阅读说明：本技术 一种人工酶法高效生产硫酸软骨素a的方法 (Method for efficiently producing chondroitin sulfate A by artificial enzyme method ) 是由 康振 陈坚 堵国成 李江华 金学荣 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人工酶法高效生产硫酸软骨素A的方法,属于生物工程技术领域。本方法经过微生物异源表达了一个双功能蛋白软骨素4-O-磺基转移酶C4ST和芳基磺基转移酶AST IV,用于催化软骨素合成硫酸软骨素A,结合酶的定点突变和反应体系组分的优化,加速硫酸软骨素的合成效率。(The invention discloses a method for efficiently producing chondroitin sulfate A by an artificial enzyme method, belonging to the technical field of biological engineering. The method expresses a bifunctional protein chondroitin 4-O-sulfotransferase C4ST and aryl sulfotransferase AST IV by microbes in a heterologous manner, is used for catalyzing chondroitin to synthesize chondroitin sulfate A, and accelerates the synthesis efficiency of the chondroitin sulfate by combining site-directed mutagenesis of enzyme and optimization of reaction system components.)

一种人工酶法高效生产硫酸软骨素A的方法

技术领域

本发明涉及一种人工酶法高效生产硫酸软骨素A的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素A(Chondroitin sulfate A，CSA)是一种有着重要的生物学功能，广泛分布在软骨组织中的一种蛋白聚糖。硫酸软骨素A的骨架是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺经过交替连接而成的线性多糖。硫酸软骨素是软骨素经过不同类型磺基转移酶的磺酸化修饰所形成的，根据磺酸化修饰位置的不同，硫酸软骨素可以被分为以下四种类型：硫酸软骨素A(4-O-磺酸化)、硫酸软骨素C(6-O-磺酸化)、硫酸软骨素D(2,6-di-O-磺酸化)和硫酸软骨素E(4,6-di-O-磺酸化)。硫酸软骨素有着优良的生物相容性，其应用范围非常广泛，例如医疗健康，保健品，食品及化妆品领域。不同磺酸化形式硫酸软骨素有着不同的生物学活性及应用领域。CSA和CSC常被用于治疗关节炎，硫酸软骨素E可促进原代神经元的神经突向外生长。

目前商业生产的硫酸软骨素主要通过动物组织提取获得。该生产方法存在诸多问题，例如潜在动物病毒交叉传染，处理动物组织产生的废液环境污染，硫酸软骨素产品结构高度不均一等。为了得到结构均一、生物安全的硫酸软骨素，利用生物酶法催化合成硫酸软骨素可以有效避免上述问题。其中，生物酶法制备硫酸软骨素A需要软骨素硫酸转移酶C4ST和硫酸基供体PAPS。其中硫酸基供体PAPS通过PNPS和PAP在芳基磺基转移酶AST IV催化下形成。

之前的文献报道中完成100mg软骨素的完全转化需要历时约48h(Zhou,et al.(2018).A microbial-enzymatic strategy for producing chondroitin sulfate glycosaminoglycans.Biotechnology and Bioengineering,115(6),1561-1570.)，催化反应历时过长，而且反应规模小，无法真正进行实际应用。同时，目前许多研究还停留在利用哺乳动物细胞进行C4ST的活性表达，该方法成本高，无法用于实际大规模制备。

发明内容

[技术问题]

利用传统的组织提取法制备硫酸软骨素存在各种弊端，且常规酶法催化合成硫酸软骨素过程低效繁琐。

[技术方案]

本发明提供一种人工酶法高效生产硫酸软骨素A的方法，是利用不同的接头序列将软骨素4-O-磺基转移酶C4ST和芳基磺基转移酶AST IV连接构建形成具有两种酶活性的双功能蛋白，通过接头序列将两个蛋白融合成一个双功能蛋白，在分子水平上拉近了两个酶催化结构域的空间距离，提高了中间底物的传递效率，从而可以有效地提高酶级联反应的催化效率。然后通过在反应体系中添加稳定剂，可以使酶分子长时间保持一定的高活性。利用该双功能蛋白与催化体系中稳定剂的优化可以高效地实现硫酸软骨素A的合成。编码所述接头序列的核苷酸序列为以下任意一种序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。编码软骨素4-O-磺基转移酶的基因经过优化，优化后的基因序列如SEQ IDNO:5所示。

