阅读说明：本技术 类胶原融合蛋白组合物及制备方法 (Collagen-like fusion protein composition and preparation method thereof ) 是由 许洋 李慧 潘仁杰 司武阳 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及类胶原融合蛋白组合物,类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元,基础结构和活性单元,符合结构通式nR<Sub>1</Sub>-Cg<Sub>1</Sub>-mR<Sub>2</Sub>,其中,R<Sub>1</Sub>为结构单元,R<Sub>2</Sub>为活性单元,Cg<Sub>1</Sub>为为基础结构,m和n均为0-5的自然数；其中,R<Sub>1</Sub>和R<Sub>2</Sub>均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；这种类胶原融合蛋白能够用于医学美容材料,软骨重建材料,辐射防护材料或皮肤创面修复材料。本发明的有益效果是：类胶原融合蛋白序列中的弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外,在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用,便于各个基本结构表现出独立的生物活性；增加类胶原融合蛋白的稳定性,也能够提高蛋白活性。(The invention relates to a collagen-like fusion protein composition, wherein the collagen-like fusion protein comprises a structural unit, a basic structure and an active unit which are sequentially connected and conform to a structural general formula nR 1 ‑Cg 1 ‑mR 2 Wherein R is 1 Is a structural unit, R 2 Is an active unit, Cg 1 M and n are both natural numbers of 0-5 for the basic structure; wherein，R 1 And R 2 A composition that is elastin E and a functional protein; the collagen fusion protein can be used for medical beauty materials, cartilage reconstruction materials, radiation protection materials or skin wound repair materials. The invention has the beneficial effects that: the elastin structure in the collagen-like fusion protein sequence can generate net-shaped cross-linking to form a stable mechanical structure in biological function, and can play a role of flexible linkage in the structure of the fusion protein, so that each basic structure can show independent biological activity conveniently; the stability of the collagen-like fusion protein is increased, and the protein activity can also be improved.)

类胶原融合蛋白组合物及制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学及转化医学领域，尤其是涉及类胶原融合蛋白组合物。

背景技术

胶原蛋白是生物高分子，动物***中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白种类较多，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。其中以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白应用较为广泛。胶原蛋白在机体内的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能、修复肌体损伤等方面。胶原蛋白无论是作为修复的生物支架材料、还是保护剂方面相对于其它高分子材料，具有较强的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业。

目前规模化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物***，但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险。伴随基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功的解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。如专利201210482543.2公布了一种II、III型胶原蛋白的融合性重组蛋白；西安巨子生物基因技术股份有限公司公布了重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，对重组胶原蛋白进一步进行结构修饰，便于进一步提高产品的使用场景。江苏悦智生物医药有限公司公布的专利201910088754.X，涉及重组人源III型胶原蛋白a1链及其应用。纵观这些专利所涉及的胶原蛋白，均为单体式设计，未能考虑分析医学美容整形、软骨修复、辐射防护及慢性创面等方面，对不同类型胶原蛋白的需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供类胶原融合蛋白组合物。

本发明采用的技术方案是：类胶原融合蛋白组合物，类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合式1结构通式；

nR₁-Cg₁-mR₂ 式1；

其中，R₁为结构单元，R₂为活性单元，Cg₁为为基础结构，Cg₁为I型胶原蛋白的截短型蛋白序列，序列如SEQ No：1所示，m和n均为0-5的自然数。

优选地，R₁和R₂均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；

E序列如SEQ No：4所示。

优选地，R₁为Cg₂-E或Cg₃-E；

Cg₂和Cg₃分别为II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，Cg₂序列如SEQNo：2所示，Cg₃序列如SEQ No：3所示。

优选地，R₂为E-Cg₂、E-Cg₃、E-SOD和E-EGF中的一种；

Cg₂和Cg₃分别为II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，Cg₂序列如SEQNo：2所示，Cg₃序列如SEQ No：3所示；

