阅读说明：本技术 一种小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法 (Mouse in-vitro fertilization reagent, preparation method thereof and in-vitro fertilization method ) 是由 李斌 陈新 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及小鼠培育技术领域,且公开了一种小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法,包括NACL5.8～6.0g、KCL0.4～0.5g、KH2PO4 0.038～0.045g、MgSO4.7H2O 0.088～0.095g、丙酮酸钠0.03～0.04g、葡萄糖0.55～0.6g、NaCO3 2.1～2.15g、乳酸钠4.19～4.641g、CaCL2.2H2O 0.3～0.35g、BSA4～5g、牛磺酸0.30～0.312g和双抗(100x)5.4～5.6ML,还包括GlutaMAX和EDTA(5%)。该小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法,结合现有的受精试剂的基料配方,进行改进,能使小鼠的受精效率大大提高,具有很好的应用前景,解决了现有的受精试剂在应用于小鼠测验时,国内的试剂受精效率较低,会耗费大量相关试剂,而国外试剂价格较为昂贵,并不适用于对小鼠的大量培育测验的问题。(The invention relates to the technical field of mouse cultivation, and discloses a mouse in-vitro fertilization reagent, a preparation method thereof and an in-vitro fertilization method, wherein the reagent comprises 5.8-6.0 g of NACL, 0.4-0.5 g of KCL, KH2PO40.038-0.045 g of MgSO4.7H2O, 0.088-0.095 g of sodium pyruvate, 0.03-0.04 g of glucose, 0.55-0.6 g of NaCO32.1-2.15 g of sodium lactate, 4.19-4.641 g of CaCL2.2H2O, 0.3-0.35 g of BSA 4-5 g of taurine, 0.30-0.312 g of double antibody (100 x) and 5.4-5.6 ML of double antibody, and further comprises GlutaMAX and EDTA (5%). The mouse in-vitro fertilization reagent, the preparation method thereof and the in-vitro fertilization method are combined with the existing base material formula of the fertilization reagent, are improved, can greatly improve the fertilization efficiency of mice, have good application prospects, and solve the problems that when the existing fertilization reagent is applied to mouse tests, the fertilization efficiency of the domestic reagent is low, a large amount of related reagents are consumed, the price of foreign reagents is high, and the existing fertilization reagent is not suitable for a large amount of breeding tests of the mice.)

一种小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法。

背景技术

体外受精是指哺乳动物的***和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF，由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET，在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物。

目前国内外均有关于小鼠体外受精的相关试剂，在小鼠受精方面均有其成效，但国内的受精试剂在应用于小鼠身上时，其受精效率较低，会耗费大量相关试剂，而选用国外的试剂对小鼠受精，其试剂价格也非常昂贵，成本较高，并不适用于对小鼠的大量测验。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法，具备成本低而受精效果好等优点，解决了现有的受精试剂在应用于小鼠测验时，国内的试剂受精效率较低，会耗费大量相关试剂，而国外试剂价格较为昂贵，并不适用于对小鼠的大量培育测验的问题。

（二）技术方案

为实现上述成本低而受精效果好的目的，本发明提供如下技术方案：一种小鼠体外受精试剂，包括NACL5.8～6.0g、KCL0.4～0.5g、KH2PO4 0.038～0.045g、MgSO4.7H2O 0.088～0.095g、丙酮酸钠0.03～0.04g、葡萄糖0.55～0.6g、NaCO3 2.1～2.15g、乳酸钠4.19～4.641g、CaCL2.2H2O 0.3～0.35g、BSA4～5g、牛磺酸0.30～0.312g和双抗（100x）5.4～5.6ML。

优选的，还包括GlutaMAX和EDTA（5%）。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种小鼠体外受精试剂的制备方法，包括以下步骤：

1）取出1L容量的玻璃皿，称量800ML双氧水放入1L玻璃皿中，再依次称量NACL5.8～6.0g、KCL0.4～0.5g、KH2PO4 0.038～0.045g、MgSO4.7H2O 0.088～0.095g、丙酮酸钠0.03～0.04g、葡萄糖0.55～0.6g、NaCO3 2.1～2.15g、乳酸钠4.19～4.641g、CaCL2.2H2O 0.3～0.35g、BSA4～5g和牛磺酸0.30～0.312g放入玻璃皿中进行溶解；

