一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针及其制备方法与应用 (Infrared light response nitric oxide releasing separable microneedle, and preparation method and application thereof ) 是由 郭瑞 冯龙宝 刘玉 蓝咏 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针及其制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：1)将BNN6溶液和ZIF-8混合,反应,得到BNN6@ZIF-8；2)将BNN6@ZIF-8、BP分散于SFMA溶液中,加入微针模具中填充针尖部位,除去模具中气体,蓝光光照交联,加入PVA溶液以填充模具的空腔,干燥,得到可分离微针。本发明的可分离微针的可同时起到抗菌和促创面愈合的作用,BP和BNN6@ZIF-8协同抗菌；通过近红外光照来控制NO的释放及BP的升温,具有可控的抗菌特性；微针结构可嵌合到组织之中,不会从创面处脱落；背衬材料短时间内即可溶解,不影响创面愈合；具有良好的生物相容性。(The invention discloses a separable microneedle capable of releasing nitric oxide in response to infrared light and a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: 1) mixing BNN6 solution and ZIF-8, and reacting to obtain BNN6@ ZIF-8; 2) and (2) dispersing BNN6@ ZIF-8 and BP in an SFMA solution, adding the solution into a microneedle mould to fill a needle point part, removing gas in the mould, irradiating and crosslinking by blue light, adding a PVA solution to fill a cavity of the mould, and drying to obtain the separable microneedle. The separable microneedle can simultaneously play the roles of resisting bacteria and promoting wound healing, and BP and BNN6@ ZIF-8 are synergistic in resisting bacteria; the release of NO and the temperature rise of BP are controlled by near-infrared illumination, and the antibacterial property is controllable; the micro-needle structure can be embedded into tissues and cannot fall off from the wound surface; the backing material can be dissolved in a short time, and the wound healing is not influenced; has good biocompatibility.)
