阅读说明：本技术 一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺及其在畜禽抗病增产中的应用 (Fermentation process for producing antibacterial peptide bacillus subtilis and application of fermentation process in disease-resistant and yield-increasing of livestock and poultry ) 是由 汤法银 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺及其在畜禽抗病增产中的应用,包括以下步骤：1)产抗菌肽枯草芽孢杆菌种子液制备；2)发酵培养基配制；3)产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵,以生产抗菌肽；发酵过程中对发酵液进行热冲击,以降低发酵液黏度；4)对发酵液进行纯化,得到抗菌肽。本发明采用高效抗菌肽生产菌株,使用优化发酵工艺,生产具有高效价的抗菌肽产品,用于预防和治疗畜禽腹泻、实现抗病增产。(The invention relates to a fermentation process for producing antibacterial peptide bacillus subtilis and application thereof in disease-resistant and yield-increasing of livestock and poultry, comprising the following steps: 1) preparing a bacillus subtilis seed solution for producing the antibacterial peptide; 2) preparing a fermentation medium; 3) fermenting bacillus subtilis for producing the antibacterial peptide to produce the antibacterial peptide; carrying out thermal shock on the fermentation liquor in the fermentation process so as to reduce the viscosity of the fermentation liquor; 4) and purifying the fermentation liquor to obtain the antibacterial peptide. The invention adopts high-efficiency antibacterial peptide production strains, uses an optimized fermentation process to produce antibacterial peptide products with high titer, and is used for preventing and treating livestock diarrhea and realizing disease resistance and yield increase.)

一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺及其在畜禽抗病增产 中的应用

技术领域

本发明涉及一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺及其在畜禽抗病增产中的应用。

背景技术

为提高消费者对畜牧产品的信赖，我国2020年12月31日全面禁止在动物饲料中添加抗生素。2019年中国农业农村部公告第194的要求，2020年1月1日起将退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起，停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。此前已生产的商品饲料，可继续流通、销售和使用至2020年12月31日。

抗菌肽具有多种功效，可替代对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物在饲料中添加，是理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌，促生长的绿色饲料添加剂，被认为是抗生素的理想替代品。因此，本发明旨在采用高效抗菌肽生产菌株，使用优化发酵工艺，生产具有高效价的抗菌肽产品和枯草芽孢杆菌相关复合药剂。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺及其在畜禽抗病增产中的应用，具有抗病增产、防治腹泻等功能。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)产抗菌肽枯草芽孢杆菌种子液制备；

2)发酵培养基配制；

3)产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵，以生产抗菌肽；发酵过程中对发酵液进行热冲击，以降低发酵液黏度；

4)对发酵液进行纯化，得到抗菌肽。

优选的，步骤1)具体为：配制种子培养基，种子培养基组分为：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L、硫酸镁2-3g/L、蛋白胨3-10g/L，调节pH为6.4-6.6；将产抗菌肽枯草芽孢杆菌接种至种子培养基，在37℃培养9-10h，培养过程中搅拌速度为130-150r/min且持续通入空气，得到种子液；用无菌生理盐水调节种子液中的菌数为1.0～1.2×10⁸cfu/mL，得到备用种子液。

步骤2)中，发酵培养基组成为：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L、硫酸镁2-3g/L、蛋白胨3-10g/L、1-2g/L尿素、0.1-0.2g/Lα-萘乙酸钠、0.2-0.3g/L磷酸二甲酯，pH为6.4-6.6。

尿素会发生氨化作用，豆粕份、玉米淀粉与玉米浆干粉经氨化处理后孔隙率增多，其与酶的接触面积增大，有利于发酵的进行；特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，可以促使枯草芽孢杆菌增强对乙酰辅酶A的分泌，可以大幅度提高枯草芽孢杆菌三羧酸循环的速度，加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖与发酵代谢，促使枯草芽孢杆菌代谢出更多的酶与发酵底物作用，进而提高抗菌肽的产率与产量。

步骤3)具体为：将备用种子液按照12％-15％的接种比例(v/v)接种至发酵培养基，在37℃培养24-28h，培养过程中搅拌速度为155-165r/min且持续通入空气，培养过程中每隔6-8h进行一次热冲击，热冲击步骤为：使发酵液在8-12min内升温5-10℃再在8-12min内降温至37℃。