SOD为超氧化物歧化酶截短型蛋白序列，序列如SEQ No：5所示；

EGF为表皮细胞因子截短型蛋白序列，序列如SEQ No：6所示。

类胶原融合蛋白组合物的制备方法，通过序列拼接技术生成类胶原融合蛋白序列，定向***到原核表达载体中，经表达纯化后得到类胶原融合蛋白。

类胶原融合蛋白组合物在医学修补材料中的应用。

一种类胶原融合蛋白组合物在医学美容材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式2所示，

m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-Cg₃) 式2；

其中m：n为2：1；

优选地，m为2，n为1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：7所示。

一种类胶原融合蛋白组合物在软骨重建材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式3所示，

m(Cg₂-E)-Cg₁-n(E-Cg₂) 式3；

其中，m：n为1：1；

优选地，m为3，n为3，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：8所示。

一种类胶原融合蛋白组合物在辐射防护材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式4所示，

m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-SOD) 式4；

其中，m：n为3：1；

优选地，m为3，n为:1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：9所示。

一种类胶原融合蛋白组合物在皮肤创面修复材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式5所示，

m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-EGF) 式5；

其中，m：n为3：1；

优选地，m为3，n为:1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：10所示。

本发明具有的优点和积极效果是：类胶原融合蛋白序列中的弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外，在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用，便于各个基本结构表现出独立的生物活性；增加类胶原融合蛋白的稳定性，也能够提高蛋白活性。

附图说明

图1重组人源类胶原融合蛋白A型质粒；

图2重组人源类胶原融合蛋白B型质粒；

图3重组人源类胶原融合蛋白C型质粒；

图4重组人源类胶原融合蛋白D型质粒。

具体实施方式

本发明根据胶原蛋白在各个领域的需求，模拟人体组织结构中各类胶原的组成方式，重新分析设计一组人源类胶原融合蛋白组合物。类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合式1结构通式；

nR₁-Cg₁-mR₂ 式1；

其中，R₁为结构单元，R₂为活性单元，Cg₁为为基础结构，m和n均为0-5的自然数；

其中，R₁和R₂均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；E为弹性蛋白(Elastin，以下简称E)的活性结构单元；弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外，在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用，便于各个基本结构表现出独立的生物活性；

其中，R₁为Cg₂-E或Cg₃-E；R₂为E-Cg₂、E-Cg₃、E-SOD和E-EGF中的一种；Cg₁、Cg₂和Cg₃分别为I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，序列如SEQ No：1、SEQ No：2和SEQ No：3所示；SOD为超氧化物歧化酶截短型蛋白序列，EGF为表皮细胞因子截短型蛋白序列，序列分别如SEQ No：5和SEQ No：6所示；弹性蛋白E序列如SEQ No：4所示。R1也可以为弹性蛋白E与具有其他功能的蛋白的组合物，例如E-FGF，FGF为成纤维细胞生长因子截短型蛋白序列。本发明所涉及的结构组成单元均为根据GeneBank中的人源蛋白序列以及Swiss-Prot进行蛋白结构及功能分析获得。

SEQ No.1:pro-SEQ Cg1

GEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKP

SEQ No.2:pro-SEQ Cg2

GPPGPACGGG

SEQ No.3:pro-SEQ Cg3

GERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAP

SEQ No.4:pro-SEQ E

VPGVG

SEQ No.5:pro-SEQ SOD

KHSLPDLPYDYGALEPHINAQIMQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQTALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTER

SEQ No.6:pro-SEQ EGF

NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR

本发明某些实施例中，类胶原融合蛋白根据预期用途可以分为用于医学美容材料A型、软骨重建材料B型、辐射防护材料C型和皮肤创面修复材料D型。

本发明某些实施例中，根据医学美容及愈伤组织中的各类型胶原蛋白的分布及功能需求设计A型胶原融合蛋白，具体由I型胶原蛋白(collagen I，简称Cg₁)、III型胶原蛋白(collagen III，简称Cg₃)、弹性蛋白(Elastin，以下简称E)功能单元组成，A型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-CG₃)，其中m、n为自然数0-5，根据皮肤结构中I、III型的蛋白比例，令m：n为2：1，进一步的，m为2，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.7所示。

SEQ No.7：pro-A

GERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAPVPGVGGERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAPVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGGERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAP

本发明某些实施例中，根据据软骨重建过程中需要软骨细胞的诱导及传导的需求，生物支架应满足软骨细胞分化及基础力学作用，设计软骨重建类B型胶原融合蛋白由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白(collagen II，简称Cg₂)的功能单元组成，B型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg₂-E)-Cg₁-n(E-CG₂)，其中m、n为自然数0-5，根据软骨重建过程中结构中I、II型胶原蛋白的需求，令m：n为1：1，进一步的，m为3，n为3，具体蛋白序列如SEQ No8所示。