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，尤其涉及一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病伴随着长期并发症的出现，包括但不限于糖尿病溃疡。糖尿病溃疡的治疗已成为全球卫生保健系统的主要挑战。仅在美国，约有240万至450万人患有糖尿病溃疡。糖尿病溃疡破坏正常的皮肤再生功能，使伤口难以正常的生理方式愈合。这些伤口通常位于四肢，特别是足部。超过一半的糖尿病溃疡感染，导致慢性伤口的发展，甚至增加截肢和死亡的风险。此外，糖尿病溃疡平均持续12-13个月，复发的可能性为60％-70％，使得治疗成本严重增加。糖尿病溃疡治疗费用至少占糖尿病治疗总费用的12％-15％。糖尿病溃疡发病机制复杂，病原菌侵袭，发病率高，增加了治疗成本和难度，严重影响患者的舒适度和身体健康。
一氧化氮(NO)是一种广谱抗菌剂，能与超氧化物自由基(O2 -)反应生成活性物质，这些物质会使得细菌细胞产生严重的氧化应激。此外，作为一种气体信号分子，NO促进血管生成、胶原沉积、再上皮化，并加速伤口愈合。双-N-亚硝基化合物是常用的NO供体，可以在光下分解生成NO分子。已有报道以N,N’-二仲丁基-N,N’-二亚硝基-1,4-苯二胺(BNN6)为NO供体，与MoS2纳米载体相结合，可在808nm近红外激光照射下稳定释放NO。近红外激光可以深入组织，对周围健康区域的损伤很小，因此，是刺激NO释放的一个很好的候选方案。但BNN6在水中的溶解度较低，限制了它们的使用。
金属-有机骨架(MOFs)是一种由过渡金属与有机配体相互结合而成的立体网络结构晶体材料，因其具有大的比表面积和孔隙率、孔尺寸可调控性强等优势，已被广泛应用于气体储存、催化、光学和传感器技术。在多种类型的MOFs化合物中，沸石咪唑酯类骨架材料(ZIFs)具有独特的优势。ZIFs主要由Zn2+与咪唑配体反应形成，而锌是生物学中第二丰富的过渡金属，在生理系统中起重要作用。因此，ZIFs材料较为适宜用作药物载体，而ZIF-8由于其优异的特性，是ZIFs材料中最具有代表性的一种。ZIF-8具有较高的比表面积和带正电荷的表面，可以负载大量的小分子。
目前，近红外主导的光热疗法(PTT)已被广泛应用于抗菌研究中。PTT抗菌是依靠光热材料将近红外转化为局部热量以杀伤细菌的一种疗法，目前在抗生素耐药菌感染的治疗中具有潜在的应用前景。作为光热材料，黑磷纳米片(BP)具有制备方法简单和光热转换效率高的优点，同时黑磷由人体中含量丰富的磷元素组成，可降解为安全无毒的磷酸根离子，因此具有良好的生物相容性。
在伤口治疗中，通常采用性能优良的包扎材料促进伤口愈合，其中水凝胶具有高含水量、灵活的力学性能和良好的生物相容性，被认为是有潜力的临床应用候选材料。大多数水凝胶是由具有良好的生物相容性和可生物降解性的天然高分子材料(如海藻酸钠、羧甲基纤维素、右旋糖酐、明胶、胶原和透明质酸)、合成高分子材料(如甲氧基聚乙二醇、聚乙烯醇、肽和聚酰胺)制备。丝素蛋白(SF)是蚕丝的组成成分之一，具有良好的生物相容性、生物降解性、高抗张强度、多种细胞的增殖和粘附等优良的生物学特性，以及低炎症等特点，已被广泛应用于生物医学和生物技术领域。甲基丙烯酰胺基丝素蛋白(SFMA)是以SF为主体接枝上双键的衍生物，不仅具有良好的生物相容性，还可以响应紫外光，用于制备光交联水凝胶。
一般的负载抗菌剂的水凝胶需要随着水凝胶的逐渐降解才能将抗菌剂释放出来，这一释放模式较大程度上依赖于水凝胶的降解速度，过程比较难控制。同时，水凝胶涂覆在创面处，如无优异的粘附性能，水凝胶容易从创面处脱落，影响创面的修复。再者，市面上仍然缺少同时具有良好抗菌和促创面愈合功效、生物相容性良好的水凝胶微针。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针。
本发明的另一目的在于提供上述红外光响应释放一氧化氮的可分离微针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述红外光响应释放一氧化氮的可分离微针的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将BNN6溶液和ZIF-8混合，反应，得到[email protected]；