在本发明的一种实施方式中，将携带编码软骨素4-O-磺基转移酶C4ST、接头序列、芳基磺基转移酶AST IV的基因连接到pPIC9K载体上，再将重组载体转化进入毕赤酵母GS115，由重组毕赤酵母GS115表达得到这种双功能蛋白，再利用这种双功能蛋白作为催化剂来催化软骨素合成硫酸软骨素。

在本发明的一种实施方式中，软骨素4-O-磺基转移酶C4ST基因的优化过程如下：

(1)首先将GenBank登录号NP_067414.2的序列去掉N端1-62个氨基酸，然后进行密码子优化并人工合成，将合成的原始序列组装连接到pPIC9K质粒上，得到pPIC9K-Δ62C4ST质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S001；

(2)通过融合PCR技术将SUMO标签蛋白序列融合在Δ62C4ST序列N端，然后通过Gibson组装将融合后的序列SUMOC4连接到pPIC9K载体上，得到pPIC9K-SUMOC4ST质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S002；

(3)通过定点突变技术将pPIC9K-SUMOC4ST质粒中C4ST基因的L134突变成L134E，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S003；

(4)通过定点突变技术将pPIC9K-SUMOC4ST质粒中C4ST基因的F182突变成F182S，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S004；

(5)通过定点突变技术将(3)和(4)中两个突变叠加在一个质粒中，得到L134E/F182S双突变的质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S005。

在本发明的一种实施方式中，将最终优化后的编码软骨素4-O-磺基转移酶的C4ST序列、芳基磺基转移酶AST IV的基因序列通过融合PCR及Gibson组装连接到pPIC9K载体上，得到pPIC9K-C4ST-AST IV质粒，再通过环化PCR或者Gibson组装***编码接头序列的核苷酸序列，然后将重组载体转化进入毕赤酵母GS115，由重组毕赤酵母GS115表达得到这种双功能蛋白，再利用这种双功能蛋白作为催化剂来催化软骨素合成硫酸软骨素。

在本发明的一种实施方式中，1-5mg/mL双功能蛋白、1-20mg/mL软骨素、0.2-1mMPAP、25-75mM PNPS，40～200mg/mL甘油进行催化反应得到硫酸软骨素。

在本发明的一种实施方式中，1-5mg/mL双功能蛋白、1-20mg/mL软骨素、0.2-1mMPAP、25-75mM PNPS，40～200mg/mL甘油和2.0～15mg/mL海藻糖进行催化反应得到硫酸软骨素。

在本发明的一种实施方式中，1-5mg/mL双功能蛋白、1-20mg/mL软骨素、0.2-1mMPAP、25-75mM PNPS，40～200mg/mL甘油，2.0～15mg/mL海藻糖和2.0～15mg/mL山梨醇进行催化反应得到硫酸软骨素。

本发明还提供了表达软骨素4-O-磺基转移酶C4ST、芳基磺基转移酶AST IV双功能酶的重组毕赤酵母，是将软骨素4-O-磺基转移酶C4ST、接头序列、芳基磺基转移酶AST IV的基因连接到pPIC9K载体上，再将重组载体转化进入毕赤酵母GS115，由重组毕赤酵母GS115表达得到这种双功能蛋白。编码所述接头序列的核苷酸序列为以下任意一种序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。编码软骨素4-O-磺基转移酶的基因经过优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO:5所示。编码芳基磺基转移酶AST IV的基因序列如SEQID NO:6所示。

[有益效果]

1、本发明利用生物酶法合成的硫酸软骨素，与传统组织提取法获得的硫酸软骨素相比，产品结构均一，无潜在致病因子，产品的质量安全性得以保证。

2、本发明利用接头序列构建的双功能蛋白同时加入一些特定的稳定剂合成硫酸软骨素，通过接头序列融合可以有效地拉近两个酶催化结构域之间的距离，形成离子通道，加速酶级联反应中间产物的传递；同时反应体系中添加的稳定剂可以使酶长时间保持较高的活性；与其他体外酶法催化合成硫酸软骨素相比，显著的提高了合成效率，降低了成本。

