm的疏水无纺布复合膜，用磷酸缓冲溶液清洗、沥干，将沥干后复合膜放入过滤容器中，采用过滤一吸附一交联的组合固定化方式制得固定脂肪酶；

将上述固定化脂肪酶在30℃条件下烘干即可。

实施例2

一种固定化脂肪酶的固定工艺，包括：

用pH＝7.4、25mM磷酸缓冲溶液作溶剂，加入皱褶假丝酵母脂肪酶配制成18mg/mL的溶液，室温下搅拌30min，制成脂肪酶溶液；

剪取长宽为0.5cm*0.1cm的疏水无纺布复合膜，用磷酸缓冲溶液清洗、沥干，将沥干后复合膜放入过滤容器中，采用过滤一吸附一交联的组合固定化方式制得固定脂肪酶；

将上述固定化脂肪酶在30℃条件下烘干即可。

实施例3

一种固定化脂肪酶的固定工艺，包括：

用pH＝7.4、25mM磷酸缓冲溶液作溶剂，加入皱褶假丝酵母脂肪酶配制成20mg/mL的溶液，室温下搅拌30min，制成脂肪酶溶液；

剪取长宽为0.5cm*0.1cm的疏水无纺布复合膜，用磷酸缓冲溶液清洗、沥干，将沥干后复合膜放入过滤容器中，采用过滤一吸附一交联的组合固定化方式制得固定脂肪酶；

将上述固定化脂肪酶在30℃条件下烘干即可。

上述实施例1-3中示出了不同浓度的皱褶假丝酵母脂肪酶溶液、以及不同配比的分子筛载体和脂肪酶溶液固定化反应得出的固定化脂肪酶。

实施例4

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:1均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.72g，最后加入实施例1中制备的固定化脂肪酶0.04g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例5

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:1均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.72g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.04g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例6

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:1均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.72g，最后加入实施例3中制备的固定化脂肪酶0.04g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例7

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:5均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.8g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.04g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例8

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:8均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.8g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.04g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例9

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:8均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.8g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.12g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例10

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:8均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.8g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.2g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

实施例11

一种L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成工艺：

向锥形瓶中加入棕榈酸甲酯4g、底物棕榈酸甲酯与L-抗坏血酸摩尔比为1:8均匀混合，添加NH2-MSU-H分子筛吸附剂0.8g，最后加入实施例2中制备的固定化脂肪酶0.28g，摇匀后将锥形瓶放置于50℃中的摇床中反应，1h后停止反应。

上述实施例4-11中L-抗坏血酸棕榈酸酯转化率如下表所示：

从上述转化率分布可以看出，本发明制备方法制备的L-抗坏血酸棕榈酸酯在进行较短的酯化反应时间，也即1h左右，且在固定化脂肪酶的添加量仅为底物棕榈酸甲酯的7％时，所得L-抗坏血酸棕榈酸酯转化率能够高达99.73％。

操作稳定性试验：

将实施例11所进行的酯化合成工艺完成后，将使用过后的固定化脂肪酶再次反复使用三次(即进行与实施例11所进行的合成反应四次，每次所采用的固定化脂肪酶均为上一次合成反应使用过的固定化脂肪酶)。

上述四次合成反应制备的L-抗坏血酸棕榈酸酯转化率如下表所示：

固定化脂肪酶使用次数	1	2	3	4
					转化率(％)	99.73	85.37	73.43	64.53

操作稳定性是评价固定化脂肪酶性能的一项重要指标，游离酶在实际操作中易失活，不能实现回收和重复利用。从上表可以看出，上述固定化脂肪酶在参加了四次合成反应后，L-抗坏血酸棕榈酸酯的酯化率仍能保持64.53％，说明酶活力的损失比较缓慢。这说明该固定化脂肪酶的稳定性很高。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。