阅读说明：本技术 一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用 (Application of cyclodextrin enzyme in preparation of maltoheptaose ) 是由 黄燕 吴敬 王蕾 武权 陈晟 宿玲恰 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用,属于生物技术领域。本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌,该重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主,表达热球菌Thermococcus sp.Strain B1001来源的环糊精酶。本发明通过将热球菌来源的CDase在食品准入的枯草芽孢杆菌中进行了重组表达,酶活为5.9U/mL,应用该重组CDase生产麦芽七糖,底物浓度80g/Lβ-环糊精,转化率高达82.33％。本发明的CDase在高底物浓度下的转化率和产物纯度高,可有效降低高纯度麦芽七糖的生产加工成本,具有很好的应用价值和商业开发意义。(The invention discloses an application of cyclodextrin in preparation of maltoheptaose, belonging to the technical field of biology. The invention provides a recombinant bacillus subtilis, which takes the bacillus subtilis as a host and expresses a cyclodextrin enzyme from a Thermococcus sp. According to the invention, CDase from Thermococcus is subjected to recombinant expression in food-accessible Bacillus subtilis, the enzyme activity is 5.9U/mL, the recombinant CDase is used for producing maltoheptaose, the substrate concentration is 80g/L beta-cyclodextrin, and the conversion rate is up to 82.33%. The CDase has high conversion rate and product purity under high substrate concentration, can effectively reduce the production and processing cost of high-purity maltoheptaose, and has good application value and commercial development significance.)

一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用

技术领域

本发明涉及一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

直链麦芽低聚糖，通常也称麦芽寡糖，是指通过α-1,4糖苷键将3-10个葡萄糖单元连接而成的功能性低聚糖，具有良好的加工适应性和独特的生理功效，在国际上广泛应用于食品、医药、饲料、化妆品等领域，如填充剂、保湿剂、脂肪替代品以及能量供给等。

不同聚合度麦芽寡糖在性能上存在显著差异，随着聚合度的增加，渗透压降低，黏度增加，保湿作用增加，热、酸、碱稳定性增强，成膜性增强等应用性能增强。但高聚合度寡糖，如麦芽八糖、麦芽九糖，因聚合度增高，其易老化且水溶液稳定性差，应用性能较差；而麦芽七糖是麦芽寡糖中水溶液稳定的最高聚合度麦芽寡糖，和低聚合度的麦芽寡糖相比具有更低的渗透压，更高黏度，更好保湿作用，更强成膜性能，且具有修饰过的还原和非还原末端的麦芽七糖，在临床实验中作为测定人血清和尿液中α-淀粉酶活力的优选底物，因此实际生产中对麦芽七糖的需求正在日益增加。

国内外麦芽七糖的制备方法主要有化学制备法和酶催化水解法，其中，采用化学法制备麦芽七糖时，需要采用有机溶剂(对二甲苯、乙醇等)，对设备的要求高且成本大。而酶法制备过程温和，分子量分布相对容易控制，产物安全性高，是一种比较理想的制备麦芽七糖的方法。目前工业上酶法生产麦芽七糖多以淀粉为底物，通过直链麦芽低聚糖生成酶水解切下多个葡萄糖单元而生成，其后续纯化步骤繁琐，很难获得纯度较高的麦芽七糖，而且成本高，不可直接扩大并工业化生产。

Hangyan Ji等指出，可以采用一步酶反应法制备麦芽七糖，在该过程中随着β-CD浓度的增加，麦芽七糖的产量提高，当β-CD浓度在8％-10％(w/v)之间时，麦芽七糖的含量达到峰值。然而，当β-CD的浓度高达12％(w/v)时，酶反应被抑制。造成这种现象的原因可能是基质的高浓度降低了水的有效浓度并降低了分子的扩散率。此外，过量的β-环糊精可能抑制PpCD酶的活性，因为β-环糊精可能是某些水解酶的竞争性抑制剂；制备过程中麦芽七糖的量首先增加30分钟，然后随着β-CD逐渐降解而减少；当β-CD的浓度为8％(w/v)且反应时间为180分钟时，麦芽七糖与所有产物(麦芽寡糖和β-CD)的比例仅为43.36％。(具体参见论文“Preparation of malto-oligosaccharides with specific degreeofpolymerization by a novel cyclodextrinase from Palaeococcus pacificus”，Hangyan Ji等，Carbohydrate Polymers 210(2019)64–72)。