3、本发明可以有效地进行约20g规模的硫酸软骨素合成，为将来硫酸软骨素生物酶法合成进行工业化生产打下基础。

4、本发明对软骨素4-O-磺基转移酶C4ST进行了定点突变，L134、F182的单点突变使酶活分别提高了60％和50％，进一步组合突变后，酶活提高至10倍左右。

附图说明

图1是软骨素4-O-磺基转移酶C4ST表达优化的相对酶活。

图2是双功能蛋白相对酶活及硫酸软骨素A的转化率。

图3是添加不同稳定剂条件下硫酸软骨素A转化率。

图4是UPLC-MS鉴定软骨素与硫酸软骨素A二糖。(a)软骨素液相质谱图；(b)硫酸软骨素A液相质谱图。

具体实施方式

材料：

1.毕赤酵母GS115购自NTCC典型培养物保藏中心。

2.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。

3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。

4.胶回收试剂盒，快切酶SalI等购自Thermo fisher Scientific公司。

5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。

6.各种分析纯试剂购自国药集团。

7.毕赤酵母GS115感受态制备方法及转化步骤参照Thermo Fisher Invitrogen'sPichia EasyCompo Kit。

8.培养基：

YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

BMGY培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，100mM磷酸液，pH 6.0，YNB 13.4，生物素4×10^-4，甘油10。

BMMY培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，100mM磷酸液，pH 6.0,，YNB 13.4，生物素4×10^-4，甲醇10(v/v)。

硫酸软骨素A的液质检测方法：取500μL催化反应结束后的样品，加入5μL硫酸软骨素裂解酶ABCI，置于37℃孵育处理12h。将裂解后的溶液置于沸水中加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行UPLC-MS检测。UPLC-MS检测使用Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，Waters,MA,USA)。洗脱液A为乙腈，洗脱液B为超纯水，使用氨水将pH值调节至10.4。所用的洗脱梯度设定如下：0-2分钟，5％B；2-3分钟，5-30％B；3-6分钟，30-60％B；6-8分钟，60％B。柱温保持在40℃，流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 300-800的质量范围进行扫描监测。

硫酸软骨素A的转化率：指硫酸软骨素A质量占反应初始投入的软骨素质量的比例。

C4ST的酶活定义及酶活检测方法：C4ST酶活定义为：37℃条件下，每小时合成1μMPNP所需要的酶量。反应体系中加入50mM PNPS,0.5mM PAP,2mg AST IV,10％(v/v)甘油,20mg软骨素和500μl C4ST酶液，用20mM磷酸盐缓冲体系(pH 7.0)将反应体系定容1.5mL，置于37℃恒温孵育2h后，检测实验组与对照组A₄₀₀吸光值的差值。对照组中将C4ST酶液置于沸水中加热失活5分钟，其余操作同实验组。

AST IV的酶活定义及酶活检测方法：AST IV酶活定义为：37℃条件下，每分钟合成1μM PNP所需要的酶量。取50mM PNPS,0.5mM PAP溶液置于37℃金属浴中孵育，加入900μlAST IV酶液混合后置于37℃金属浴中孵育2分钟，通过分光光度计检测A400吸光值的增长值。对照组中将AST IV酶液置于沸水中加热失活5分钟，其余操作同实验组。

实施例中设计的引物具体如表1所示。

表1引物序列表

实施例1：构建重组毕赤酵母GS115/lin1、GS115/lin2、GS115/lin3、GS115/lin4

1.优化编码软骨素4-O-磺基转移酶的基因

(1)首先将GenBank登录号NP_067414.2的序列去掉N端1-62个氨基酸，然后进行密码子优化并人工合成，将合成的原始序列组装连接到pPIC9K质粒上，得到pPIC9K-Δ62C4ST质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S001；

(2)通过融合PCR技术将SUMO标签蛋白序列融合在Δ62C4ST序列N端，然后通过Gibson组装将融合后的序列SUMOC4连接到pPIC9K载体上，得到pPIC9K-SUMOC4ST质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S002；

(3)通过定点突变技术将pPIC9K-SUMOC4ST质粒中C4ST基因的L134突变成L134E，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S003；

(4)通过定点突变技术将pPIC9K-SUMOC4ST质粒中C4ST基因的F182突变成F182S，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S004；