优选的，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis BF168。此外，枯草芽孢杆菌还可以为徐建等.表达猪β防御素-2和cecropin P1抗菌肽枯草芽孢杆菌的构建及特性研究(《燕山大学》2016年)所公开的菌株，也可以为其它能产生抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的另一个目的是提供前述的发酵工艺制得的抗菌肽。

本发明的又一个目的是提供一种由抗菌肽和枯草芽孢杆菌构成的复合兽用药品，所述的抗菌肽由前述的发酵工艺制得，所述的枯草芽孢杆菌可以为Bacillus subtilisBF168。采用抗菌肽与枯草芽孢杆菌的复合药品，不仅可以发挥抗菌肽的快速精准强力作用，还可以使枯草芽孢杆菌中除了抗菌肽以外的有效成分发挥作用(促进动物肠道对营养物质的消化吸收等)，枯草芽孢杆菌还可以发挥其肠道定值作用。复合药品中，抗菌肽和枯草芽孢杆菌的质量比为1:1-2。复合药品可添加到饲料中使用，复合药品的添加量是饲料的0.2-0.8％(其为质量百分比)。

本发明还提供前述的抗菌肽、前述的发酵工艺、前述的复合兽用药品在制备畜禽抗病增产用药物中的应用。

抗菌肽通过阴阳离子的物理作用结合，在抗菌肽接触到病原菌后，其N端所带正电荷与病原菌细胞膜上所带大量负电荷静电相吸，疏水性的C端柔性***病原菌细胞质膜的疏水区，在病原菌质膜上形成离子通道，造成病原菌细胞内容物逸出而死亡，具有杀菌强、杀菌快、杀菌谱广的特点。使用效果促进肠绒毛的生长，增加营养物质吸收面积，提高饲料报酬，促长效果明显。是非特异性的免疫应答产物，长期添加可提高机体免疫力，增强抗病力，且不容易产生耐药性。

相对于现有技术，本发明的有益效果：枯草芽孢杆菌在呈现弱酸性而非中性的种子培养基中培养、采用稍高的搅拌速度、特定组分和配比的种子培养基，经研究表明，可以减少培养时间，提高菌株增殖速度。发酵过程选用的接种比例相对较高、搅拌速度较高，可以提高最终得到的发酵液的抗菌肽浓度，减少发酵时间。而热冲击操作是为了防止随着发酵的持续进行发酵液黏度升高导致发酵效率降低。热冲击操作能够降低发酵液黏度、淘汰代谢能力差或不强的菌株，提高发酵效率。

本发明的抗菌肽、枯草芽孢杆菌和复合药品，用于预防和治疗动物腹泻，促进畜禽肠道消化吸收，实现畜禽抗病增产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方式作更进一步的说明。

实施例1

1)产抗菌肽枯草芽孢杆菌种子液制备：配制种子培养基，种子培养基组分为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L，调节pH为6.5；将产抗菌肽枯草芽孢杆菌接种至种子培养基，在37℃培养9h，培养过程中搅拌速度为130r/min且持续通入空气，得到种子液；用无菌生理盐水调节种子液中的菌数为1.2×10⁸cfu/mL，得到备用种子液。枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis BF168。

2)发酵培养基配制：发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L、2g/L尿素、0.2g/Lα-萘乙酸钠、0.2g/L磷酸二甲酯，pH为6.5。

3)产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵，以生产抗菌肽；发酵过程中对发酵液进行热冲击，以降低发酵液黏度。3)具体过程为：将备用种子液按照15％的接种比例(v/v)接种至发酵培养基，在37℃培养26h，培养过程中搅拌速度为155r/min且持续通入空气，培养过程中每隔8h进行一次热冲击操作，一次热冲击步骤为：使发酵液升温6℃(升温过程用时10min，升温至43℃)再立刻降温至37℃(降温过程用时10min)。

4)取发酵液，检测发酵液的抗菌肽效价；

5)对发酵液进行纯化，得到抗菌肽。纯化过程包括以下步骤：压滤，陶瓷膜过滤，双效降膜蒸发器蒸发，喷雾干燥(参见中国专利ZL2013101195182)。

实施例2

1)产抗菌肽枯草芽孢杆菌种子液制备：配制种子培养基，种子培养基组分为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L，调节pH为6.5；将产抗菌肽枯草芽孢杆菌接种至种子培养基，在37℃培养9h，培养过程中搅拌速度为130r/min且持续通入空气，得到种子液；用无菌生理盐水调节种子液中的菌数为1.2×10⁸cfu/mL，得到备用种子液。枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis BF168。