(2)将步骤(1)中所述[email protected]、黑磷纳米片(BP)分散于含引发剂的甲基丙烯酰胺基丝素蛋白(SFMA)溶液中，得到的混合物加入微针模具中填充针尖部位，除去模具中的气体，蓝光光照交联，加入聚乙烯醇(PVA)溶液填充模具的空腔，干燥，得到红外光响应释放一氧化氮的可分离微针。
步骤(1)中所述BNN6和所述ZIF-8的用量优选为按照质量比1：3-6配比；更优选为按照质量比1：5配比。
步骤(1)中所述BNN6溶液的溶剂优选为乙醇溶液。
所述乙醇溶液的浓度优选为体积比20％-50％。
步骤(1)中所述反应优选为搅拌反应12-48h。
步骤(1)中所述[email protected]进行微针制备前需经过离心、洗涤、干燥。
所述离心优选为8000-12000rpm下离心10-30min。
所述洗涤优选为采用去离子水洗涤反复洗涤；优选为采用去离子水洗涤3次。
所述干燥优选为真空干燥。
步骤(1)中所述反应和所述[email protected]的储存均在避光条件下进行。
步骤(2)所述甲基丙烯酰胺基丝素蛋白溶液的浓度优选为质量体积比8％-15％。
步骤(2)所述引发剂优选为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)。
步骤(2)所述引发剂的含量优选为基丙烯酰胺基丝素蛋白质量的1/100。
步骤(2)所述[email protected]的用量优选为按其在甲基丙烯酰胺基丝素蛋白溶液中的浓度为0.5-1.2mg/mL配比；更优选为按其在甲基丙烯酰胺基丝素蛋白溶液中的浓度为1mg/mL配比。
步骤(2)所述黑磷纳米片的用量优选为按其在甲基丙烯酰胺基丝素蛋白溶液中的浓度为20-80μg/mL配比；更优选为按其在甲基丙烯酰胺基丝素蛋白溶液中的浓度为40μg/mL配比。
步骤(2)所述混合物加入微针模具之前预先超声去泡。
步骤(2)所述微针模具优选为二甲基硅氧烷(PDMS)模具。
步骤(2)所述除去模具中的气体优选为采用抽真空的方式。
所述抽真空优选为25℃、-80KPa抽真空至没有气泡产生；优选为抽真空3h。
步骤(2)中所述蓝光光照交联的时间优选为40-90s。
步骤(2)中所述聚乙烯醇溶液的浓度优选为质量体积比15％-30％。
步骤(2)中所述干燥优选为25-40℃干燥8-15h。
步骤(2)中所述干燥为避光下干燥。
步骤(1)中所述ZIF-8优选为通过以下方法制备：将2-甲基咪唑和二水乙酸锌溶于水，反应，得到ZIF-8。
所述2-甲基咪唑和二水乙酸锌的用量优选为按照摩尔比40：1配比。
所述反应优选为搅拌反应5h。
所述ZIF-8在参与反应前需经过离心、洗涤，真空干燥。
所述离心优选为10000rpm下离心20min。
所述洗涤为采用去离子水洗涤。
步骤(1)中所述BNN6优选为通过以下方法制备：将N,N’-双仲丁氨基对苯二胺乙醇溶液和NaNO2溶液混合，反应，滴加盐酸，再次反应，洗涤沉淀，干燥，得到BNN6。
所述NaNO2的用量为足量，N,N’-双仲丁氨基对苯二胺和NaNO2的摩尔比超过1:1500。
所述反应优选为在氮气保护下搅拌反应30min。
所述盐酸的用量优选为按其与所述NaNO2以摩尔比1：0.8-1.1配比；更优选为按其与所述NaNO2以摩尔比1：1配比。
所述再次反应优选为搅拌反应4h。
所述洗涤沉淀采用体积比为50％的乙醇溶液。
所述BNN6于-20℃避光储存。
步骤(2)中所述黑磷纳米片优选为通过以下方法制备：将黑磷晶体粉末分散于N-甲基吡咯烷酮中，得到的悬浮液离心，取上清，洗涤，得到黑磷纳米片。
所述分散优选为采用超声波细胞粉碎机探头超声分散。
所述离心优选为以4000rpm的转速离心15min。
所述洗涤是采用将上清液重复12000-13000rpm离心、水溶解的方式洗涤。
步骤(2)中所述甲基丙烯酰胺基丝素蛋白优选为通过以下方法制备：将蚕茧切片，Na2CO3溶液中煮沸，洗涤，得到脱胶丝素蛋白(SF)，烘干，溶解于溴化锂溶液中，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应，过滤，透析，冻干，得到甲基丙烯酰胺基丝素蛋白。
所述Na2CO3溶液的浓度优选为0.05mol/L。
