一种茶叶细胞水的制备方法和得到的茶叶细胞水的应用
阅读说明：本技术 一种茶叶细胞水的制备方法和得到的茶叶细胞水的应用 (Preparation method of tea cell water and application of obtained tea cell water ) 是由 伍宇飞 李佩晶 龙智 艾艳 许显 张兵 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种茶叶细胞水的制备方法,采用低温真空提取技术与酶解技术相结合,不需要添加任何溶剂,在较低的温度(30℃-65℃)下能得到纯天然的茶叶细胞水。通过本发明方法得到的茶叶细胞水品质高,含有50多种易挥发活性成分,澄清透明、茶香味浓郁。对人体安全性高,同时具有一定的抑菌效果。可作为绿色天然的原料应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。(The invention discloses a preparation method of tea cell water, which combines a low-temperature vacuum extraction technology with an enzymolysis technology, does not need to add any solvent, and can obtain pure natural tea cell water at a lower temperature (30-65 ℃). The tea cell water obtained by the method has high quality, contains more than 50 volatile active ingredients, is clear and transparent, and has aromatic tea flavor. Has high safety to human body and certain bacteriostatic effect. Can be used as green natural raw material in the fields of food, health product, medicine and cosmetic.)
技术领域
本发明涉及农产品处理技术领域，具体涉及一种茶叶细胞水的制备方法和得到的茶叶细胞水的应用。
背景技术
茶，(学名：Camellia sinensis(L.)O.Ktze.)，灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形，先端钝或尖锐，基部楔形，上面发亮，下面无毛或初时有柔毛，边缘有锯齿，叶柄无毛。花白色，花柄有时稍长；萼片阔卵形至圆形，无毛，宿存；花瓣阔卵形，基部略连合，背面无毛，有时有短柔毛；子房密生白毛；花柱无毛。蒴果3球形或1-2球形，高1.1-1.5厘米，每球有种子1-2粒。花期10月至翌年2月。野生种遍见于中国长江以南各省的山区，为小乔木状，叶片较大，常超过10厘米长，长期以来，经广泛栽培，毛被及叶型变化很大。茶叶可作饮品，含有多种有益成分。
至今没有茶叶细胞水的提取的报道。类似的，可以参考现有技术的制备方法。如中国专利申请号CN 106562908A公开了一种玫瑰花细胞水的提取方法，具体是将玫瑰花在旋转蒸发仪中在58℃-62℃的条件、0.08Mpa-0.10Mpa的条件下旋转干馏，玫瑰花中渗透出的细胞液一部分会蒸发出来被冷凝收集一部分保留在旋转蒸发瓶中需要过滤出来；重复上述步骤3次，收集全部的细胞水，得到干花。该方法有两个缺陷：1、旋转蒸发仪的冷凝系统即使是通过改造，回收低沸点组分的效率也是很低的，得到的玫瑰花细胞液中芳香味不足；2、操作复杂，提取量太少，不能得到玫瑰花精油，不适合工业化生产。
酶解法也常用于植物细胞液的提取中。中国专利申请CN109730948A公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解再旋蒸得到细胞水3。将榨汁、细胞水1/2混合后得到高收率牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味！后期生产也无法控制品质。
发明内容
本发明的目的在于，克服上述技术缺陷，提供一种茶叶细胞水的提取方法，得到的茶叶细胞水具有50多种挥发性活性成分，茶香味浓郁，性状为无色透明液体。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种茶叶细胞水的制备方法，包括以下步骤：不加入溶剂，将茶叶在30℃-65℃、压力-60kPa～-101kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1-2.5小时，得到初提细胞水和初提残渣；在初提细胞水中加入初始茶叶总质量为基准的0.2-0.4％的纤维素酶和0-0.1％果胶酶，再将初提细胞水加入初提残渣中，在30℃-55℃、压力-70kPa～-101kPa条件下再次提取，4-7小时提取结束，收集得到茶叶细胞水。