(5)通过定点突变技术将(3)和(4)中两个突变叠加在一个质粒中，得到L134E/F182S双突变的质粒，将该质粒用快切酶SalI线性化后转入毕赤酵母GS115得到重组菌株S005。

将重组菌株S001、重组菌株S002、重组菌株S003、重组菌株S004、重组菌株S005分别接种到YPD液体培养基中置于30℃培养24h，然后转接至BMGY培养基中置于30℃培养24h，离心收集菌体并用生理盐水洗涤菌体2次后用BMMY培养基重悬细胞，置于30℃培养96h，每24h添加1％(V/V)甲醇进行诱导表达。收集培养了96h后的发酵液上清，检测不同重组菌株中C4ST的酶活，结果如图1所示。

结果表明，在软骨素4-O-磺基转移酶C4ST基因的N端融合SUMO基因序列使酶活提高了约5倍，同时两个位点(L134、F182)的单点突变使酶活分别提高了60％和50％，进一步组合突变后的重组菌株S005相比于初始菌株S001酶活提高至10倍左右。优化后最终的编码软骨素4-O-磺基转移酶的基因序列如SEQ ID NO:5所示。

2.构建pPIC9K-C4ST-lin1-AST IV质粒

(1)以优化后的基因C4ST、AST IV(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示)为模板，以引物C4-F/C4-R、AST-F/AST-R扩增2个基因，利用融合PCR和Gibson组装连接到pPIC9K载体上，构建成pPIC9K-C4ST-AST IV质粒；

(2)然后通过引物hplin1-F/hplin1-R环化PCR扩增上述pPIC9K-C4ST-AST IV质粒，将接头序列SEQ ID NO:1***到C4ST和AST IV的核苷酸序列中间，构建得到pPIC9K-C4ST-lin1-AST IV质粒。

3.构建pPIC9K-C4ST-lin2-AST IV质粒、pPIC9K-C4ST-lin3-AST IV质粒

参照构建pPIC9K-C4ST-lin1-AST IV质粒的方法，再构建质粒pPIC9K-C4ST-lin2-AST IV、pPIC9K-C4ST-lin3-AST IV，其中，接头序列lin2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，接头序列lin3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.构建质粒pPIC9K-C4ST-lin4-AST IV

人工合成序列SEQ ID NO:4所示的接头序列lin4，将该接头序列通过引物lin4-F/lin-R扩增后利用Gibson组装连接到pPIC9K-C4ST-AST IV载体上，构建成质粒pPIC9K-C4ST-lin4-AST IV。

5.将质粒转化进入毕赤酵母

将质粒pPIC9K-C4ST-lin1-AST IV、pPIC9K-C4ST-lin2-AST IV、pPIC9K-C4ST-lin3-AST IV、pPIC9K-C4ST-lin4-AST IV分别用过快切酶SalI线性化后转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，筛选阳性菌株，所得工程菌株分别命名为GS115/lin1，GS115/lin2，GS115/lin3，GS115/lin4。

实施例2：两种催化体系硫酸软骨素A转化率的比较

将实施例1构建的工程菌株GS115/lin1、GS115/lin2、GS115/lin3、GS115/lin4，分别划线于YPD平板活化，然后挑单菌落接种于YPD培养基中30℃培养16h，然后按10％接种量接种于BMGY培养基中，30℃培养24h。培养结束后，收集菌体，用生理盐水重悬洗涤菌体2次，将菌体最后重悬于BMMY培养基中于30℃进行培养，每24h补加1％甲醇进行诱导表达，诱导培养96h后离心收集上清，测定C4ST、AST IV的酶活。以游离表达的C4ST和AST IV作为对照，计算相对酶活，结果如图2(a)所示。分别利用四种不同的人工接头序列将C4ST和AST IV融合成双功能蛋白，两种酶的酶活出现不同程度的降低，其中以SEQ ID NO:1接头序列构建的双功能蛋白中，C4ST和AST IV酶活分别降低了45％和31％，但是以SEQ ID NO:3接头序列构建的双功能蛋白中，C4ST和AST IV酶活几乎未受到明显的影响。