所述煮沸的时间优选为30min。
所述洗涤为采用蒸馏水洗涤。
所述溴化锂溶液的浓度优选为9.3mol/L。
所述溴化锂的用量优选为按其与所述脱胶丝素蛋白以10g脱胶丝素蛋白配比0.93mol溴化锂配比计算。
所述溶解优选为60℃下搅拌1h溶解。
所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量优选为按照甘油酯与脱胶丝素蛋白的配比为0.5-0.8mL/g计算；更优选为按照甘油酯与脱胶丝素蛋白的配比为0.6mL/g计算。
所述反应为搅拌下反应；优选为60℃下以1000rpm转速搅拌反应6h。
所述过滤优选为采用聚酯人造纤维滤布过滤。
所述透析采用透析膜；优选为采用12-14kDa的透析膜。
所述冻干优选为-80℃下冷冻12h。
一种红外光响应释放一氧化氮的可分离微针，通过上述制备方法制备得到。
上述红外光响应释放一氧化氮的可分离微针在制备伤口敷料中的应用。
所述伤口敷料优选为针对开放式创伤感染的创面进行治疗的可分离微针。
原理：本研究将[email protected]纳米材料和BP负载到可分离微针的尖端，促进糖尿病难愈创面的修复。微针针尖部位利用紫外光交联的方法制备，在生理条件下，将光热抗菌材料BP及NO载体[email protected]包覆于SFMA中，然后用356nm的紫外光交联。微针以可溶性聚醋酸乙烯酯(PVA)为背衬材料，以生物相容性甲基丙烯酰胺基丝素蛋白(SFMA)水凝胶为尖端材料。微针涂覆在皮肤上后，PVA背衬层会在几分钟内溶解，SFMA尖端留在伤口内。在808nm近红外下，BP能迅速将光能转化为热能，提高局部温度，同时[email protected]可受热释放NO，NO和局部的高温可起到联合抗菌的作用，释放出的NO不仅可以增强抗菌作用，还同时可以促进胶原蛋白的沉积和血管生成，从而加速创面愈合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次采用了SFMA水凝胶制备可分离式微针，并将BP及NO载体[email protected]包覆于SFMA水凝胶针尖中，可同时起到抗菌和促创面愈合的作用，BP和[email protected]协同抗菌。
2、本发明的可分离微针的背衬材料为可溶解的聚醋酸乙烯酯(PVA)，当微针嵌入到组织中后，背衬材料短时间内即可溶解，不会影响到创面的愈合。甲基丙烯酰胺基丝素蛋白(SFMA)是以SF为主体接枝上双键的衍生物，以SFMA水凝胶制备的针尖生物相容性良好。体外试验结果表明，本发明的可分离微针具有良好的生物相容性。
3、本发明的可分离微针是通过近红外光照来控制NO的释放及BP的升温，具有可控的抗菌特性。同时，微针结构可嵌合到组织之中，保证其不会从创面处脱落。
附图说明
图1为微针的外观图。
图2为实施例1中SF和SFMA的核磁氢谱图。
图3为实施例3中[email protected]的电子透射电镜图。
图4为不同浓度实施例2中BP在功率为1.5W/cm2的808nm近红外光照射下的温度曲线图。
图5为实施例4中微针分别在有无808nm NIR激光照射下NO的释放曲线图。
图6为微针背衬断裂的失败例子照片图。
图7为微针产生气泡的失败例子照片图。
图8为微针针头断裂的失败例子照片图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1甲基丙烯酰胺基丝素蛋白(SFMA)的制备
称取40g去除蚕蛹的蚕茧，将蚕茧切成4片，加入1L 0.05mol/L Na2CO3溶液中，于100℃煮沸30min，并用蒸馏水洗涤多次。然后，将脱胶后的丝素蛋白(SF)在烘箱中烘干。将10g脱胶SF溶解在100mL 9.3mol/L的溴化锂(LiBr)溶液中，在60℃下搅拌1小时，脱胶SF完全溶解后，加入6mL甲基丙烯酸缩水甘油酯，混合，在60℃下以1000rpm搅拌6h。反应完毕，溶液通过神奇滤布(miracloth，聚酯人造纤维滤布)过滤，用蒸馏水使用透析膜(12-14kDa)透析7天除去盐。溶液在-80℃下冷冻12h冻干，得到SFMA。