初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，提取出的茶叶细胞水过少，加入酶后细胞水很难湿润茶叶表面，导致酶解不能正常进行。如果初步提取时间过长，细胞水流出过多，降低了后续提取效率，也增加了酶解时间带来过度酶解的风险。本发明通过在初提细胞水中加入一定量的酶，再次投入容器中对茶叶残渣进行提取，具有如下有益优点。第一、初提细胞水表面张力低，渗透性好；第二、初提细胞水pH为3-7，无需额外调节pH，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温真空技术。通过四种效应的协同，能够在较低温度(30-55℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中的前1小时左右会蒸除掉倒回容器内的初提细胞水，加快酶解速度，缩短酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，少了会缩短酶解时间)，也避免了传统酶解法需要加入大量的水稀释细胞液以及酶解过度带来的刺激气味。
关于初提液体的渗透性，通过实验发现，相比采用纯水作为溶剂，茶叶细胞水作为溶剂提取茶叶残渣时能够多提取出40％以上的黄酮和多糖等活性成分。
优选的，所述的初提阶段的温度为45℃-60℃，压力为-80kPa～-101kPa。
优选的温度与压力，能够加快细胞水的渗出以及蒸发，降低提取时间。
优选的，再次提取时间为4小时-5.5小时，条件为40℃-50℃、压力-90kPa～-101kPa条件。当然，再次提取时间越长，收集得到的细胞水越多。但是，按照本发明工艺，再次提取时间超过6小时后，提取效率降低。
在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1-150转/分钟。搅拌能够提升茶叶的暴露率，进而提升负压对于茶叶表面细胞的作用。
收集过程中进行冷凝，温度为-10℃～8℃。
优选的，茶叶是新鲜无霉变的老叶。老叶并非为嫩芽(嫩芽是清晨刚长出来的嫩叶，为绿色，透光率高)。一般的，老叶的生长时间为5天以上，颜色较深，透光率较低。老叶中含有的易挥发活性成分较嫩叶要多。
上述的茶叶细胞水应用，用于护肤品、食品、保健品等。通过本发明方法得到的茶叶细胞水，品质高，适用于食品、化妆品技术领域，特别是保健品等领域。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明先通过低温真空提取技术，先提取一定量的细胞液，然后利用初提细胞液的高渗透性，加入一定量酶后再次提取茶叶残渣。能够加速细胞水的提取效率，避免了传统酶解法带来的酶解过度问题，相比于单一的低温真空提取技术能够得到更多的活性成分以及更多的细胞液。通过本发明得到的茶叶细胞水，细胞水澄清透明、茶香味浓郁(50多种活性成分)，具有抗炎的功效。
附图说明
图1：实施例1茶叶细胞水安全性测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例和对比例所用茶叶为洗净甩干后表面无明显水渍的新鲜无霉变老叶。
实施例1：不加入溶剂，将50kg茶叶在50℃、压力-85kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5小时，得到初提细胞水和初提茶叶残渣；在初提细胞水中加入100g纤维素酶和20g果胶酶，再将初提细胞水加入初提茶叶残渣中，在50℃、压力-81kPa条件下再次提取，6小时提取结束，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，收集得到35.5kg茶叶细胞水，茶香味浓郁，细胞液澄清透明。
实施例2：不加入溶剂，将50kg茶叶在65℃、压力-70kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5小时，得到初提细胞水和初提茶叶残渣；在初提细胞水中加入100g纤维素酶和20g果胶酶，再将初提细胞水加入初提茶叶残渣中，在50℃、压力-81kPa条件下再次提取，6小时提取结束，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，收集得到35.2kg茶叶细胞水，茶香味浓郁，细胞液澄清透明。
实施例3：不加入溶剂，将50kg茶叶在40℃、压力-85kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5小时，得到初提细胞水和初提茶叶残渣；在初提细胞水中加入100g纤维素酶和20g果胶酶，再将初提细胞水加入初提茶叶残渣中，在50℃、压力-81kPa条件下再次提取，6小时提取结束，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，收集得到34.8kg茶叶细胞水，茶香味浓郁，细胞液澄清透明。
实施例4：不加入溶剂，将50kg茶叶在50℃、压力-85kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5小时，得到初提细胞水和初提茶叶残渣；在初提细胞水中加入100g纤维素酶和20g果胶酶，再将初提细胞水加入初提茶叶残渣中，在50℃、压力-100kPa条件下再次提取，5.5小时提取结束，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，收集得到35.8kg茶叶细胞水，茶香味浓郁，细胞液澄清透明。
实施例5：不加入溶剂，将50kg茶叶在50℃、压力-85kPa下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2.5小时，得到初提细胞水和初提茶叶残渣；在初提细胞水中加入130g纤维素酶和40g果胶酶，再将初提细胞水加入初提茶叶残渣中，在45℃、压力-90kPa条件下再次提取，5小时提取结束，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，收集得到36.1kg茶叶细胞水，茶香味浓郁，细胞液澄清透明。