2）再称量双抗（100x）5.4～5.6ML、GlutaMAX和EDTA（5%）依次放入玻璃皿中进行溶解，进行溶解3h后，取用0.22um滤器进行过滤，将滤后的容液放入新的玻璃皿中，即可制得HTF受精试剂，并将试剂放置于零下20℃保存。

本发明还要解决的另一技术问题是提供一种小鼠体外受精方法，包括以下步骤：

1）取用多个培养皿，在***培养皿和受精培养皿中分别滴入1个0.2ml的HTF试剂液和2个0.1ml的HTF试剂液，后用矿物油或者石蜡油封面，并将培养皿置于培养箱中培养，处于温度37℃、含有5%CO2和95%湿度下；

2）取小鼠的***放入平衡后的***培养皿中培养获能；

3）取小鼠的卵子放入平衡后的受精培养皿中，然后用微量移液器取步骤（2）中获能后的***放入受精培养皿中；

4）将受精培养皿置于37℃和含5％CO2的培养箱中培养。

优选的，***获能培养皿放入37℃和含5％CO2培养箱中培养，***获能时间为60分钟。

优选的，取卵子的方法包括以下步骤：

1）小鼠按每只5IU剂量注射PMSG和HCG先后进行超排，间隔时间为二十四小时；

2）在注射HCG后约15－17小时处死经过超数***处理的供体母鼠，用精细镊子固定住输卵管并用解剖针刺破输卵管的膨大部，带出***团至受精培养皿中。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种小鼠体外受精试剂及其受精试剂的制备方法，具备以下有益效果：

该小鼠体外受精试剂及其制备方法和体外受精方法，在制备小鼠受精试剂时，除基本配备小鼠受精试剂原料外，本发明通过加入EDTA和GlutaMAX，可在受精试剂在制备时，增强其试剂的稳定性，有益于增强其受精试剂的受精效率，结合对小鼠体外受精方法操作，使得受精试剂用于小鼠的培育成功率更高，并且该受精试剂的基料成本并不高，可使试剂能适应并用于小鼠的大量测验上。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种小鼠体外受精试剂，其特征在于，包括NACL5.8～6.0g、KCL0.4～0.5g、KH2PO40.038～0.045g、MgSO4.7H2O 0.088～0.095g、丙酮酸钠0.03～0.04g、葡萄糖0.55～0.6g、NaCO3 2.1～2.15g、乳酸钠4.19～4.641g、CaCL2.2H2O 0.3～0.35g、BSA4～5g、牛磺酸0.30～0.312g和双抗（100x）5.4～5.6ML，还包括GlutaMAX和EDTA（5%）。

一种小鼠体外受精试剂的制备方法，其特征在于，使用如权利要求1或2所述的受精试剂，包括以下步骤：

1）取出1L容量的玻璃皿，称量800ML双氧水放入1L玻璃皿中，再依次称量NACL5.8～6.0g、KCL0.4～0.5g、KH2PO4 0.038～0.045g、MgSO4.7H2O 0.088～0.095g、丙酮酸钠0.03～0.04g、葡萄糖0.55～0.6g、NaCO3 2.1～2.15g、乳酸钠4.19～4.641g、CaCL2.2H2O 0.3～0.35g、BSA4～5g和牛磺酸0.30～0.312g放入玻璃皿中进行溶解；

2）再称量双抗（100x）5.4～5.6ML、GlutaMAX 3.0～3.2ML和EDTA（5%）0.15-0.25ML依次放入玻璃皿中进行溶解，进行溶解3h后，取用0.22um滤器进行过滤，将滤后的容液放入新的玻璃皿中，即可制得HTF受精试剂，并将试剂放置于零下20℃保存。

一种小鼠体外受精方法，其特征在于，使用如权利要求3所述受精试剂，包括以下步骤：

1）取小鼠多只，按每只5IU剂量注射PMSG，第一天17:00，第三天17:00每只注射5IU的HCG，第四天9:00开始取卵；

2）取用多个培养皿，在***培养皿和受精培养皿中分别滴入1个0.2ml的HTF试剂液和2个0.1ml的HTF试剂液，后用矿物油或者石蜡油封面，并将培养皿置于培养箱培养，处于温度37℃、含有5%CO2和95%湿度下；

3）取成熟雄鼠（3－6月龄）2～3只，处死后采取其附睾尾部，尽可能地去除其周围的脂肪、血液和组织液等；将附睾尾部放在无菌过滤纸上，除净其血液和组织液，将附睾尾部移入***培养皿中，用精细镊子夹住附睾尾部，再取解剖针，交替向前挤压，挤出附睾尾部的***团，用一解剖针将挤出的***团导入到过夜的HTF培养液中，并将培养皿放入37℃、含5％CO2培养箱中培养60分钟获能；