实施例[email protected]纳米材料的制备
1.ZIF-8的制备
将2-甲基咪唑(400mmol)和二水乙酸锌(10mmol)以40：1的摩尔比溶解于200mL去离子水中，室温搅拌5h，然后在10000rpm下离心20min，得到沉淀。所得白色沉淀物用去离子水洗涤3次，真空干燥，制得ZIF-8粉末。
2.一氧化氮前体BNN6的合成
在4.27×10-3mol/L的N,N’-双仲丁氨基对苯二胺乙醇溶液(18mL)中加入6.0mol/LNaNO2溶液(20mL)，在氮气保护下室温搅拌30min。然后，将20mL的6.0mol/L盐酸滴加到原混合物中，再搅拌4h，此时混合物的颜色由红色变为橙色，并生成沉淀。沉淀物最后用50％(v/v)乙醇溶液洗涤3次，除去多余的试剂，然后干燥，-20℃黑暗中储存。
称取20mg BNN6，将其溶于30mL 33.3％(v/v)的乙醇溶液，准确称取100mg的ZIF-8固体，加入到上述溶液中，混合均匀后加入磁子，将烧杯口用封口膜密封，放到恒温磁力搅拌器上避光搅拌24h。然后在10000rpm下离心20min，得到沉淀，用去离子水洗涤3次，真空干燥，得到[email protected]粉末，-20℃黑暗中储存。
实施例3BP的制备
取适量黑磷晶体，在研钵中研细后，分散于N-甲基吡咯烷酮中，采用超声波细胞粉碎机探头超声，得到棕色悬浮液。将悬浮液以4000rpm的转速离心15min，去除未剥离的黑磷，小心吸取上清，将上清液以12000rpm的转速离心15min，收集沉淀，随后将沉淀用水溶解后以13000rpm的转速离心15min，收集沉淀，即得到BP。
实施例4微针的制备
避光条件下，称取一定量的BP及[email protected]，分散于10％的SFMA溶液(含0.1％亮氨酸氨基肽酶LAP)中，使得BP和[email protected]的浓度分别为40μg/mL及1mg/mL，用200μL移液枪吸取100μL预先超声去泡的10％SFMA溶液到二甲基硅氧烷(PDMS)模具的凹槽中，以填充针尖部位。将PDMS模具放入真空干燥箱中，25℃抽真空至-80KPa，以除去模具中的气体。保持真空度持续约3小时，直至没有气泡产生为止，用405nm的蓝光光照60s交联。以20％(w/v)的聚乙烯醇(PVA，聚乙烯醇1788，CAS号：25213-24-5，厂家：阿拉丁)溶于去离子水，作为背衬溶液。用吸管将200μL的PVA溶液加入PDMS模具，填充模具的空腔。然后，将模具于黑暗和37℃环境中放置干燥12小时。最后，用镊子小心地将模具上的微针剥离。图1为微针的外观图。
实施例5按上述实施例4的方法，SFMA溶液中不加入BP及[email protected]，其他步骤相同，制备不含BP和[email protected]的微针。
实施例6按上述实施例4的方法，SFMA溶液中不加入[email protected]，其他步骤相同，制备BP的浓度为40μg/mL的微针。
实施例7按上述实施例4的方法，SFMA溶液中不加入BP，其他步骤相同，制备[email protected]的浓度为1mg/mL的微针。
检测：
1、核磁氢谱
以氘代重水作为溶剂，分别称取实施例1中的SF 5mg和5mg SFMA，溶解，待溶液完全溶解至澄清后，装入干净的核磁管中，利用核磁共振光谱仪在室温条件下进行核磁结构测定，并采用MestReNova软件进行图谱分析。
图2为实施例1中SF和SFMA的核磁氢谱图。从图中看出，相较于SF，SFMA在化学位移为5.68及6.10处出现新的吸收峰，对应为甲基丙烯酰胺键双键上氢的吸收峰，证明SF改性成功。
2、透射电镜(TEM)测试
称取1mg实施例2的[email protected]，将其分散于1mL水中，用0.22μm滤膜过滤，滤液滴在铜网的碳支持膜上，空气中自然干燥后，置于高分辨透射电镜中观察纳米粒子的总体形貌。
图3为实施例2中[email protected]的电子透射电镜图。从图中看出，所制备的[email protected]分散性较好，粒径较为均一，粒径大小在200nm左右。
3、光热性能