SEQ No8：pro-B

GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGG

本发明某些实施例中，根据放射线对皮肤及黏膜的损伤的发生机制及组织修复方式，设计能够用于辐射防护材料的C型胶原融合蛋白，具体由III型胶原蛋白、I型胶原蛋白、弹性蛋白E以及超氧化物歧化酶(SOD)功能单元组成，C型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-SOD)，其中m、n为自然数0-5，根据辐射防护及放射性创面的愈合机制，令m：n为3：1，进一步的，m为3，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.9所示。

SEQ No.9：pro-C

GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGKHSLPDLPYDYGALEPHINAQIMQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQTALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTER

本发明某些实施例中，根据难愈合创面发生机制及组织修复方式，设计能够用于皮肤创面修复材料的D型胶原融合蛋白，具体为由III型胶原蛋白、I型胶原蛋白、弹性蛋白E以及表皮细胞因子(EGF)功能单元组成，D型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg₃-E)-Cg₁-n(E-EGF)，其中m、n为自然数0-5，令m：n为3：1，进一步的，m为3，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.10所示。

SEQ No.10：pro-D

GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR

上述类胶原融合蛋白组合物的制备方法，经过原核表达细胞密码子优化后，通过序列拼接技术生成类胶原融合蛋白序列，定向***到原核表达载体pET28a中，转入大肠杆菌中经表达纯化后，得到类胶原融合蛋白。

下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：类胶原融合蛋白编码基因的合成

A型类胶原融合蛋白结构为序列为2(Cg₃-E)-Cg₁-(E-3Cg₃)，蛋白序列为SEQ No.8；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.11所示；

SEQ No.11：DNA-A

ATGGGTGAACGTGGTGCCCCTGGTTTTCGTGGTCCTGCTGGTCCGAATGGTCTGCCGGGTGAAAAAGGCCCGGCTGGTGAACGTGGTGCTCCAGTTCCAGGTGTTGGTGGCGAACGTGGTGCTCCTGGCTTTCGTGGTCCAGCAGGTCCTAACGGCCTGCCAGGTGAAAAAGGCCCAGCAGGTGAACGTGGTGCACCAGTACCTGGCGTAGGCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGTAAACCGGGTTCTCCAGGTCCAGCTGGTTCCAACGGTGAACCAGGTCCGGCTGGTTCCCCTGGTGAGAAGGGTTCTCAGGGTTCTAACGGTAACCCGGGTCCTGCCGGTAATCAGGGTCAACCAGGCAACAAAGGTTCCCCTGGTAACCCGGGTAAACCGGGTGAACCTGGCTCTAATGGTCCGCAGGGTGAACCGGGTAGCCAAGGTAACCCAGGTAAAAACGGTCAACCTGGTTCTCCAGGCAGCCAGGGTTCTCCAGGTAACCAGGGTCAGCCGGGTAAACCTGGTCAGCCGGGTGAACAAGGTTCCCCAGGCAATCAAGGCCCTGCCGGTAACGAAGGTCCTAAGGGTCAACCGGGTCAGAACGGTAAACCGGTTCCGGGTGTTGGTGGTGAACGTGGCGCACCAGGTTTTCGTGGTCCTGCTGGTCCGAATGGTCTGCCTGGTGAAAAAGGTCCAGCGGGCGAACGTGGCGCTCCTTAA

B型类胶原融合蛋白结构为3(Cg₂-E)-Cg₁-3(E-3Cg₂)，蛋白序列为SEQ No.9；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ No.12；

SEQ No.12：DNA-B

ATGGGTCCACCAGGTCCGTGTTGCGGTGGTGGTGTTCCAGGTGTAGGTGGTCCTCCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTTCCAGGTGTTGGCGGTCCTCCAGGCCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCGGGTGTCGGTGGTGAACCAGGTAACCCGGGTAAACCGGGTTCTCCAGGTCCGGCAGGTTCTAATGGTGAACCTGGTCCAGCAGGTTCTCCGGGTGAAAAAGGCAGCCAGGGTTCCAACGGCAATCCTGGCCCGGCTGGTAACCAAGGTCAGCCTGGTAATAAAGGTTCTCCAGGTAACCCGGGTAAGCCGGGTGAACCGGGTTCTAACGGTCCGCAAGGTGAACCGGGTTCTCAGGGTAATCCAGGCAAAAACGGCCAACCTGGTTCTCCAGGTTCCCAGGGTTCTCCGGGTAACCAGGGCCAACCTGGTAAACCAGGCCAGCCAGGTGAACAAGGTTCTCCTGGCAATCAAGGTCCAGCCGGTAACGAAGGTCCTAAAGGCCAGCCGGGTCAGAACGGTAAACCGGTTCCAGGTGTAGGCGGTCCTCCAGGTCCATGTTGCGGTGGTGGTGTACCGGGTGTGGGTGGTCCACCAGGTCCATGTTGTGGTGGTGGTGTACCAGGTGTAGGTGGTCCGCCTGGTCCATGCTGTGGTGGTGGTTAA

