一种雾化牡蛎人参复合肽及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种雾化牡蛎人参复合肽及其制备方法与应用 (Atomized oyster-ginseng composite peptide and preparation method and application thereof ) 是由 张庆贺 陈长宝 俞萍 王恩鹏 李琼 张涛 王欢 陈雪 刘芳馨 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种雾化牡蛎人参复合肽及其制备方法与应用,属于生物医药和保健食品领域。将牡蛎肉5％～95％、人参粗粉5％～95％合并后,用1水煎煮提取,合并滤液,浓缩,加入浓度75％～95％的乙醇,静置、过滤取沉淀,将获得牡蛎人参水溶性粗提物进行酶解,酶解液离心,取滤液,喷雾干燥,将牡蛎人参复合肽制成喷雾剂、气雾剂或粉雾剂。优点是具有防治慢性阻塞性肺疾病的功效,能够用于肺部保健以及肺炎等肺部疾病的辅助治疗药物,有助于增强肺部疾病患者的免疫功能,改善患者肺功能及生活质量,提高了生物利用度和效果,降低了价格和可能的毒性反应,采用喷雾的方式,通过口和、或鼻服用,具有一定的推广及应用价值。(The invention relates to an atomized oyster-ginseng composite peptide and a preparation method and application thereof, belonging to the field of biological medicines and health-care foods. Mixing 5-95% of oyster meat and 5-95% of ginseng coarse powder, decocting and extracting by using 1% of water, mixing filtrates, concentrating, adding 75-95% of ethanol, standing, filtering, taking precipitate, carrying out enzymolysis on the obtained oyster ginseng water-soluble crude extract, centrifuging enzymolysis liquid, taking filtrate, carrying out spray drying, and preparing the oyster ginseng composite peptide into a spray, an aerosol or a powder spray. The Chinese medicinal composition has the effects of preventing and treating the chronic obstructive pulmonary disease, can be used as an adjuvant therapy medicament for lung diseases such as lung health care, pneumonia and the like, is beneficial to enhancing the immunologic function of a patient with the lung disease, improving the lung function and the life quality of the patient, improving the bioavailability and the effect, reducing the price and possible toxic reaction, adopts a spraying mode, is taken through mouth and/or nose, and has certain popularization and application values.)
技术领域
本发明属于生物医药和保健食品领域，尤其涉及一种雾化牡蛎人参复合肽及其制备方法与应用。
背景技术