将实施例3中制备的BP分散在水中配置成不同浓度(20、40、60和80μg/mL)的溶液。在室温下，取1mL上述不同浓度的溶液分别加入比色皿中,插入热电偶温度计，用功率为1.5W/cm2的808nm近红外光照射液面5min,每隔20s记录一次温度。以时间为横坐标，温度为纵坐标作图，对比不同浓度的材料体外光热效，同时以去离子水作为对照组。
图4为不同浓度的BP在功率为1.5W/cm2的808nm近红外光照射下的温度曲线。从图中分可看出，去离子水在近红外光照射下温度变化不大，而BP有明显的光热效应。随着BP浓度的增加，其升温速度和最高温度都有所增加，当BP浓度为40μg/mL时，近红外光照射5min后，其温度达到了52.6℃，这一温度能够有效抑制细菌的增殖。
4、NO释放
利用格里斯试剂盒检测NO释放量。将实施例4中制备的微针置于1.5mL密闭的EP管中，再向EP管中加入1mL纯水。每隔1h取出100μL EP管中的液体，加入到96孔板中，再向EP管中补充100μL新鲜的纯水。96孔板中避光依次加入50μL格里斯试剂Ⅰ和50μL格里斯试剂Ⅱ，避光孵育5min然后用酶标仪检测540nm处的吸光度值。
同理，将实施例4中制备的微针置于1.5mL密闭的EP管中，再向EP管中加入1mL纯水。每隔1h以功率为1.5W/cm2的808nm NIR激光照射微针针尖部位，照射5min后停止照射。取出100μL EP管中的液体，加入到96孔板中，再向EP管中补充100μL新鲜的纯水。96孔板中避光依次加入50μL格里斯试剂Ⅰ和50μL格里斯试剂Ⅱ，避光孵育5min然后用酶标仪检测540nm处的吸光度值。每小时进行一次激光照射NO释放实验，共测试5小时。
图5为实施例4中制备的微针分别在有无808nm NIR激光照射下NO的释放曲线。从图中可看出，在无808nm NIR激光照射的条件下，NO亦能逐渐释放，这说明BNN6在可见光下能够缓慢释放，而在808nm NIR激光照射的条件下，NO释放速度明显增加，短时间内释放大量的NO，有利于实现其抗菌效果。
5、体外抗菌试验
用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC-14458，上海鲁微科技有限公司和革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli，ATCC-8739，上海鲁微科技有限公司)评价微针的抗菌性能。将抗菌试验中的细菌OD值调整为0.1。实施例4中制备的微针样品与细菌悬液在37℃的生化培养箱中共培养6个小时，期间每隔1h分别用功率为1.5W/cm2的808nm NIR激光照射共混菌液5min，24h后，对共混菌液进行OD值测量。将100μL的菌悬液稀释后接种在LB琼脂平板上，37℃培养24h后计数培养菌落数，用以下公式计算抗菌率(AR)：
AR(％)＝(Nc-Ns)/Nc×100
其中，Nc为对照样品的平均菌落数，Ns为微针样品的平均细菌菌落数。
表1为实施例4、5、6、7中所制备的微针的体外抗菌测试结果。从表1中看出，不添加BP及[email protected]的微针抗菌率为负值，这可能是SFMA中的丝素蛋白为细菌提供了营养物质的缘故，单独添加BP及[email protected]的微针均具有一定的抗菌性能，但抗菌率不高，而当两者同时添加时，抗菌率达到95％以上，这一结果表明，BP及[email protected]的联用能够起到协同抗菌的效果。
表1不同微针的体外抗菌测试结果
对比例
1、图6为微针在制备过程中背衬部分出现断裂的案例，其主要原因为，微针在干燥过程中温度设置过高，以及干燥时间过长(制备过程中其他步骤与实施例4相同)。
2、图7为微针在制备过程中产生气泡的案例，其原因为，溶液未预先超声去泡。制备过程中其他步骤与实施例4相同。
3、图8为微针在制备过程中针头部分出现断裂的案例，其原因为：1)真空干燥不充分，针尖部分还留有水分，使得其粘附在模具上，脱模时针头断裂；2)脱模时用力过大，致使针头断裂。制备过程中其他步骤与实施例4相同。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。