一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法及其应用 (Preparation method and application of Yi traditional fermented medicine total polysaccharide ) 是由 梁寒峭 李守黔 田婧 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法及其应用,该制备方法包括：(1)多组分发酵,提取过滤,得到浓缩液；(2)将浓缩液用大孔吸附树脂吸附,洗脱至洗脱液无色,用50-95％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；(3)减压回收乙醇,剩余提取液浓缩上样至聚酰胺色谱柱,用25～30％和45～50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色,用100％甲醇溶液洗脱,得一种彝族传统发酵药总多糖。该制备方法操作简单、提取纯度高、提取效果稳定,将一种彝族传统发酵药总多糖运用于肠道调节和降血糖的治疗药物中,副作用小、不良反应发生率低,且疗效确切,可长期服用。(The invention provides a preparation method and application of total polysaccharides of Yi traditional fermented medicine, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) fermenting multiple components, extracting and filtering to obtain a concentrated solution; (2) adsorbing the concentrated solution with macroporous adsorbent resin, eluting until the eluate is colorless, and eluting with 50-95% ethanol until the eluate contains no total polysaccharide component; (3) and recovering ethanol under reduced pressure, concentrating the residual extracting solution, loading the concentrated extracting solution into a polyamide chromatographic column, eluting with 25-30% and 45-50% methanol aqueous solutions until the eluent is colorless, and eluting with 100% methanol aqueous solution to obtain the total polysaccharide of the traditional fermentation medicine of the Yi nationality. The preparation method has simple operation, high extraction purity and stable extraction effect, and the total polysaccharide of the Yi traditional fermented medicine is applied to the treatment medicines for regulating intestinal tracts and reducing blood sugar, has small side effect, low adverse reaction incidence and definite curative effect, and can be taken for a long time.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法及其应用，具有显著调节肠道菌群和降血糖作用。
背景技术
随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，高热量低纤维饮食增加，体力劳动和运动量下降，便秘和糖尿病发病率迅速增长，已成为世界各国越来越严重的一个公共卫生问题。我国虽是世界上糖尿病患病率较低的国家, 但糖尿病患者的人数已居世界第二位(仅次于美国) , 增长速度惊人。糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性代谢疾病，主要特征为高血糖，由胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍所致，包括I型和II型两种。I型糖尿病为少年发病型, 是胰岛素分泌绝对不足引起的。II型糖尿病为成年发病型，占糖尿病病例的90%以上，是胰岛素分泌缺陷或胰岛素功能障碍引起的。糖尿病通常还伴随着多种并发症，如冠心病、脑血管和外周血管病变、肾病和视网膜病变、糖尿病骨质疏松等。
刺梨（Rosa roxburghii Tratt）是一种药食两用的蔷薇科植物，主要分布于我国西南部地区，传统医学主要以刺梨根、叶以及果实等入药，用于消食健脾、止泻、解暑等功效，对于治疗积食腹胀、高血脂、肠炎、高血压、夜盲症、维生素C缺乏症等疾病都有一定的效果，其中《本草纲目拾遗》、《黔书》等对其药理作用均有详实的记载，它同时也被《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录。刺梨果富含Vc、超氧化物歧化酶（SOD）、黄酮、多糖、多种人体必需的氨基酸及微量元素，具有多种生理功能，被誉为“贵州山珍”。体外降血糖实验结果表明刺梨多糖具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，优于商品降血糖药物-阿卡波糖。