牡蛎(Oyster)又名蚝、海蛎子、蛎黄等，性味偏寒凉，其肉质鲜美可口，同时具有很高的营养和药用价值。现代药理学研究表明，牡蛎具有增强免疫力、抗疲劳、抗病毒、保护肝脏、降糖、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等作用。牡蛎，尤其是牡蛎肉中含有丰富的蛋白质和碳水化合物，以及多种氨基酸、糖原、活性微量元素。人参为五加科植物人参(panax ginsengC.A.Mey.)的干燥根和根茎，属于温补药，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。人参发挥多重药理作用的物质基础主要有皂苷、多糖、多肽、糖肽、蛋白质、挥发油等成分。牡蛎与人参二者配合应用，符合中医药寒热互补，阴阳互配的配伍规律，更有利于人体健康。现有二者配合应用的产品多为人参粉末或人参皂苷与牡蛎提取物另加其他中药或食品的配方，尚未见牡蛎肽和人参肽两种复合肽的联合应用报道。
近年来，肽类成分以其独特的生物活性和极高的生物利用度受到国内外学者的广泛关注，牡蛎肽包括牡蛎多肽、牡蛎低聚肽；人参肽包括人参多肽、人参低聚肽、人参糖蛋白、人参糖肽因具有较好生物活性而逐渐走进人们视野，逐渐应用到药品、食品、保健食品及化妆品等领域。目前人参或牡蛎产品服用方式大多以口服的方式给药，但大分子肽类成分口服生物利用度较低，而注射给药花费昂贵、服用不便且副作用较大。经文献检索，至今，尚未检索到牡蛎用于治疗慢性阻塞性肺疾病的任何报道，而对于人参治疗慢性阻塞性肺疾病的报道只见皂苷类成分，未见其大分子水溶性成分防治慢性阻塞性肺疾病的有关报道。
发明内容
本发明提供一种雾化牡蛎人参复合肽及其制备方法与应用，制备防治慢性阻塞性肺疾病药物以及用于肺部保健以及肺炎等肺部疾病的辅助治疗药物，有助于增强肺部疾病患者的免疫功能，减轻炎性反应，改善患者肺功能及生活质量。
本发明采取的技术方案是：一种雾化牡蛎人参复合肽是由如下原料和方法制备的：
按重量百分比计：
新鲜牡蛎肉5％～95％；
干燥人参5％～95％；
制备方法：
(1)、称取新鲜牡蛎肉，蒸馏水清洗，备用；
(2)、称取干燥人参，粉碎成粗粉，加水浸泡，备用；
(3)、将牡蛎肉和人参粗粉合并后，用12～20倍体积的水煎煮提取，过滤取滤液，合并，浓缩；
(4)、边搅拌加入浓度75％～95％的乙醇，静置24～48小时，过滤取沉淀，获得牡蛎人参水溶性粗提物；
(5)、将牡蛎人参水溶性粗提物进行酶解，底物浓度为1％～20％，加酶量为1％～10％，酶解液pH为5～6.5，酶解温度45～65℃，酶解时间3～8小时，之后100℃灭活10分钟，酶解液离心，取滤液，活性炭脱色，滤液喷雾干燥，得到牡蛎人参复合肽固体粉末；
(6)、将牡蛎人参复合肽制成喷雾剂、气雾剂或粉雾剂，得到雾化牡蛎人参复合肽。
本发明所述酶解采用的酶是蛋白质水解酶，包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶中的一种或两种。
本发明所述采用两种复合酶的重量百分比是：第一种酶10％～90％，第二种酶10％～90％。
本发明所述雾化牡蛎人参复合肽的制备包括：
1)将牡蛎人参复合肽溶液与辅料混合、过滤，制成喷雾剂；
2)将牡蛎人参复合肽溶液加入抛射剂，制成气雾剂；
3)将牡蛎人参复合肽固体粉末加入附加剂，制成粉雾剂。
本发明得到的雾化牡蛎人参复合肽中水溶性大分子成分包括：人参多肽、人参低聚肽、人参糖蛋白、人参糖肽、牡蛎多肽和牡蛎低聚肽。
一种雾化牡蛎人参复合肽的制备方法，包括下列原料和步骤：
按重量百分比计：
新鲜牡蛎肉5％～95％；
干燥人参5％～95％；
制备方法：
(1)、称取新鲜牡蛎肉，蒸馏水清洗，备用；
(2)、称取干燥人参，粉碎成粗粉，加水浸泡，备用；
(3)、将牡蛎肉和人参粗粉合并后，用12～20倍体积的水煎煮提取，过滤取滤液，合并，浓缩；
(4)、边搅拌加入浓度75％～95％的乙醇，静置24～48小时，过滤取沉淀，获得牡蛎人参水溶性粗提物；
(5)、将牡蛎人参水溶性粗提物进行酶解，底物浓度为1％～20％，加酶量为1％～10％，酶解液pH为5～6.5，酶解温度45～65℃，酶解时间3～8小时，之后100℃灭活10分钟，酶解液离心，取滤液，活性炭脱色，滤液喷雾干燥，得到牡蛎人参复合肽固体粉末；
(6)、将牡蛎人参复合肽制成喷雾剂、气雾剂或粉雾剂，得到雾化牡蛎人参复合肽。
本发明所述酶解采用的酶是蛋白质水解酶，包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶中的一种或两种。
本发明所述采用两种复合酶的重量百分比是：第一种酶10％～90％，第二种酶10％～90％。