以游离表达的C4ST和AST IV构建游离酶催化体系，以SEQ ID NO:3构建的双功能蛋白lin3构建双功能蛋白催化体系，具体如下：

游离酶催化体系：取C4ST和AST IV蛋白各1mg，软骨素为底物20mg，1mM PAP(Adenosine 3',5'-bisphosphate,3’,5’-二磷酸腺苷)，75mM PNPS(para-nitrophenylsulfate，对硝基苯硫酸)，反应体系通过磷酸盐缓冲液补足至1.5mL，置于37℃反应12h。反应结束后置于沸水中失活10分钟，然后利用液相质谱进行硫酸软骨素A的转化率的检测。

双功能蛋白催化体系：取1mg双功能蛋白lin3，软骨素为底物20mg，1mM PAP(Adenosine 3',5'-bisphosphate,3’,5’-二磷酸腺苷)，75mM PNPS(para-nitrophenylsulfate，对硝基苯硫酸)，反应体系通过磷酸盐缓冲液补足至1.5mL，置于37℃反应12h。反应结束后置于沸水中失活10分钟，然后利用液相质谱进行硫酸软骨素A的转化率的检测。

结果如图2(b)所示，在37℃催化反应12h后，游离酶催化体系转化率为65％，相同时间内双功能蛋白催化体系硫酸软骨素A的转化率为80％。

实施例3：双功能蛋白lin3的获取步骤

接种重组菌株GS115/lin3单菌落于5mL YPD液体培养基中，置于30℃培养24h，然后按10％接种量转接至装有50mL BMMY培养基的摇瓶，再次置于30℃培养24h后离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次后，重悬于50mL BMGY培养基中，置于25℃培养96h，期间每隔24h加入1％体积甲醇进行诱导蛋白表达。

下摇瓶后离心收集发酵液上清即为双功能蛋白lin3粗酶液，通过镍柱在含300mM咪唑，500mM NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.0)条件下洗脱纯化得到双功能蛋白lin3。

实施例4：稳定剂在体外催化合成硫酸软骨素A中的应用

同实施例3步骤获取并纯化双功能蛋白lin3，准备1.5mL的反应体系，其中，双功能蛋白lin3 1mg/mL，发酵得到的软骨素为底物20mg/mL，1mM PAP(Adenosine 3',5'-bisphosphate,3’,5’-二磷酸腺苷)，75mM PNPS(para-nitrophenyl sulfate，对硝基苯硫酸)，120mg/mL甘油，15mg/mL海藻糖，5mg/mL山梨醇，反应体系通过磷酸盐缓冲液(pH7.0)补足至1.5mL，置于37℃反应12h后沸水失活10分钟，利用液相质谱进行转化率的检测，硫酸软骨素A转化率达到98％。结果如图4所示。

实施例5：催化体系放大进行体外催化合成硫酸软骨素A

按照实施例3获取双功能蛋白lin3，准备1L的反应体系，其中，650mg双功能蛋白lin3，20g软骨素底物，1mM PAP和75mM PNPS，120mg/mL甘油，15mg/mL海藻糖，5mg/mL山梨醇，反应成分混合均匀后用磷酸缓冲液(pH7.0)定容至1L，37℃反应12h。反应结束沸水浴失活10分钟终止反应，硫酸软骨素A转化率达到98％。

实施例6：甘油、海藻糖、山梨醇浓度对转化率的影响

选择双功能蛋白lin3，准备1.5mL的反应体系，其中，1mg/mL双功能蛋白lin3，20mg/mL软骨素底物，1mM PAP和75mM PNPS，并参照图3，分别加40、80、120、160、200mg/mL甘油，5、10、15、20mg/mL海藻糖，0、5、10、20mg/mL山梨醇，将上述反应成分混合均匀后用磷酸缓冲液(pH7.0)定容至1.5mL，于37℃反应12h。反应结束沸水浴失活10分钟终止反应，检测硫酸软骨素A的转化率，结果如图3所示，甘油用量为120mg/mL、海藻糖用量为15mg/mL、山梨醇用量为5mg/mL时，硫酸软骨素A的转化率可以达到98％。