C型胶原融合蛋白结构为3(Cg₃-E)-Cg₁-(E-SOD)，蛋白结构为SEQ No.10；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.13；

SEQ No.13：DNA-C

ATGGGTCCACCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCTGGTGTAGGTGGTCCGCCAGGTCCATGTTGTGGTGGCGGTGTACCAGGTGTTGGTGGCCCTCCAGGTCCATGTTGTGGCGGTGGTGTCCCGGGTGTAGGTGGTGAACCAGGTAACCCAGGTAAACCGGGTTCTCCGGGCCCAGCAGGTTCTAACGGTGAACCGGGTCCAGCAGGTTCTCCGGGTGAAAAAGGTTCTCAGGGTAGCAATGGTAACCCGGGTCCGGCTGGTAATCAAGGTCAGCCTGGTAACAAAGGCAGCCCAGGCAACCCTGGTAAACCGGGTGAACCGGGTTCTAACGGTCCGCAGGGTGAACCGGGTTCTCAGGGTAACCCGGGCAAAAACGGTCAGCCGGGCTCTCCTGGTTCTCAAGGCTCCCCTGGCAACCAGGGTCAACCTGGTAAACCGGGTCAGCCTGGTGAACAAGGTAGCCCAGGTAACCAGGGTCCGGCTGGTAACGAAGGTCCGAAAGGCCAGCCTGGCCAGAACGGTAAACCGGTACCGGGTGTAGGTAAACATAGCCTGCCTGACCTGCCATACGATTACGGCGCTCTGGAACCGCACATTAACGCACAGATTATGCAGCTGCACCACTCTAAACATCACGCTGCTTACGTTAATAACCTGAACGTCACTGAAGAGAAATATCAGGAAGCTCTGGCTAAAGGTGACGTTACTGCGCAGACTGCACTGCAGCCAGCCCTGAAATTCAATGGTGGTGGTCACATTAATCACAGCATCTTCTGGACCAACCTGAGCCCAAACGGTGGTGGCGAACCGAAAGGCGAACTGCTGGAGGCTATCAAACGTGACTTCGGCAGCTTTGACAAATTTAAAGAAAAACTGACTGCAGCGTCCGTAGGTGTTCAAGGTTCTGGCTGGGGTTGGCTGGGTTTCAACAAAGAACGTGGTCACCTGCAGATCGCTGCATGCCCGAACCAGGACCCTCTGCAGGGTACCACCGGTCTGATCCCGCTGCTGGGTATTGATGTTTGGGAACACGCCTACTACCTGCAATATAAAAACGTTCGCCCGGACTACCTGAAAGCAATTTGGAACGTTATCAACTGGGAAAATGTCACTGAGCGTTAA

D型胶原融合蛋白结构为3(Cg₃-E)-Cg₁-(E-EGF)，蛋白结构为SEQ No.11；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.14。

SEQ No.14：DNA-D

ATGGGTCCACCTGGTCCTTGTTGCGGTGGTGGTGTACCTGGTGTAGGTGGTCCACCGGGCCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCAGGCGTTGGTGGTCCGCCAGGTCCATGTTGTGGTGGTGGTGTGCCGGGTGTTGGCGGTGAACCAGGTAACCCTGGTAAACCAGGCTCTCCAGGTCCTGCGGGTTCTAACGGTGAACCAGGTCCGGCAGGTTCTCCGGGTGAGAAAGGTAGCCAGGGCTCCAATGGTAACCCTGGCCCGGCAGGTAATCAAGGTCAGCCTGGTAATAAAGGTTCTCCGGGTAATCCAGGTAAACCTGGTGAACCGGGCTCTAATGGTCCTCAAGGTGAACCTGGTTCCCAAGGCAACCCGGGTAAAAACGGCCAGCCAGGTTCCCCGGGTTCTCAAGGTTCTCCGGGTAACCAGGGCCAACCGGGTAAACCAGGCCAACCAGGTGAACAGGGTAGCCCGGGTAACCAGGGTCCAGCTGGTAACGAAGGTCCGAAAGGCCAGCCGGGTCAAAACGGTAAACCGGTTCCGGGTGTGGGCAACTCCGACTCTGAGTGTCCGCTGTCTCACGACGGCTACTGCCTGCACGATGGCGTGTGCATGTACATCGAAGCACTGGACAAATACGCGTGCAACTGTGTGGTTGGTTACATCGGCGAACGCTGTCAGTACCGTGACCTGAAGTGGTGGGAGCTGCGC

