阅读说明：本技术 一种新型icr小鼠超数***方法 (Novel ICR mouse superovulation method ) 是由 淡新刚 赵洪喜 靳善来 梅山 杜旭旭 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型小白鼠超数排卵方法,通过对ICR小白鼠间隔48h两次注射15nmol人源Kisspeptin54,在注射结束后14h,小白鼠可获得16枚以上卵母细胞,远高于正常生理条件下ICR小白鼠的排卵数(初次排卵平均6～8枚/只)。同时,Kisspeptin54相比较传统激素,它是一种绿色的新型多肽激素。本发明可取代传统激素用于小鼠超数排卵,并为Kisspeptin在大动物上超排及人类辅助生殖上的应用研究奠定了良好的基础。(The invention discloses a novel mouse superovulation method, which is characterized in that 15nmol of humanized Kisspeptin54 is injected into an ICR mouse twice at intervals of 48h, and 14h after the injection is finished, the mouse can obtain more than 16 oocytes which are far higher than the ovulation number (average 6-8 oocytes per mouse in primary ovulation) of the ICR mouse under normal physiological conditions. Meanwhile, Kisspeptin54 is a green novel polypeptide hormone compared with the traditional hormone. The invention can replace the traditional hormone for mouse superovulation and lays a good foundation for the application research of Kisspeptin in superovulation on large animals and human assisted reproduction.)

一种新型ICR小鼠超数***方法

技术领域

本发明涉及超数***技术领域，具体涉及一种新型小白鼠的超数***方法。

背景技术

超数***是动物遗传工程研究获得成功的技术支持和保障，是获得大量胚胎来源从而实现胚胎移植的关键环节，是提高优秀母畜繁殖力挖掘母畜繁殖潜力的有效方法。目前，超数***仍然沿用传统的外源性激素进行处理。然而，随着人们对绿色消费的追求，传统激素在动物产品中的残留问题以及长时间、大量使用所产生的激素“脱敏问题”已日益突显，迫切需要新的绿色技术来代替传统超排技术。

Kisspeptin（KP），一种Kiss1基因的产物，目前认为，它是调控GnRH释放最重要的因子，能够间接或直接促进垂体***的释放。Kiss1基因编码145个氨基酸，在体内进一步被加工、剪切成4种不同长度的生物活性肽（Kisspeptin54、 Kisspeptin14、Kisspeptin 13、Kisspeptin10），其中Kisspeptin54活性最高。研究表明，Kisspeptin是调控下丘脑GnRH释放的主要因子，它不仅可以直接作用于下丘脑正中******，在GnRH神经突触末端促进GnRH释放，而且还可直接作用于垂体前叶刺激垂体***释放。体外注射Kisspeptin不但能够显著提高动物繁殖季节体内FSH和LH水平，而且它可使处于非繁殖季节的动物发情、***。Caraty等（2007）用Kisspeptin10连续处理乏情季节的绵羊后能使其发情并***。Redmond等（2011）使用Kisspeptin处理性成熟前的羔羊后发现，Kisspeptin能够提前激活其繁殖轴，提早进入初情期。因此，外源Kisspeptin注射能够触发动物内源性***的合成和释放，在理论上应用于动物超数***是可行的。

然而，Kisspeptin应用于动物的超数***还未见报道。因此，我们首先在ICR小鼠上对Kisspeptin应用于其超数***进行了探索，并成功获得了有别于以往的新型超数***方法。这种方法不但能够达到超数***效果，而且还有效避免了传统超排激素的弊端，是一种无污染、绿色的超排方法。新型超排方法不仅在小鼠上实现了对传统超排激素的成功取代，更重要的是它将为Kisspeptin在大动物甚至人类辅助生殖中的应用奠定良好的基础。

发明内容

本发明通过大量实验研究，探讨了用新型多肽人源Kisspeptin54代替传统激素对小鼠进行超数***的可行性，优选出Kisspeptin54应用于小鼠超排的最佳剂量，并比较了Kisspeptin54应用于小鼠超数***的不同程序，最终获得一种新型小白鼠超数***方法。

在考察了注射不同类型的Kisspeptin，发现存在不同程度促进小鼠下丘脑GnRH释放，从而提高体内***水平，激活卵巢功能。在注射Kisspeptin10中，可以促其发情并***。在注射Kisspeptin14，能够提前激活其繁殖轴，促其提早进入初情期。本发明发现注射Kisspeptin54对小鼠的超数***作用显著，而是明显高于正常生理（非超排条件下）条件下***数，并且***质量好，为动物超排甚至人类辅助生殖的深入研究开辟了新的途径。外源注射Kisspeptin54可通过直接作用于下丘脑正中***或可直接作用于垂体来间接和直接促进动物体内内源性***的释放，促进多个卵泡发育成熟、***，从而达到动物超数***的效果。因此，Kisspeptin54在应用动物超数***方面是可行的。本发明先筛选用Kisspeptin54注射代替传统超排所用激素hCG；其次，探索用一定量的Kisspeptin54对传统超排激素PMSG进行代替，并进一步明确最优的Kisspeptin54+Kisspeptin54的超排程序。本发明涉及Kisspeptin54在提高动物胚/囊胚冲胚总数、可用胚胎数、成熟卵子质量或受精后胚胎质量方面的应用。Kisspeptin54注射入小鼠后，发生超数***； Kisspeptin54代替传统超排激素PMSG和hCG。注射15noml Kisspeptin54,间隔48h后重复注射相同剂量的Kisspeptin54的超排程序。

值得注意的是，本发明是注射为Kisspeptin54+ Kisspeptin54，时间间隔48h的超排程序；注射剂量均为15noml Kisspeptin54。

本发明的超数***方法，包括以下步骤:

A)第一天，对白鼠第一次腹腔注射150μL浓度为15nmol的Kisspeptin54；

B)第三天，对白鼠第二次注射150μL浓度为15nmol的Kisspeptin54；

C)在第二次注射Kisspeptin54后14 h，无菌取出白鼠输卵管壶腹部，脱去卵丘细胞后在体式显微镜下计数第一极体排出的***数。单个白鼠***数量在17枚～30枚。本发明通过Kisspeptin54刺激丘脑和垂体，促进小鼠体内内源性***的释放，促进多个卵泡发育成熟、***。

进一步的，本发明比较了传统激素的超排效果。经筛选替代传统超排激素hCG的最佳的Kisspeptin54浓度，即PMSG+不同浓度的Kisspeptin54组合对ICR小白鼠进行超排，确定15nmol Kisspeptin54替代hCG的超排效果最好。

进一步的，筛选替代传统超排激素PMSG的最佳Kisspeptin54浓度，即不同浓度的Kisspeptin54+15nmol Kisspeptin54组合对ICR小白鼠进行超排，最终确定15nmolKisspeptin54替代PMSG的超排效果最好。

进一步的，比较采用不同超排程序的15nmolKisspeptin54+15nmol Kisspeptin54进行超排，最终确定注射15nmolKisspeptin54后间隔48h再注射相同剂量的Kisspeptin54的注射程序的超排效果最好。最终确定最佳的15nmol Kisspeptin54+15nmolKisspeptin54,间隔48h注射的小鼠超数***程序。

进一步的，通过动物实验证明，本发明方法可使动物输精后、胚/囊胚冲胚总数、可用胚胎数显著提高，可以提高成熟卵子和其受精后胚胎质量。

本发明通过大量试验验证，明确新型药品Kisspeptin54代替传统超排激素的可行性，并优选出最佳使用剂量及注射程序，最终创造出一种新型小鼠的超排方法。本发明制定了一种接近绿色的，有效的，新型超排方法。用新型多肽Kisspeptin54来代替传统激素对白鼠进行超数***。

本发明的有益效果还在于:Kisspeptin54是驱动内源性***的释放，避免了传统超排方法长时间、连续使用大剂量外源激素（比如FSH、PMSG、hCG等），所造成的激素在动物体中的大量残留。此外，Kisspeptin54直接或间接作用于下丘脑或垂体多个位点，可减少传统激素大剂量、长时间使用所导致的激素“脱敏反应”的出现，造成超排失败。使用新型超排方法每只小鼠平均可获16枚以上***，其超排数量虽低于传统激素，但远高于正常生理条件下ICR小白鼠的***数（初次***平均6～8枚/只）。因此，与相比较传统激素，Kisspeptin54它是一种新型的、绿色的小鼠超数***方法。

本发明超排效果比选过程具体见表1、表2、表3。

表1 PMSG+不同浓度的Kisspeptin54组合对ICR小白鼠进行超排的效果

注：表中同一竖行完全不同字母之间表示差异显著，p＜0.05。

优选的，替代传统超排激素PMSG的最佳Kisspeptin54浓度，即不同浓度的Kisspeptin54+15nmol Kisspeptin54组合对ICR小白鼠进行超排，具体实验数据见表2，最终确定15nmolKisspeptin54替代PMSG的超排效果最好。

表2 不同浓度Kisspeptin54+15nmol Kisspeptin54对ICR小鼠进行超排的效果

注：表中同一竖行不同字母之间表示差异显著，p＜0.05。

表3 15nmolKisspeptin54+15nmolKisspeptin54替代PMSG+hCG进行ICR小鼠最佳超排程序的筛选。

优选的，比较使用不同注射程序的15nmol Kisspeptin54+15nmol Kisspeptin54进行超排，最终确定第三种超排程序的效果最好，具体实验数据见表3。

表3 15nmolKisspeptin54+15nmolKisspeptin54替代PMSG+hCG的ICR小鼠最佳超排程序筛选。

注：表中不同字母之间表示差异显著，p＜0.05。

优选的，上述ICR小白鼠为健康的4周龄,体重在18～20g左右,在处理期间保证饮食和饮水以及室内温度。

总之，Kisspeptin54对超排程序有反应，超排程序简单，经济可行。

具体实施方式

下面结合实例对本发明提供的具体实施方法做详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

ICR小白鼠超数***

1.药品：PMSG， hCG, 人源Kisspeptin54

2.适龄健康动物的选择

ICR小白鼠选取健康4周龄,体重在18～20g左右,在处理期间保证正常的饮食和饮水以及室内温度。

3.超数***流程

第1天，对ICR小白鼠以150μL的剂量腹腔注射浓度为15nmol的Kisspeptin54。

第3天，在同一时间对ICR小白鼠再次以150μL的剂量腹腔注射浓度为15nmol的Kisspeptin54。

在第二次注射15nmol Kisspeptin54后14h，将ICR小白鼠处死，无菌取出输卵管壶腹部，在体式显微镜下，用一次性无菌1 mL注射器划破壶腹部，挤压出卵丘-***复合体，将挤压出的卵丘-***复合体置入含有300 IU/mL透明质酸酶DPBS的35mm平皿中，在37.5℃作用1～2 min，用自制的口吸管完全脱去卵丘细胞，在体式显微镜下计数第一极体排出的***数。

4.超排效果

新型超排方法每只小鼠平均可获得16枚***，虽然低于传统超排方法（PMSG+hCG，每只小鼠平均获得25枚***），但远高于正常生理条件下ICR小白鼠的***数（初次***平均6～8枚/只）。同时，Kisspeptin54相比较传统激素，它是一种绿色、驱动内源性超排激素释放的新型多肽。因此，它是一种新型、绿色的小白鼠超数***方法。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。