本发明所述雾化牡蛎人参复合肽的制备包括：
1)将牡蛎人参复合肽溶液与辅料混合、过滤，制成喷雾剂；
2)将牡蛎人参复合肽溶液加入抛射剂，制成气雾剂；
3)将牡蛎人参复合肽固体粉末加入附加剂，制成粉雾剂。
本发明所述雾化牡蛎人参复合肽在制备防治慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。
本发明所述雾化牡蛎人参复合肽在制备肺部保健以及肺部疾病的辅助治疗药物中的应用，用于增强肺部疾病患者的免疫功能，减轻炎性反应，改善患者肺功能及生活质量。
本发明的有益效果，选用牡蛎人参复合肽为原料，并制备了以雾化形式服用的牡蛎人参复合肽，其中水溶性大分子成分包括：人参多肽、人参低聚肽、人参糖蛋白、人参糖肽、牡蛎多肽和牡蛎低聚肽；有效成分经测定，蛋白质1.0％～70％、多糖0.5％～70％、人参总皂苷0.1％～10％。通过进行香烟烟雾暴露所致小鼠慢性阻塞性肺疾病小鼠模型实验，并用牡蛎人参复合肽对实验动物进行干预，实验结果显示雾化给与牡蛎人参复合肽对香烟烟雾暴露所致小鼠的肺功能有保护作用，对其炎症细胞的浸润、促炎细胞因子的表达有抑制作用。同时发现牡蛎人参复合肽对香烟烟雾暴露所致小鼠的胸腺和脾脏两大免疫器官也有一定的保护作用。
本发明雾化牡蛎人参复合肽具有明确的防治慢性阻塞性肺疾病的功效，能够用于肺部保健以及肺炎等肺部疾病的辅助治疗药物，有助于增强肺部疾病患者的免疫功能，改善患者肺功能及生活质量，本发明克服了大分子肽类成分口服生物利用度低、注射价格昂贵且不便等缺点，提高了生物利用度和效果，降低了价格和可能的毒性反应，采用喷雾的方式，通过口和、或鼻服用，具有一定的推广及应用价值。
具体实施方式
实施例1
称取新鲜去壳的牡蛎肉95份，蒸馏水清洗，备用；称取干燥人参5份，粉碎成粗粉，加水浸泡，备用；合并人参粗粉和牡蛎肉，用12倍体积的蒸馏水煎煮提取，过滤取滤液，合并，浓缩后，边搅拌边加入85％乙醇，静置24小时，过滤取沉淀，获得牡蛎人参水溶性粗提物；
将牡蛎人参水溶性粗提物采用胃蛋白酶进行酶解，底物浓度10％，加酶量为5％，酶解液pH为5.5，酶解温度55℃，酶解时间6小时，而后100℃灭活10分钟，酶解液离心，取滤液，活性炭脱色，滤液喷雾干燥，得到牡蛎人参复合肽固体粉末(A)。
实施例2
称取新鲜去壳牡蛎肉50份，蒸馏水清洗，备用；称取干燥人参50份，粉碎成粗粉，加水浸泡，备用；合并人参粗粉和牡蛎肉，用20倍蒸馏水煎煮提取，过滤取滤液，合并，浓缩后，边搅拌边加入75％乙醇，静置36小时，过滤取沉淀，获得牡蛎人参水溶性粗提物；
将牡蛎人参水溶性粗提物采用胃蛋白酶：木瓜蛋白酶＝5:5复合酶进行酶解，底物浓度1％，加酶量为1％，酶解液pH为5.0，酶解温度45℃，酶解时间8小时，而后100℃灭活10分钟，酶解液离心，取滤液，活性炭脱色，滤液喷雾干燥，得到牡蛎人参复合肽固体粉末(B)。
实施例3
称取新鲜去壳牡蛎肉5份，蒸馏水清洗，备用；称取干燥人参95份，粉碎成粗粉，加水浸泡，备用；合并人参粗粉和牡蛎肉，用16倍蒸馏水煎煮提取，过滤取滤液，合并，浓缩后，边搅拌边加入95％乙醇，静置48小时，过滤取沉淀，获得牡蛎人参水溶性粗提物；
将牡蛎人参水溶性粗提物采用胰蛋白酶：风味蛋白酶＝1:9复合酶进行酶解，底物浓度20％，加酶量为10％，酶解液pH为6.5，酶解温度65℃，酶解时间3小时，而后100℃灭活10分钟，酶解液离心，取滤液，活性炭脱色，滤液喷雾干燥，得到牡蛎人参复合肽固体粉末(C)。
实施例4：不同剂型雾化牡蛎人参复合肽的制备
目前常用喷雾剂、气雾剂和粉雾剂三种剂型实现雾化，为了满足不同人群的服用，制备了三种剂型的雾化牡蛎人参复合肽，统称雾化牡蛎人参复合肽，采用实施例1～3中的牡蛎人参复合肽固体粉末或溶液为原料进行制剂的制备如下：
(1)喷雾剂牡蛎人参复合肽的制备
取蒸馏水适量，依次加入配方量牡蛎人参复合肽固体粉末、氯化钠7.0g、苯扎氯铵适量，搅拌至完全溶解，再用蒸馏水配置成不同浓度(0.5～50mg/mL)的牡蛎人参复合肽溶液，搅匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，加泵，轧盖，加帽；
(2)气雾剂牡蛎人参复合肽的制备
称取甘油和无水乙醇适量，搅拌均匀，称取处方量的牡蛎人参复合肽固体粉末加入上液，搅拌至药物分散均匀，将其浓度配为每揿0.05～5mg(相当于0.5～50mg/mL的液体浓度)，在室温下灌入容器内，加上定量阀盖，扎紧，通过压装机压入定量抛射剂四氟乙烷(HFA134a)；