对比例1：将50kg茶叶投入容器中，不加入任何溶剂，在55℃、-80kPa下提取，细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，提取6小时，得到茶叶细胞水。细胞水33.4kg，澄清透明，茶香但不够浓郁。
对比例2：将50kg茶叶投入容器中，与5kg水、200g纤维素酶和50g果胶酶混合后在50℃搅拌45分钟，后在50℃、压力-90kPa下提取，茶叶细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，全程搅拌为60转/分，冷凝温度-8℃，提取6小时，收集得到40.5kg茶叶细胞水(细胞液中有5kg水)，液体浅色透明，茶香味浓郁但有异味。
对比例3：将50kg茶叶投入容器中，与5kg水、200g纤维素酶和80g果胶酶混合后在60℃下提取，全程搅拌为60转/分，提取8小时，过滤(双重过滤：先离心机过滤，再采用0.22um滤膜过滤)后收集得到41.9kg茶叶细胞水(细胞液中含有5kg水)，液体颜色较深并且有细小悬浮物，异味重。
对比例4：将50kg茶叶投入容器中，不加入任何溶剂，在50℃、-90kPa条件下初步提取，茶叶细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，提取0.5小时，得到初提液体和初提茶叶残渣；在初提液体中加入100g纤维素酶和50g果胶酶，再将初提液体加入初提茶叶残渣中，在40℃、压力-90kPa条件下再次提取，5.5小时提取结束，全程搅拌60转/分，冷凝温度为-8℃，收集得到35.1kg茶叶细胞水，澄清透明，但是茶香味不够浓郁。
实施例和对比例工艺结果分析：
由对比例1可知，仅采用低温真空提取技术，提取到的细胞液重量低，而且成分较少，气味不够浓郁。由对比例2可知，先加入一定量的酶与水先进行酶解再采用真空提取技术提取，但是由于水的渗透性差，并且额外加入了5kg的水，导致了得到的细胞水浓度低、气味清淡等缺陷。由对比例3可知，由现有技术的酶提取法，得到的茶叶细胞水中含有大量的多糖和黄酮以及其它有色杂质，含有较重的异味，同时由于额外加入了5kg水倒在细胞液浓度低，价值不高。由对比例4可知，由于初提时间过短导致初提细胞液少，再倒回容器能再次提取时不到30分钟初提细胞水全部蒸发，导致酶解程度过低，相对于实施例1提取的细胞水收率不高，并且其气味不够浓郁，与对比例1得到的茶叶细胞水气味相近。
表1：实施例和对比例所提取茶叶细胞液检测结果
续表1：
各项测试方法
(1)采用实施例1中的茶叶细胞水，采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用仪在80℃下进行顶空气质检测，分析水中挥发性的物质。
1.仪器信息：
Agilent 7980A GC；
MS:5975C；
50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头，美国SUPELCO公司。
2.GC-MS条件：
色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱子(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速1mL/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
质谱条件：EI电离源，能量70eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
3.样品前处理：
将5mL样品、1g NaCl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
表2：实施例1茶叶细胞水活性成分分析结果(一些含量和匹配度都较低的物质不列举)
(2)茶叶细胞水安全性测试
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，对HaCaT细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取OD值，通过OD值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况。说明书附图1显示了实施例1茶叶细胞水的安全性测试结果。
(3)茶叶细胞水功效性测试
抗炎效果评价：
脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，它可以激活巨噬细胞释放多种炎性细胞因子，因此利用脂多糖(LPS)刺激小鼠单核-巨噬细胞建立体外炎症反应模型，样品进行干预，以及采用地塞米松为阳性对照，采用酶联免疫法(ELISA)测定炎症因子IL-6和TNF-α的水平变化，从而探讨样品的体外抗炎作用及抗炎机制。将实施例1-3和对比例1-3中得到的精华液作为样品进行测试，测试结果见表1，其中，空白为未使用精华液的测试结果。
表1
精华液
IL-6(pg/mL)
TNF-α(pg/mL)
实施例1
35
150
实施例2
34
155
实施例3
32
160
实施例4
33
157
实施例5
34
153
对比例1
42
192
对比例2
41
195
对比例3
43
198
对比例4
42
193
空白
25
150
LPS刺激
50
260
地塞米松
45
206
通过表1中的数据可以看出，细胞经LPS刺激物作用后，炎症因子IL-6和TNF-α分泌明显升高，本发明提供的精华液作用后，可降低炎症因子IL-6和TNF-α的分泌量的下降程度明显大于地塞米松，而对比例中的精华液作用后，其效果仅与阳性对照相当或者不如阳性对照，表明本发明提供茶叶细胞水，可以提高精华液的抗炎效果。
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