4）在注射HCG后约15－17小时处死经过超数***处理的供体母鼠，打开腹腔，取出输卵管，尽可能的减少血液、组织液和脂肪等，将输卵管置于灭菌过滤纸上，擦去血迹和组织液等，将输卵管置于受精培养皿中，用一把精细镊子固定住输卵管，用一把解剖针刺破输卵管的膨大部，带出***团至HTF培养液中，然后用微量移液器取步骤（2）中获能后的***放入受精培养皿中；

5）将受精培养皿置于37℃,含5％CO2的培养箱中培养，受精5－6小时后，用新鲜的M2培养液清洗3次，并观察胚胎；

6）在37℃,含5％CO2的培养箱中培养18－22小时后，对***的卵进行计数，可以移植或者进行胚胎冷冻。

实施例一：一种小鼠体外受精试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取出1L容量的玻璃皿，称量800ML双氧水放入1L玻璃皿中，再依次称量NACL5.8、KCL0.4、KH2PO4 0.038、MgSO4.7H2O 0.088、丙酮酸钠0.03、葡萄糖0.55、NaCO3 2.1、乳酸钠4.19、CaCL2.2H2O 0.3、BSA4和牛磺酸0.30放入玻璃皿中进行溶解；

2）再称量双抗（100x）5.4、GlutaMAX 3.0ML和EDTA（5%）0.15ML依次放入玻璃皿中进行溶解，进行溶解3h后，取用0.22um滤器进行过滤，将滤后的容液放入新的玻璃皿中，即可制得HTF受精试剂，并将试剂放置于零下20℃保存。

按照上述配方所制得的新型受精试剂制作成本低，且因制备的配比量小，制作的速度快，提高了新型受精试剂的制备效率，有效的降低了小鼠体外受精成本。

实施例二：一种小鼠体外受精试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取出1L容量的玻璃皿，称量800ML双氧水放入1L玻璃皿中，再依次称量NACL5.9g、KCL0.45g、KH2PO4 0.021g、MgSO4.7H2O 0.0915g、丙酮酸钠0.035g、葡萄糖0.575g、NaCO32.125g、乳酸钠4.4155g、CaCL2.2H2O 0.325g、BSA4.5g和牛磺酸0.306g放入玻璃皿中进行溶解；

2）再称量双抗（100x）5.5ML、GlutaMAX3.1ML和EDTA（5%）0.2ML依次放入玻璃皿中进行溶解，进行溶解3h后，取用0.22um滤器进行过滤，将滤后的容液放入新的玻璃皿中，即可制得HTF受精试剂，并将试剂放置于零下20℃保存。

按照上述配方所制得的新型受精试剂选取的原料配比值适中，使试剂的受精效率提高，且新型受精试剂的制作成本适中，可用于小鼠的大规模培育测验。

实施例三：一种小鼠体外受精试剂的制备方法，包括以下步骤：

1）取出1L容量的玻璃皿，称量800ML双氧水放入1L玻璃皿中，再依次称量NACL6.0g、KCL0.5g、KH2PO4 0.045g、MgSO4.7H2O 0.095g、丙酮酸钠0.04g、葡萄糖0.6g、NaCO3 2.15g、乳酸钠4.641g、CaCL2.2H2O 0.35g、BSA5g和牛磺酸0.312g放入玻璃皿中进行溶解；

2）再称量双抗（100x）5.6ML、GlutaMAX 3.2ML和EDTA（5%）0.25ML依次放入玻璃皿中进行溶解，进行溶解3h后，取用0.22um滤器进行过滤，将滤后的容液放入新的玻璃皿中，即可制得HTF受精试剂，并将试剂放置于零下20℃保存。

按照上述配方所制得的新型受精试剂的性能和质量非常优异，受精效果较好，适用于小鼠的高质量培育测验，提高了企业的竞争力。

本发明的有益效果是：在制备小鼠受精试剂时，除基本配备小鼠受精试剂原料外，本发明通过加入EDTA和GlutaMAX，可在受精试剂在制备时，增强其试剂的稳定性，有益于增强其受精试剂的受精效率，结合对小鼠体外受精方法操作，使得受精试剂用于小鼠的培育成功率更高，并且该受精试剂的基料成本并不高，可使试剂能适应并用于小鼠的大量测验上。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。