依据上述基因序列信息，分别合成A、B、C、D型类胶原融合蛋白基因片段。

实施例2：类胶原融合蛋白表达纯化

将上述A、B、C、D型类胶原融合蛋白基因片段***pET28a载体，分别形成pET28a-A、pET28a-B、pET28a-C、pET28a-D表达质粒，质粒图谱如图1-4所示，转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中。经PCR验证后，选取成功转化的菌株作为基因工程菌保藏并标记。

分别挑取转化后的基因工程菌，接种至10mL含有20-100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，30-37℃培养至OD600达到0.4-0.7。按1％-5％接种量接种至100-300mL含有20-100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，30-37℃培养至OD600达到0.4-0.7后，加入IPTG使其终浓度为0.1-0.8mM，调整培养温度为15-28℃，继续培养8-12h。

培养完成后，在4℃，12,000rpm条件下，离心30min收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤1-2次。用破菌缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)按1:5-1:10的比例重悬菌体，并在800-1,200bar压力下通过细胞破碎机破菌1-3次，在4℃，10,000rpm条件下分别离心收集上清，此时上清中含有大量的重组蛋白。

因纯化的蛋白含有His标签，纯化柱采用镍离子亲和柱(Ni-NTA，His-Bind Resin)柱材，用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后将柱材和重组蛋白上清液的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用PBS缓冲液平衡，再用含有15-20mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白；在柱上加入适量具有His标签的凝血酶，于室温或冰上轻摇2h，再用PBS缓冲液洗脱即可获得A、B、C、D型类胶原融合蛋白，经冻干后冷冻保存。

实施例3：A型类胶原融合蛋白的应用

修复液体：由重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)、海藻糖3％、甘油5％、透明质酸钠(0.1％)、50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.8)组成，经过滤后，无菌分装。

修复软膏：由重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)及软膏基质组成。其中软膏基质由硬脂酸(3％)、硬脂酸甘油酯(1％)、液体石蜡(5.5％)、小分子硅酮(1.5％)、角鲨烷(2.5％)、三乙醇胺(0.45)、尿囊素(0.1％)、纯化水组成。软膏基质经乳化混匀后，降温至45℃。添加重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)继续搅拌至完全均一。

本实施例所涉及产品，能够用于快速修复临床过程中因手术、烧伤、激光整形等原因形成的创面的材料。同时对于修复液体部分配方在一定调整下可以形成修复喷雾及修复面膜等产品。

同时将本实施例中的重组人源A型类胶原融合蛋白更换为重组人源C型类胶原融合蛋白或重组人源D型类胶原融合蛋白，即可对应辐射产生的皮肤及粘膜损伤具有较好的修复效果。

实施例4：B型类胶原融合蛋白的应用

将冻干后的重组人源B型类胶原融合蛋白，用预冷0.05M醋酸溶液重悬，调整浓度为6mg/ml标准溶液；

配置细胞培养液：取75ml的2×DMEM培养基加入20ml血清混合均一后，加入预先配置的25uM的Hepes缓冲液(pH7.6)5ml，充分混匀，过滤除菌。

加入软骨细胞至细胞浓度为2×105/mL，使用移液器轻柔混匀。加入等量的重组人源类胶原融合蛋白B型标准溶液，充分混匀后，转移至特定的模具内，37℃进行凝胶相变为固态凝胶。转移至细胞培养箱中培养一周，即可根据软骨缺损进行修剪后，在生物胶的作用下，粘结到缺损区。

将培养一周后的胶原块，无菌切除1×1cm大小，抽提RNA，分别利用I型胶原蛋白、II型胶原蛋白核酸探针进行RT-PCR检测各个细胞因子的表达丰度，证实在本发明的生物支架中预培养的软骨细胞具备初代细胞的分化能力及细胞代谢功能。

以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。