因此一种能够在高底物浓度下高效生产麦芽七糖的方法的获得，具有很好的应用价值和商业开发意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精酶(CDase)在制备麦芽七糖或含麦芽七糖的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，上述环糊精酶(CDase)来源于热球菌Thermococcussp.Strain B1001。

在本发明的一种实施方式中，编码所述环糊精酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种制备麦芽七糖的方法，以上述环糊精酶为催化剂，以β-环糊精为底物，催化制备麦芽七糖。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精酶的加酶量不低于15U/g。

在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为40-120g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为100-120g/L。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中，反应温度为80-90℃、pH为5.0-6.0，反应时间为2-8h。

本发明还提供了一种含有编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精酶的基因的重组质粒、携带编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精酶的基因的宿主细胞或上述制备麦芽七糖的方法在制备麦芽七糖或含麦芽七糖的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pUB110、pHT43或pMK3质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pUB110质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCCTCC M 2016536。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种制备麦芽七糖的方法，通过以来源于热球菌Thermococcussp.Strain B1001的环糊精酶为催化剂，以β-环糊精为底物催化制备麦芽七糖；与其他制备麦芽七糖的方法相比，本发明所提供的方法不需要调节pH和温度，也不需要其他协同酶多步反应，工艺简单、便捷，节约生产成本。

(2)本发明所提供的制备麦芽七糖的方法，采用的底物为β-环糊精，相对于其他以淀粉为原料的制备方法，本发明的底物β-环糊精成分较单一，反应过程中的副反应少，并且采用本发明的生产方法所得的产物麦芽七糖的提取工艺简单、纯度高。

(3)采用本发明所提供的麦芽七糖的制备方法，成功实现了在高底物浓度下具有高的转化率和产物纯度，采用本发明的方法，底物转化率最高可达92.17％，并且所得到的产物的纯度最高可达97.61％；可有效降低高纯度麦芽七糖的生产加工成本，具有很好的应用价值和商业开发意义。

(4)相比其他制备麦芽七糖的方法，在得到相同的产量的条件下，采用本发明的制备方法进一步提高了设备利用率，降低了反应时间，节约了生产成本，减少了底物投入次数，从而节约了人工成本，总体上本发明可以使相同规模的麦芽七糖生产线提高产能至少一倍。

(5)采用本发明所提供的制备麦芽七糖的方法，所采用的环糊精酶由食品准入的枯草芽孢杆菌表达，具有良好的食品安全性。

附图说明

图1：重组质粒pUB110-tscd构建流程图。

图2：POE-PCR扩增产物的核酸电泳图；其中，M：DL 5000 DNA marker；1：POE-PCR产物。

图3：重组质粒pUB110-TSBCDase的双酶切验证结果；其中，M：DL 5000 DNAmarker；1,2：pUB110-tscd酶切后的条带。

图4：重组菌pUB110-TSBCDase发酵获得的发酵液的SDS-PAGE电泳结果；其中，M：标准蛋白marker；1：胞外上清；2：破壁上清；3：破壁沉淀。

图5：反应液中麦芽七糖的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的pET-24a(+)载体购自novagen公司，pUB110质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，SCK6感受态细胞购自上海钦诚生物科技有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄ 2.31。

高渗液体培养基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，山梨醇91。

电转培养基(g/L)：山梨醇91，甘露醇91，甘油100。

RM培养基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，山梨醇91，甘露醇69。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

环糊精酶酶活测定：环糊精酶活力通过DNS测定水解环糊精所暴露的还原端的量。反应体系为：1.9mL的2％(w/v)β-环糊精(现配现用)，将酶液稀释成适宜的浓度添加至最后的体积为2mL。在90℃反应10min后，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)终止反应。混合物在沸水中煮沸7min后，立即置于冰上冷却，然后补加去离子水至终体积为15mL，最后在540nm下测定吸光值。

酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生1μmol还原端所需的酶量。

酶活计算公式：酶活(U/mL)＝稀释倍数×转化生成的麦芽七糖的量(μmol)/转化时间。

麦芽七糖产率的检测：将稀释好的样品和纯乙腈以1：1体积混合，共沉淀2h后，之后12000r·min^-1离心10min，取上清过滤膜，用HPLC检测转化产物，计算麦芽七糖产率。高效液相色谱分析采用氨基柱APS-2HYPERSIL(250×4.6)检测条件：流动相，乙腈:水(75:25)；柱温，30℃；流速，0.8mL·min^-1；检测器为示差折光检测器(RID)。

所有麦芽寡糖的检测：

将稀释好的样品和纯乙腈以1：1体积混合，共沉淀2h后，之后12000r·min^-1离心10min，取上清过滤膜，用HPLC检测转化产物，计算所有麦芽寡糖产率。高效液相色谱分析采用氨基柱APS-2HYPERSIL(250×4.6)检测条件：流动相，乙腈:水(75:25)；柱温，30℃；流速，0.8mL·min^-1；检测器为示差折光检测器(RID)。

实施例1：环糊精酶编码基因的克隆及表达载体的构建

(1)pET-24a(+)-tscd载体的构建

合成编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精酶的基因；将合成得到的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精酶的基因和pET-24a(+)载体用限制性内切酶NdeI、BamHI双酶切后用Solution I连接，得到重组载体pET-24a(+)-tscd。

(2)重组载体的构建

以pET-24a(+)-tscd为模板，根据引物IF、IR扩增出带有25bp同源臂的目的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；

以表达载体pUB110为模板，根据引物VF、VR扩增表达载体，同源臂部分用下划线标出：

IF：TAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAACATGTATAAAATTTTTGGCTTTAAAG

IR：AGCTTGGAGGTGTTTTTTTATTACCGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGT

VF：ACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCGGTAATAAAAAAACACCTCCAAGCT

VR：CTTTAAAGCCAAAAATTTTATACATGTTTCCTCTCCCTCTCATTTTCTTA

PCR体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板1μL，加双蒸水补齐50μL。

PCR条件为：预变性：94℃4min；变性：98℃10s；退火：55℃10s；延伸：72℃1kb·min^-1，30个循环；后延伸：72℃10min；保存：4℃保温。

对PCR产物进行凝胶电泳和胶回收，回收产物作为POE-PCR的上下游引物(基因载体互为引物)，扩增产物进行核酸电泳(如图2所示)。

将POE-PCR扩增产物转化SCK6感受态细胞得到转化产物，将转化产物涂布卡那抗性平板培养得到转化子，挑取转化子接种至培养基中培养后提取质粒进行EcoR I单酶切验证，大小分别为4100bp和3000bp(如图3所示)，然后对提取质粒进行基因测序，验证正确的质粒即为阳性克隆质粒pUB110-TsCDase。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的构建

将重组质粒pUB110-TsCDase转化转至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M2016536，在卡那霉素抗性平板上挑选转化子；挑取转化子接种并培养后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536/pUB110-TsCDase。

实施例3：摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M2016536/pUB110-TsCDase接种于LB培养基中，在37℃下培养8h，得到种子液；以5％接种量将种子液转接至50mL TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h至OD₆₀₀在0.5-0.6后，于33℃、200rpm进行摇瓶诱导发酵24h，得到发酵液；将发酵液离心收集菌体；将菌体经超声破碎后离心，上清即为重组TsCDase的粗酶液，对粗酶液进行酶活测定，其酶活力为6.0U/mL。对TsCDase蛋白电泳结果显示大小为70kDa，与理论分子大小一致(如图4所示)。

实施例4：麦芽七糖的制备

将实施例3所得的重组TsCDasee的粗酶液按照25U/g_环糊精的加酶量添加至pH为5.5的含有40-120g/L环糊精的反应体系中，于温度为90℃、转速为150r/min的条件下反应4h，得到反应液。检测反应液中麦芽七糖和麦芽寡糖的含量，结果显示(如图5所示)麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为94.55±3.06％，占投入底物比例为86.88±5.29％。

实施例5：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整环糊精浓度为40g/L，加酶量控制为25U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为93.35％，占投入底物比例为84.66％。

实施例6：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整环糊精浓度为60g/L，加酶量控制为25U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为93.94％，占投入底物比例为86.88％。

实施例7：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整环糊精浓度为80g/L，加酶量控制为25U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为94.55％，占投入底物比例为82.33％。