(3)粉雾剂牡蛎人参复合肽的制备
将喷雾干燥得到的牡蛎人参复合肽固体粉末，加入辅料甘露醇，混合，超微粉碎至粒度小于10μm，然后加入储库型给药装置。
实施例5：牡蛎人参复合肽原料化学成分分析
(1)蛋白质含量测定采用BCA法测定产品中蛋白质的含量。按式①计算蛋白质含量。
式中：WP——蛋白质含量，％；C——样品溶液中蛋白质量浓度，mg/mL；V——样品定容体积，mL；m1——粗提物质质量，g；m2——样品溶液质量，g；m3——原料质量，g。
(2)多糖含量测定
标准曲线的绘制：精密吸取0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μL质量浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准液于离心管中，加超纯水补充至100μL，混匀，得到质量浓度分别为0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10mg/mL的标准溶液。加入含量为0.5％苯酚溶液100μL，缓缓加入浓硫酸500μL，混匀，100℃水浴5min，待水浴锅中温度降至室温，取出。精密吸取200μL置于96孔板中，以超纯水为空白，测定490nm处吸光度。绘制标准曲线得回归方程y＝5.171 6x+0.148 4，R2＝0.999。
样品溶液的测定：取人参糖蛋白粉配制成0.1mg/mL的样品溶液，测定490nm处吸光度，按式②计算多糖含量。
式中：WG——多糖含量，％；C——样品溶液中多糖质量浓度，mg/mL；V——样品定容体积，mL；m1——粗提物质量，g；m2——样品溶液的质量，g；m3——原料质量，g。
(3)人参总皂苷含量测定
根据人参食品中人参总皂苷的测定标准：DB22T1668-2012采用分光光度法，按式③计算人参总皂苷含量。
式中：WR——人参总皂苷含量，％；A——标准曲线上计算出测定液人参皂苷的质量，μg；V1——样品制备的总体积，mL；V2——测定用样品制备液总体积，mL；m——样品质量，g。
(4)测定结果
根据以上测定方法，测得实施例1中，牡蛎人参复合肽(A)成分含量，其重量百分比特征为：蛋白质58.4％、多糖30.7％、人参总皂苷0.8％。测得实施例2中，牡蛎人参复合肽(B)成分含量，其重量百分比特征为：蛋白质36.5％、多糖49.4％、人参总皂苷3.2％。测得实施例3中，牡蛎人参复合肽(C)成分含量，其重量百分比特征为：蛋白质15.7％、多糖73.1％、人参总皂苷5.3％。
下边通过药效学试验进一步说明本发明的雾化牡蛎人参复合肽的用途。
试验例1：雾化牡蛎人参复合肽对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型小鼠体重、血生化指标及各脏器重量的影响。
用气管注射脂多糖及熏烟联合造模方法制备小鼠模型：第1、14天小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(1％，40mg/kg)，使麻醉，固定，头低位，暴露声门，快速插入静脉套管针气管，拔出针芯，用注射器1s内注入脂多糖生理盐水溶液(200μg/μL)，然后将小鼠直立左右旋转，使脂多糖均匀分布两肺。第2～28天(第14天除外)，将小鼠分组置入自制密闭造模箱内，每日上午给予小鼠香烟烟熏，每次5支香烟。正常对照组于第1、第14天同法气管注入生理盐水但不烟熏。造模成功后，60只C57BL/6小鼠随机分为组正常对照组、模型组、复合肽口服给药组(实施例2中牡蛎人参复合肽固体粉末)以及复合肽雾化给药(实施例2的雾化剂)低、中、高剂量组(20％、50％、80％)。对照组和模型组正常饲养，不予干预；口服给药组进行灌胃给药，药物浓度50％，给药量10mL/kg，连续7天，每天1次；雾化给药组进行雾化吸入，具体为：各组每次雾化均加入4mL，雾化7天，每天两次，每次30min。
雾化结束后饲养一周，观察小鼠活动、体重变化等一般情况，颈椎脱臼法处死小鼠，并称量肝脏、心脏、肺脏、脾脏及胸腺各脏器重量。
结果：C57BL/6小鼠小鼠在接受不同浓度的牡蛎人参复合肽雾化以及口服给药期间均无明显毒性反应，饲养期间无明显异常，无小鼠死亡或出现其他毒性反应。如表1所示，与正常对照组相各组小鼠体重有所增加，但无统计学差异(p>0.05)；如表2所示，与正常对照组相比，模型组脏器重量均有显著下降(p<0.05)；给药组与模型组相比，脏器指数均明显提高(p<0.05)，与正常组相比，无统计学差异(p>0.05)。