序列表

SEQ ID NO:1

GGASEGKGGASSKGS

SEQ ID NO:2

GGSEAAKGGSEAAKGGSGGS

SEQ ID NO:3

GSESGSESEGKSSGKSTGSA

SEQ ID NO:4

SSELAGSESGSVSEQAKESKGSSKG

SEQ ID NO:5

ATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCAC ATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGAT GGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTG ATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGCTACG TATATCGAGGGAAGGTTGTACAACCCAATTCAATTGGAATTGTCTAACACTGCTATTTTGCATCAAATGAGAAGAGATCAAGTTACTGATACTTGTAGAGCTAACTCTGCTATGTCTAGAAAGAGAAGAGTTTTGACTCCAAACGATTTGAAACATTTGGTTGTTGATGAAGATCATGAATTGATTTACTGTTACGTTCCTAAAGTTGCTTGTACTAATTGGAAAAGAGAGATGATGGTTTTGTCTGGTAGAGGTAAATATTCTGATCCAATGGAAATTCCAGCTAACGAAGCTCATGTTTCTGCTAACTTGAAGACTTTGAACCAATACTCTATTCCTGAAATTAATCATAGATTGAAGTCTTACATGAAGTTCTTGTCCGTTAGAGAACCATTTGAAAGATTGGTTTCTGCTTACAGAAACAAGTTTACTCAAAAGTACAATACTTCTTTTCATAAGAGATACGGTACTAAGATTATTAGAAGACAAAGAAAGAATGCTACTCAAGAAGCTTTGAGAAAAGGTGATGATGTTAAATTCGAAGAATTCGTTGCTTATTTGATTGATCCTCATACTCAAAGAGAAGAACCTTTTAATGAACATTGGCAAACTGTTTACTCTTTGTGTCATCCTTGTCATATTCATTATGATTTGGTTGGTAAGTACGAAACTTTGGAAGAAGATTCTAATTATGTTTTGCAATTGGCTGGTGTTTCTGGTTACTTGAAATTCCCTACTTATGCTAAATCTACTAGAACTACTGATGAAATGACTACTGAATTCTTCCAAAATATTTCTGCTGAACATCAAACTCAATTGTATGAAGTTTATAAATTGGATTTCTTGATGTTCAATTATTCTGTTCCTAATTATTTGAAATTGGATTAA

注：划横线处为融合的SUMO蛋白序列；斜体处为突变的氨基酸位点。

SEQ ID NO:6

AST IV序列

ATGCACCACCACCACCACCACGAATTTTCTCGTCCTCCTTTGGTTCATGTTAAGGGTATTCCATTGATTAAGTACTTTGCTGAAACTATTGGTCCTTTGCAAAACTTTACTGCTTGGCCAGATGATTTGTTGATTTCTACTTACCCAAAATCTGGTACTACTTGGATGTCTGAAATTTTGGATATGATTTATCAAGGTGGTAAGTTGGAAAAGTGTGGTAGAGCCCCTATTTATGCTAGAGTTCCATTTTTGGAATTTAAATGTCCAGGTGTTCCTTCTGGTTTGGAAACTTTGGAAGAAACTCCTGCTCCAAGATTGTTGAAGACTCATTTGCCATTGTCTTTGTTGCCACAATCTTTGTTGGATCAAAAAGTTAAAGTTATTTACATTGCTAGAAACGCTAAGGATGTTGTTGTTTCTTATTATAACTTCTACAACATGGCTAAGTTGCATCCAGATCCTGGTACTTGGGATTCTTTCTTGGAAAACTTTATGGATGGTGAAGTTTCTTACGGTTCTTGGTATCAACATGTTAAGGAATGGTGGGAATTGAGACATACTCATCCTGTTTTGTATTTGTTCTACGAAGATATTAAGGAAAACCCAAAGAGAGAAATTAAAAAGATTTTGGAATTTTTGGGTAGATCCTTGCCTGAAGAAACTGTTGATTCTATTGTTCATCATACTTCTTTCAAGAAGATGAAAGAAAATTGTATGACTAATTACACTACTATTCCAACTGAAATTATGGATCATAATGTTTCTCCTTTCATGAGAAAAGGTACTACTGGTGATTGGAAAAATACTTTCACTGTTGCTCAAAATGAAAGATTCGATGCTCATTACGCTAAAACTATGACTGATTGTGATTTTAAATTTAGATGTGAATTGTAA。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种人工酶法高效生产硫酸软骨素A的方法