实施例8：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整环糊精浓度为100g/L，加酶量控制为25U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为91.49％，占投入底物比例为81.64％。

实施例9：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例4，区别在于，调整环糊精浓度为120g/L，加酶量控制为25U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为91.63％，占投入底物比例为82.16％。

实施例10：麦芽七糖的制备

具体实施方式同实施例8，区别在于，加酶量控制为15U/g，结果显示麦芽七糖占产物麦芽寡糖比例为92.35％，占投入底物比例为52.16％。

对比例1：麦芽七糖的制备

以Pyrococcus furiosus、Hyperthermophiles sp.、Bacillus sphaericus E-244、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus furiosus、Palaeococcus pacificus来源的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖(如表1所示)；

其中，来源于Pyrococcus furiosus的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖具体可参考文献：凡建刚,褚仲梅,张毅.Pyrococcus furiosus耐热淀粉酶工程菌的构建及直链麦芽寡糖的制备[J].工业微生物,2013,43(4):34-37以及参考文献：Cuong N P,Lee WH,Oh I N,et al.Continuous production of pure maltodextrin from cyclodextrinusing immobilized Pyrococcus furiosus thermostable amylase[J].ProcessBiochemistry,2016,51(2):282-287；

来源于Hyperthermophiles sp.的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖具体可参考文献：李晓磊,李丹,殷涌光.酶法制备直链麦芽寡糖[J].吉林大学学报(工学版),2009,39(06):1559-1562；

来源于Bacillus sphaericus E-244的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖具体可参考文献：Omguta T,Kikuchi M,Mizusawa K.Preparation and use of acyclodextrnase for preparing maltooligosaccharides[P].US Patent,5238825.1993-08-24；

来源于Pyrococcus furiosus的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖具体可参考文献：Park J T,Song H N,Jung T Y,et al.A novel domain arrangement in amonomeric cyclodextrin-hydrolyzing enzyme from the hyperthermophilePyrococcus furiosus[J].Biochimica et Biophysica Acta,2013,1834(1):380-386；

来源于Palaeococcus pacificus的环糊精酶以β-环糊精为底物制备麦芽七糖具体可参考文献：Ji H Y,Bai Y X,Li X X,et al.Preparation of malto-oligosaccharides with specific degree of polymerization by a novelcyclodextrinase from palaeococcus pacificus[J].Carbohydrate Polymers,2019,210(2019):64-72)。

由表1可知，来源于Pyrococcus furiosus、Hyperthermophiles sp.的环糊精酶，在相应的反应条件下，加入底物β-环糊精后，没有检测到麦芽七糖的生成；

其中，来源于Bacillus sphaericus E-244、Pyrococcus furiosus、Pyrococcusfuriosus的环糊精酶，仅仅在较低底物浓度的条件下，产物麦芽七糖的才有较高的浓度；

而来源于Palaeococcus pacificus的环糊精酶在于本发明相同底物浓度的条件下，其底物转化率远远低于本发明的转化率，麦芽七糖在产物当中的占比仅仅为43.36％，而采用本发明的方法，麦芽七糖占所有麦芽寡糖比例为94.55％，占投入底物的比例为82.33％。本发明的CDase在高底物浓度下的转化率和产物纯度高，分别达到82.33％和94.55％以上，可有效降低高纯度麦芽七糖的生产加工成本，具有很好的应用价值和商业开发意义。