2)发酵培养基配制：发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L、2g/L尿素、0.2g/Lα-萘乙酸钠、0.2g/L磷酸二甲酯，pH为6.5。

3)产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵，以生产抗菌肽；发酵过程中对发酵液进行热冲击，以降低发酵液黏度。3)具体过程为：将备用种子液按照14％的接种比例(v/v)接种至发酵培养基，在37℃培养26h，培养过程中搅拌速度为155r/min且持续通入空气，培养过程中每隔8h进行一次热冲击操作，一次热冲击步骤为：使发酵液升温5℃(升温过程用时10min，升温至42℃)再立刻降温至37℃(降温过程用时10min)。

4)取发酵液，检测发酵液的抗菌肽效价；

5)对发酵液进行纯化，得到抗菌肽。

实施例3

1)产抗菌肽枯草芽孢杆菌种子液制备：配制种子培养基，种子培养基组分为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L，调节pH为6.5；将产抗菌肽枯草芽孢杆菌接种至种子培养基，在37℃培养9h，培养过程中搅拌速度为130r/min且持续通入空气，得到种子液；用无菌生理盐水调节种子液中的菌数为1.2×10⁸cfu/mL，得到备用种子液。枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis BF168。

2)发酵培养基配制：发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉18g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉6g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5g/L、2g/L尿素、0.2g/Lα-萘乙酸钠、0.2g/L磷酸二甲酯，pH为6.5。

3)产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵，以生产抗菌肽；发酵过程中对发酵液进行热冲击，以降低发酵液黏度。3)具体过程为：将备用种子液按照15％的接种比例(v/v)接种至发酵培养基，在37℃培养26h，培养过程中搅拌速度为165r/min且持续通入空气，培养过程中每隔8h进行一次热冲击操作，一次热冲击步骤为：使发酵液升温5℃(升温过程用时10min，升温至42℃)再立刻降温至37℃(降温过程用时10min)。

4)取发酵液，检测发酵液的抗菌肽效价；

5)对发酵液进行纯化，得到抗菌肽。

对比例1

发酵过程中不进行热冲击，其余同实施例1。

对比例2

种子液接种比例为8％，发酵液搅拌速度为140r/min，种子培养基pH为7.2，发酵培养基pH为7.0，种子培养基搅拌速度为100r/min。其余同实施例1。

表1实施例1-3、对比例1-2的发酵液的抗菌肽效价

应用例1

复合药品制备：按照抗菌肽和枯草芽孢杆菌的质量比1:2得到复合药品。其中，实施例1抗菌肽+枯草芽孢杆菌为产品1。实施例2抗菌肽+枯草芽孢杆菌为产品2。实施例3抗菌肽+枯草芽孢杆菌为产品3。对比例1抗菌肽+枯草芽孢杆菌为产品4。对比例2抗菌肽+枯草芽孢杆菌为产品5。枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis BF168。

应用例2

25日龄仔猪断奶开始，对照组饲喂日粮(即全价配合饲料)。试验组饲喂全价饲料+产品1-3中任意一种复合药品(每吨全价饲料添加复合药品2000g)，对比组饲喂全价饲料+产品4-5任意一种复合药品(每吨全价饲料添加复合药品2000g)。饲喂上述饲料至85日龄，测定仔猪生长性能。每组有10头小猪。期间让仔猪以饲养基地日常习惯进行管理。保持日常光照时间，按规定程序进行防疫及消毒，若出现病猪，统计病猪头数，并进行单独隔离饲养。具体包括对照组(全价配合饲料)，试验组1(产品1+全价配合饲料)，试验组2(产品2+全价配合饲料)，试验组3(产品3+全价配合饲料)。

仔猪患病情况：

全程试验中，仅对照组出现4头病猪(腹泻)，试验组1-3无病猪。

日增重测定：

计算60天的平均日增重，结果表明，与对照组相比，试验组1-3仔猪日增重和采食量分别提高了8.22％(P<0.05)和6.54％(P<0.05)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。