天麻（Gastrodia elata. Bl.）又称赤箭、离合草、鬼督邮、仙人脚、定风草、离母、独摇芝等，在我国已有2000多年药用历史，其块茎为卵圆形，有节，肉质肥厚，节上有膜质磷叶，常以此入药，味甘性平，归肝经，用于小儿惊风，癫痫抽搐，头痛眩晕等症。现代药理研究发现，以天麻素治疗KK-AyⅡ型糖尿病小鼠，结果发现其能明显促进糖代谢、减轻胰岛素抵抗，并改善糖尿病肾病。
灵芝（ganoderma lucidum），又名芝草、菌灵芝、木灵芝、赤芝、铁菌等，是多孔菌科真菌灵芝的干燥子实体。现代医学认为, 灵芝是滋补强身、扶正固本的珍贵药品，长期服用有轻身延年益寿之功效。近年来，国内外大量研究表明，灵芝多糖是灵芝的有效成分之一，其种类很多，有水溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖。灵芝多糖可通过提高胰岛素水平，降低氧化应激水平，改善胰岛素抵抗，增强糖代谢酶活性等途径来实现降血糖作用。
目前市场上针对上述症状的药酒类较多，但多通过中药泡制而成，然而泡制的方式，若使用低度数酒基对原料中的成分提取率有限，浪费较严重；而使用高度数酒基不利于病人或亚健康人群服用，局限性较大。并且酒精浸泡不利于多糖类水溶性成分浸出。
发明内容
本发明提供一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法及其应用，通过发酵使原料中的成分最大化转化为人体易吸收的可溶性物质，再通过绿色无污染的纯化方式富集纯化，得到总多糖物质；并且发酵酒度数较低，利于更广泛的人群服用。在使用时，具有一定酒精含量更利于组织的快速渗透和吸收，使有效成分直达病灶，更好地发挥抗氧化作用。
鉴于此，本发明提出一种操作简单、提取纯度高、提取效果稳定且安全无污染的一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法：
(1)发酵：刺梨5-30份、余甘子5-30份、柠檬5-30份、椰子肉1-10份、人参1-5份、天麻1-5份、灵芝1-10份、酵母菌1-15份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵300天以上；
(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃以下减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用大孔吸附树脂吸附，然后用水或质量浓度为1-15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50-100％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；
(4)精制：将步骤(3)得到的50-100％的乙醇洗脱液，经50℃以下减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总多糖。
本发明公开一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，通过采用发酵，并设计其提取、富集和精制的工艺步骤和参数，获得彝族传统发酵药总多糖的最佳制备工艺，有效得到具有显著药理活性的彝族传统发酵药总多糖，从而实现有效利用和开发资源，将彝族传统发酵药总多糖作为有效成份，运用于肠道菌群失调和降血糖的治疗药物中，以期为临床提供一种副作用小、不良反应发生率低，且疗效确切，可长期服用的肠道调节和降血糖的现代黎药制剂。该治疗药物的剂型可以为胶囊 (软胶囊)、颗粒剂(干混悬剂)、片剂(分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片)、溶液剂(糖浆)、丸剂(浓缩丸、滴丸、微丸)或注射剂型。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1) 发酵：刺梨30份、余甘子25份、柠檬20份、椰子肉5份、人参1份、天麻2份、灵芝2份、酵母菌5份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵300天；
(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用D101型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；
(4)精制：将步骤(3)得到的50％的乙醇洗脱液，经50℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总多糖。
实施例2-一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1) 发酵：刺梨20份、余甘子30份、柠檬15份、椰子肉5份、人参2份、天麻1份、灵芝5份、酵母菌2份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵450天；
(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用HP2O型大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为95％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；
(4)精制：将步骤(3)得到的95％的乙醇洗脱液，经50℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总多糖。
实施例3-一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1) 发酵：刺梨25份、余甘子15份、柠檬25份、椰子肉6份、人参3份、天麻3份、灵芝2份、酵母菌10份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵500天；
(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液40℃减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用D201型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为10％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为75％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；