表1不同来源的环糊精酶在相应的反应条件下的反应产物

N.D表示没有检测到产物

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种环糊精酶在制备麦芽七糖中的应用

<130> BAA200390A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1983

<212> DNA

<213> Thermococcus sp. Strain B1001

<400> 1

atgtataaaa tttttggctt taaagataat gattatctgg gtaaagtggg cattaccgaa 60

tttagcattc cgaaatcagg ctcctatgcc tatctgttag gcaattttaa tgcctttaat 120

gaaggtagct ttcgtatgcg cgaaaaaggt gatcgttggt atattaaagt ggaactgccg 180

gaaggcattt ggtattatac ctttagcgtg gatggtaatc tgattctgga ttttgaaaat 240

aatgaaaaaa ccgtgtatcg tcgtctgagc tataaatttg aaaaaaccgt taatgtggcc 300

aaaattttta gcggcgaaaa attttatcat tatccgagtc tggtgtatgc ctatagctta 360

ggcgatagta cctatattcg ctttcgcgcc atgaaaggcg ttgccaagcg tgtgtttctg 420

atttcagatc agaaatatga aatgcgcaaa aaagcccagg atgaactgtt tgaatatttt 480

gaagcagtgc tgccgcgcaa agaaggctta gaatattatt ttgaaattca tgaagcagat 540

gaaattattg attatggcga ttttaaagtt gattttaatg aacagaaaga acgctttaaa 600

ccgccggcct gggtgtttga acgggtgttt tatcagatta tgccggatcg ctttgccaat 660

ggcaatccgg aaaatgatcc gcataattgt attgaattta aaaccattac ccatcatggc 720

ggcgatctgg aaggcattat tgaaaaactg gattatattg aagaactggg cgttaatgcc 780

ctgtatctga ccccgatttt tgaatctatg acctatcatg gctatgatat tgtggattat 840

tatcatgttg cacgtaaatt tggcggtgat gaagcctttg aaaaactgat gcagaaactg 900

aaaaaacgtg atattaaact gattctggat ggcgtgtttc atcataccag cttttttcat 960

ccgtattttc aggatgtggt taaaaatggc aaaaatagca aatataaaga tttttatcgc 1020

attattagct ttccggttgt tccggaagaa ttttttgaaa ttctgaatag caaactgccg 1080

tgggatgaaa aatatcgtcg cctgaaatca ctgaaatgga attatgaatc attttatagt 1140

gtgtggctga tgccgcgcct gaatcatgat agtaaaggtg tgcgcgaatt tattcgtaat 1200

attatggaat attggattaa aaaaggtgca gatggttggc gcttagatgt tgcacatggc 1260

gttccgccgg aagtttggga agaaattcgc gaaaaactgc cgtctaatgt gtatctggtg 1320

ggcgaagtga tggatgatgc acgcctgtgg atttttaata aatttcatgg cacgatgaat 1380

tatccgctgt atgaagccat tctgcgcttt tttgtgaccc gcgaaattaa tgcagaacag 1440

tttctgaatt ggttagaact gctgagcttt tattatggtc cggccgaata tgtgatgtat 1500

aattttctgg ataatcatga tgtggatcga atgctgtcac tgctgggcga taaacgcaaa 1560

tatctgtgtg ccctggtgtt tctgtttacc tataaaggtg ttccgagcat ttattatggc 1620

aatgaaattg gcatgaaaaa tattgaagcc ccgtttatgg aacgctcacg tgcaccgatg 1680

gaatggaata aaaaaaaatg ggataaagaa attctgaaaa ccaccaaaga actgattaaa 1740

ctgcgtcgtc gctctaaagc cttacagaaa ggcattttta aacccgttaa atttaaagat 1800

aaactgttag tgtataaacg agtgctgaat aatgaaaata ttctggttgc cattaattat 1860

agcaaaaaag aaaaacatct ggatctgccg ccgagctttg aaattctgtt tcagtcaggt 1920

agctttgatc gcgttaatat tcgcctgaaa ccgtttagta gcattattgc caaaaaactg 1980

taa 1983

<210> 2

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Tyr Lys Ile Phe Gly Phe Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Gly Lys Val

1 5 10 15

Gly Ile Thr Glu Phe Ser Ile Pro Lys Ser Gly Ser Tyr Ala Tyr Leu

20 25 30

Leu Gly Asn Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Arg Glu

35 40 45

Lys Gly Asp Arg Trp Tyr Ile Lys Val Glu Leu Pro Glu Gly Ile Trp

50 55 60

Tyr Tyr Thr Phe Ser Val Asp Gly Asn Leu Ile Leu Asp Phe Glu Asn

65 70 75 80

Asn Glu Lys Thr Val Tyr Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Phe Glu Lys Thr