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Gly Ala Ser Glu Gly Lys Gly Gly Ala Ser Ser Lys Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Ser Glu Ala Ala Lys Gly Gly Ser Glu Ala Ala Lys Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ser Glu Ser Gly Ser Glu Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Gly Ser Ala

20

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Ser Glu Leu Ala Gly Ser Glu Ser Gly Ser Val Ser Glu Gln Ala

1 5 10 15

Lys Glu Ser Lys Gly Ser Ser Lys Gly

20 25

<210> 5

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtgctacg 300

tatatcgagg gaaggttgta caacccaatt caattggaat tgtctaacac tgctattttg 360

catcaaatga gaagagatca agttactgat acttgtagag ctaactctgc tatgtctaga 420

aagagaagag ttttgactcc aaacgatttg aaacatttgg ttgttgatga agatcatgaa 480

ttgatttact gttacgttcc taaagttgct tgtactaatt ggaaaagaga gatgatggtt 540

ttgtctggta gaggtaaata ttctgatcca atggaaattc cagctaacga agctcatgtt 600

tctgctaact tgaagacttt gaaccaatac tctattcctg aaattaatca tagattgaag 660

tcttacatga agttcttgtc cgttagagaa ccatttgaaa gattggtttc tgcttacaga 720

aacaagttta ctcaaaagta caatacttct tttcataaga gatacggtac taagattatt 780

agaagacaaa gaaagaatgc tactcaagaa gctttgagaa aaggtgatga tgttaaattc 840

gaagaattcg ttgcttattt gattgatcct catactcaaa gagaagaacc ttttaatgaa 900

cattggcaaa ctgtttactc tttgtgtcat ccttgtcata ttcattatga tttggttggt 960

aagtacgaaa ctttggaaga agattctaat tatgttttgc aattggctgg tgtttctggt 1020

tacttgaaat tccctactta tgctaaatct actagaacta ctgatgaaat gactactgaa 1080

ttcttccaaa atatttctgc tgaacatcaa actcaattgt atgaagttta taaattggat 1140

ttcttgatgt tcaattattc tgttcctaat tatttgaaat tggattaa 1188

<210> 6

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcaccacc accaccacca cgaattttct cgtcctcctt tggttcatgt taagggtatt 60

ccattgatta agtactttgc tgaaactatt ggtcctttgc aaaactttac tgcttggcca 120

gatgatttgt tgatttctac ttacccaaaa tctggtacta cttggatgtc tgaaattttg 180

gatatgattt atcaaggtgg taagttggaa aagtgtggta gagcccctat ttatgctaga 240

gttccatttt tggaatttaa atgtccaggt gttccttctg gtttggaaac tttggaagaa 300

actcctgctc caagattgtt gaagactcat ttgccattgt ctttgttgcc acaatctttg 360

ttggatcaaa aagttaaagt tatttacatt gctagaaacg ctaaggatgt tgttgtttct 420

tattataact tctacaacat ggctaagttg catccagatc ctggtacttg ggattctttc 480

ttggaaaact ttatggatgg tgaagtttct tacggttctt ggtatcaaca tgttaaggaa 540

tggtgggaat tgagacatac tcatcctgtt ttgtatttgt tctacgaaga tattaaggaa 600

aacccaaaga gagaaattaa aaagattttg gaatttttgg gtagatcctt gcctgaagaa 660

actgttgatt ctattgttca tcatacttct ttcaagaaga tgaaagaaaa ttgtatgact 720

aattacacta ctattccaac tgaaattatg gatcataatg tttctccttt catgagaaaa 780

ggtactactg gtgattggaa aaatactttc actgttgctc aaaatgaaag attcgatgct 840

cattacgcta aaactatgac tgattgtgat tttaaattta gatgtgaatt gtaa 894

<210> 7

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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acgagaaaat tccatatcca atttcaaata attag 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttatttgaaa ttggatatgg aattttctcg tcctcctt 38

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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cacccttacc ttcactggca ccaccatcca atttcaaata a 41

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gaaccaccct tcgctgcctc ggaaccacca tccaatttca aataa 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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gaaccaaagg aggacgagaa aattccatac ccttggagga acccttc 47