表1雾化牡蛎人参复合肽对小鼠体重的影响(n＝10)
表2雾化牡蛎人参复合肽对小鼠各脏器重量的影响(n＝10)
注：脏器指数：脏器重/体重。数据以表示。经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05；与模型组比较*p<0.05。
结论：雾化及口服给药的牡蛎人参复合肽无明显毒副作用且对COPD小鼠主要脏器具有一定的保护作用。
试验例2：雾化牡蛎人参复合肽对COPD模型小鼠血生化指标的影响。
造模方法、实验分组及给药方式同试验例1，雾化结束后，收集血清进行血生化相关指标的检测。
结果：如表3所示，COPD模型组WBC明显高于正常对照组(p<0.01)。与模型组相比，牡蛎人参复合肽各剂量雾化给药组及口服给药组均可使小鼠WBC显著降低(p<0.05，p<0.01)，但口服给药组值高于雾化给药各个剂量组，其他血生化指标，各组之间无统计学意义(p>0.05)。
表3雾化牡蛎人参复合肽对小鼠血生化指标的影响(n＝10)
注：数据以表示。与正常对照组比较#p<0.05，##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01。
结论：雾化及口服给药的牡蛎人参复合肽无明显毒副作用且对COPD小鼠主要脏器具有一定的保护作用，雾化给药组降低外周白细胞的的能力优于口服给药组。
试验例3：雾化牡蛎人参复合肽对COPD模型小鼠肺部病理变化的逆转作用。
造模方法、实验分组及给药方式同试验例1，雾化结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，苏木素—伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变。
结果：正常对照组小鼠支气管粘膜上皮结构完整，支气管纤毛排列整齐，气管及各级支气管仅见散在的杯状细胞，未见腺体增生及明显炎细胞浸润，肺泡结构完整。COPD模型组小鼠支气管肺组织有COPD的病理改变，支气管纤毛上皮部分脱落，纤毛粘连倒伏、变性，支气管管腔内有中度渗出物，气管劲膜下层、肌层可见大量嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润。雾化牡蛎人参复合肽组低、中、高剂量组以及口服给药组支气管纤毛轻度粘连倒伏、变性，支气管平滑肌厚度轻度增加，气管劲膜下层、肌层可见少量嗜酸性细胞，随着剂量的增加，炎性细胞浸润逐渐减轻，与正常对照组相比，口服给药组和低剂量组仍具有慢性支气管炎、阻塞性肺气肿的病理特点，而中、高剂量组的病理变化不明显，非常接近于正常组。
试验例4：雾化牡蛎人参复合肽对COPD模型小鼠肺功能的影响。
造模方法、实验分组及给药方式同试验例1，雾化结束后，进行肺功能测定：小鼠麻醉，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织暴露气管，在气管软骨间环行剪开一小切口，插入气管插管并扎紧，仰卧，头低位，置于小动物肺功能测定仪密闭体积描记箱内。气管插管一端连接动物呼吸机。描记一段平静呼吸后检测用力肺活量(FVC)、0.3s用力呼气容积(FEV0.3)、FEV0.3/FVC、最高呼气流速(PEF)。
结果：与正常对照组相比，COPD模型组小鼠肺功能参数FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF均显著降低或极显著降低(p<0.05或p<0.01)。表明小鼠存在气流阻塞，说明造模成功。与模型组比较，雾化牡蛎人参复合肽低、中、高剂量组肺功能参数FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEFR均显著升高，差异均有统计学意义或(p<0.05或p<0.01)；与模型组比较，口服给药组仅FEV0.3/FVC组升高，结果见表4。
表4雾化牡蛎人参复合肽对小鼠肺功能的影响(n＝10)
注：数据以表示。与正常对照组比较#p<0.05，##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01。
结论：牡蛎人参复合肽可以有效改善COPD小鼠的肺功能，雾化给药中、高剂量组改善COPD小鼠的肺功能效果高于低剂量和口服给药组。
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