85 90 95

Val Asn Val Ala Lys Ile Phe Ser Gly Glu Lys Phe Tyr His Tyr Pro

100 105 110

Ser Leu Val Tyr Ala Tyr Ser Leu Gly Asp Ser Thr Tyr Ile Arg Phe

115 120 125

Arg Ala Met Lys Gly Val Ala Lys Arg Val Phe Leu Ile Ser Asp Gln

130 135 140

Lys Tyr Glu Met Arg Lys Lys Ala Gln Asp Glu Leu Phe Glu Tyr Phe

145 150 155 160

Glu Ala Val Leu Pro Arg Lys Glu Gly Leu Glu Tyr Tyr Phe Glu Ile

165 170 175

His Glu Ala Asp Glu Ile Ile Asp Tyr Gly Asp Phe Lys Val Asp Phe

180 185 190

Asn Glu Gln Lys Glu Arg Phe Lys Pro Pro Ala Trp Val Phe Glu Arg

195 200 205

Val Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Arg Phe Ala Asn Gly Asn Pro Glu

210 215 220

Asn Asp Pro His Asn Cys Ile Glu Phe Lys Thr Ile Thr His His Gly

225 230 235 240

Gly Asp Leu Glu Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Glu Glu Leu

245 250 255

Gly Val Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Glu Ser Met Thr Tyr

260 265 270

His Gly Tyr Asp Ile Val Asp Tyr Tyr His Val Ala Arg Lys Phe Gly

275 280 285

Gly Asp Glu Ala Phe Glu Lys Leu Met Gln Lys Leu Lys Lys Arg Asp

290 295 300

Ile Lys Leu Ile Leu Asp Gly Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His

305 310 315 320

Pro Tyr Phe Gln Asp Val Val Lys Asn Gly Lys Asn Ser Lys Tyr Lys

325 330 335

Asp Phe Tyr Arg Ile Ile Ser Phe Pro Val Val Pro Glu Glu Phe Phe

340 345 350

Glu Ile Leu Asn Ser Lys Leu Pro Trp Asp Glu Lys Tyr Arg Arg Leu

355 360 365

Lys Ser Leu Lys Trp Asn Tyr Glu Ser Phe Tyr Ser Val Trp Leu Met

370 375 380

Pro Arg Leu Asn His Asp Ser Lys Gly Val Arg Glu Phe Ile Arg Asn

385 390 395 400

Ile Met Glu Tyr Trp Ile Lys Lys Gly Ala Asp Gly Trp Arg Leu Asp

405 410 415

Val Ala His Gly Val Pro Pro Glu Val Trp Glu Glu Ile Arg Glu Lys

420 425 430

Leu Pro Ser Asn Val Tyr Leu Val Gly Glu Val Met Asp Asp Ala Arg

435 440 445

Leu Trp Ile Phe Asn Lys Phe His Gly Thr Met Asn Tyr Pro Leu Tyr

450 455 460

Glu Ala Ile Leu Arg Phe Phe Val Thr Arg Glu Ile Asn Ala Glu Gln

465 470 475 480

Phe Leu Asn Trp Leu Glu Leu Leu Ser Phe Tyr Tyr Gly Pro Ala Glu

485 490 495

Tyr Val Met Tyr Asn Phe Leu Asp Asn His Asp Val Asp Arg Met Leu

500 505 510

Ser Leu Leu Gly Asp Lys Arg Lys Tyr Leu Cys Ala Leu Val Phe Leu

515 520 525

Phe Thr Tyr Lys Gly Val Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Glu Ile Gly

530 535 540

Met Lys Asn Ile Glu Ala Pro Phe Met Glu Arg Ser Arg Ala Pro Met

545 550 555 560

Glu Trp Asn Lys Lys Lys Trp Asp Lys Glu Ile Leu Lys Thr Thr Lys

565 570 575

Glu Leu Ile Lys Leu Arg Arg Arg Ser Lys Ala Leu Gln Lys Gly Ile

580 585 590

Phe Lys Pro Val Lys Phe Lys Asp Lys Leu Leu Val Tyr Lys Arg Val

595 600 605

Leu Asn Asn Glu Asn Ile Leu Val Ala Ile Asn Tyr Ser Lys Lys Glu

610 615 620

Lys His Leu Asp Leu Pro Pro Ser Phe Glu Ile Leu Phe Gln Ser Gly

625 630 635 640

Ser Phe Asp Arg Val Asn Ile Arg Leu Lys Pro Phe Ser Ser Ile Ile

645 650 655

Ala Lys Lys Leu

660