(4)精制：将步骤(3)得到的75％的乙醇洗脱液，经40℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总多糖。
实施例4-一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1) 发酵：刺梨10份、余甘子30份、柠檬5份、椰子肉8份、人参5份、天麻5份、灵芝10份、酵母菌1份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵600天；
(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液35℃减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为80％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分；
(4)精制：将步骤(3)得到的80％的乙醇洗脱液，经35℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总多糖。
对比例1-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，仅改变步骤(1)中的自然温度发酵150天，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总多糖。
对比例2-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，仅改变步骤(2)中的将滤液65℃减压浓缩得到浓缩液，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总多糖。
对比例3-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，仅改变步骤(3)中的用质量浓度为20％的乙醇洗脱至洗脱液无色，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总多糖。
对比例4-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总多糖的制备方法，仅改变步骤(3)中的再用质量浓度为40％的乙醇洗脱至洗脱液不含总多糖成分，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总多糖。
由上表可以看出，由实施例1～4制备获得的总多糖含量均≥65％，由此看出由本发明的制备方法制得的一种彝族传统发酵药总多糖的提取纯度高，且提取的效果稳定，且实施1～4的一种彝族传统发酵药总多糖的提取纯度明显高于对比例1～4，对比例1中降低了发酵天数、对比例2中升高了减压浓缩温度、对比例3中提高了前期洗脱杂质用洗脱液乙醇的质量浓度和对比例4中降低了总多糖洗脱液乙醇的质量浓度，均影响了彝族传统发酵药总多糖的提取纯度。
1、彝族传统发酵药总多糖肠道微生态调节作用
动物选择选择清洁级KM雄鼠60只，适应性饲养7 d天，随机分为6组，每组10只；
给药剂量及实验方案 实验分为空白、模型、总多糖实施例、总多糖对比例四组。空白组每天按 10 mL/kg 灌胃生理盐水，共21d。模型组：第 1、2、3 d 按 10 mL/kg 灌胃盐酸林可霉素，此后每天按 10 mL/kg 灌胃生理盐水，共21 d。总多糖实施例和对比例组：第 1、2、3d 按 10 mL/kg 灌胃盐酸林可霉素（盐酸林可霉素：64 μL 盐酸林可霉素用生理盐水稀释至 1 mL），此后每天按100 mg/kg灌胃实施例1、2和对比例1、2得到的一种彝族传统发酵药总多糖，共21d；
粪便逼迫法取造模后（灌胃盐酸林可霉素三天后）的小鼠新鲜粪便及连续给药 21 d后小鼠粪便 0.1 g 于去离子水处理过的离心管中，使用生理盐水稀释 10-50倍，均匀涂布于双歧杆菌（BBL）、乳酸杆菌（LBS）、肠球菌（EC）、大肠杆菌（EMB）选择培养基中各 5 μL，BBL和LBS 厌氧培养72 h，EMB和EC 需氧培养24 h，结果取对数，菌落计数。
表2:彝族传统发酵药总多糖给药后小鼠粪便菌群数量（lgN）
从以上肠道调节试验结果表明：
彝族传统发酵药总多糖具有较强的肠道菌群调节作用，彝族传统发酵药总多糖纯度降低后，肠道菌群调节能力也随之降低。
2、降血糖活性测定
(1)α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
取10 mg/mL彝族传统发酵药总多糖溶液50 μL加入100 μL α-葡萄糖苷酶（1 U/mL），37℃孵化 10 min 后加入50 μL 对 pPNG（5 mmol/L），然后 37 ℃孵化 20 min 后加入 100μL Na2CO3溶液（1 mol/L）终止酶解反应。在405 nm测定反应体系的吸光值变化，并计算彝族传统发酵药总多糖溶液对α-葡萄糖苷酶体外抑制率（%）=[1-（样品吸光值-对照组1吸光值）/对照组2吸光值]×100%；
对照组 1 为 pPNG 和彝族传统发酵药总多糖混合溶液（不含 α-葡萄糖苷酶），对照组2 为 pPNG 和 α-葡萄糖苷酶混合溶液（不含彝族传统发酵药总多糖）；
(2) α-淀粉酶抑制活性测定
取10 mg/mL彝族传统发酵药总多糖溶液50 μL加入100 μL α-淀粉酶（1.0 U/mL），25℃孵化10 min后加入50 μL 1%（w/v）淀粉溶液，25℃孵化10 min后加入0.1 mL二硝基水杨酸（10 mg/mL）终止酶解反应，并在沸水浴中加热10 min。在540 nm测定反应体系的吸光值变化，并计算彝族传统发酵药总多糖对α-淀粉体外抑制率（%）=[1-（样品吸光值-对照组1吸光值）/对照组2吸光值]×100%；
对照组 1 为淀粉和彝族传统发酵药总多糖混合溶液（不含 α-淀粉酶），对照组 2 位淀粉和 α-淀粉酶混合溶液（不含彝族传统发酵药总多糖）。
表3:彝族传统发酵药总多糖降血糖活性
从以上降血糖活性试验结果表明：
彝族传统发酵药总多糖具有较强的降血糖作用，其效果甚至与阳性对照阿卡波糖相当。彝族传统发酵药总多糖纯度降低后，降血糖活性也随之降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。