具体实施方式

鉴于现有技术中生物打印材料难以快速成型、可调节性差、生物相容性差等不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，这种新型生物墨水由改性的壳聚糖和透明质酸构建而成，其制备方法是首先对壳聚糖进行化学改性，获得水溶性的羟丁基壳聚糖，其次对透明质酸进行化学改性，在其表面分别修饰巯基和二乙烯砜基，分别获得巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明制酸，最后将上述修饰后的材料按照一定比例混合，构建智能型双网络自交联的生物墨水体系。

本发明将分别制备的羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸以一定比例混合，从而获得一种可用于生物3D打印且适合脊髓损伤修复的新型生物墨水的制备方法，其能进行负载细胞的3D打印，打印后能快速原位成型且不变形；所形成的支架材料具有良好的生物相容性且力学性能与脊髓组织相匹配。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例的一个方面提供了一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法，其包括：

对壳聚糖进行化学改性，获得羟丁基壳聚糖；

将巯基修饰到透明质酸上，获得巯基修饰的透明质酸；

将二乙烯砜基修饰到透明质酸上，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸；

将羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸混合均匀，获得用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水。

本发明通过对壳聚糖的改性获得羟丁基壳聚糖，改善其在中性条件下的溶解度并且使其具有良好的温敏响应性，同时对透明质酸进行修饰，获得巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸。将羟丁基壳聚糖，巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸按一定比例混合，获得生物墨水。

进一步地，所述可用于脊髓损伤修复的新型3D打印生物墨水，其制备步骤为：

I、对壳聚糖进行化学改性，获得水溶性的羟丁基壳聚糖。

II、对透明质酸进行化学改性，在其表面分别修饰巯基和二乙烯砜基，分别获得巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明制酸。

III、将羟丁基壳聚糖，巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸按一定比例混合，获得生物墨水，并在37℃实现3D打印，打印结构稳定不易坍塌。

更进一步地，前述一种生物墨水的制备方法，包括羟丁基壳聚糖，巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备，壳聚糖改性和透明质酸的修饰主要是共价键作用。

作为优选方案之一，所述制备方法包括：采用碱性物质对壳聚糖进行碱化处理，获得碱化的壳聚糖，之后进行醚化处理，获得羟丁基壳聚糖。

作为更为具体的优选方案之一，所述制备方法具体包括：在氮气气氛中，使包含壳聚糖、碱性物质水溶液的第一混合反应体系于室温反应12～48h，获得碱化的壳聚糖。

进一步地，所述壳聚糖的结构式如式(I)所示：

其中，式(I)中n的取值范围为500～5000。

进一步地，所述壳聚糖的重均分子量为100000～1000000，优选为200000～400000。

作为更为具体的优选方案之一，所述制备方法具体包括：将碱化的壳聚糖分散于异丙醇和/或水溶液(可以是异丙醇溶液、异丙醇和水的混合溶液或者水溶液等)中，搅拌12～48h后加入1，2-环氧丁烷反应0.5～2h，之后再于40～70℃反应12～48h，经后处理，获得羟丁基壳聚糖。

进一步地，所述碱性物质包括氢氧化钠、氢氧化钾等，但不限于此。

进一步地，所述壳聚糖与碱性物质水溶液的质量体积比为1∶(15～25)g/mL。其中，所述碱性物质水溶液的质量浓度为50％。

进一步地，所述碱化的壳聚糖与1，2-环氧丁烷的质量体积比为1∶(15～25)g/mL。

进一步地，所述后处理包括：在所述反应完成后，将反应液的pH值调节至6.5～7.5，之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析48～96h。

进一步地，所述羟丁基壳聚糖的结构式如式(1)所示：

其中，式(1)中n的取值范围为300～3000。

进一步地，所述羟丁基壳聚糖的成胶温度为20～60℃，在37℃下的固化时间为10～20秒。

作为优选方案之一，所述制备方法包括：

使透明质酸、离子交换树脂混合均匀，于20～30℃反应12～24h，反应结束后过滤，以四丁基氢氧化铵溶液将过滤所得液相的pH值调节至6.5～7.5，再于-40～-60℃冷冻干燥48～72h，获得四丁铵修饰的透明质酸；

在氮气气氛中，使包含四丁铵修饰的透明质酸、3，3’-二硫代丙酸、4-二甲基氨基吡啶、二碳酸二叔丁酯和有机溶剂的第二混合反应体系于20～30℃反应18～30h，获得二硫代丙酸修饰的透明质酸；

使包含二硫代丙酸修饰的透明质酸、二硫苏糖醇、氯化物和水的第三混合反应体系于pH值为8.0～9.0的条件下，在20～30℃反应2～4h，对反应所获产物在-40～-60℃进行冷冻干燥48～72h，获得巯基修饰的透明质酸。

进一步地，所述透明质酸的结构式如式(II)所示：

其中，式(II)中n的取值范围为80～550。

进一步地，所述透明质酸的重均分子量为30000～200000，优选为40000～80000。

进一步地，所述透明质酸与离子交换树脂的质量比为1∶1～1∶3。

进一步地，所述四丁铵修饰的透明质酸、3，3’-二硫代丙酸、4-二甲基氨基吡啶与二碳酸二叔丁酯的质量比为(0.6～0.9)∶(1.0～1.4)∶(0.2～0.5)∶(0.1～0.3)。

进一步地，所述有机溶剂包括无水二甲亚砜，但不限于此。

作为优选方案之一，所述制备方法具体包括：将二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于水中，加入二硫苏糖醇和氯化物搅拌至溶解，之后用碱性物质将反应液的pH值调节至8.0～9.0，继续室温搅拌2～4h后，加入氯化物，使反应液中氯化物的质量体积浓度增至4～6％，再用酸性物质将反应液的pH值调节至3.0～4.0，经后处理后对所获产物进行-40～-60℃冷冻干燥48～72h，获得巯基修饰的透明质酸。

进一步地，所述二硫代丙酸修饰的透明质酸与二硫苏糖醇的质量比为1∶0.5～1∶2。

进一步地，所述氯化物可以包括氯化钠、氯化钾等，但不限于此。

进一步地，所述巯基修饰的透明质酸的结构式如式(2)所示：

其中，式(2)中n的取值范围为30～250，x的取值范围为0.4～0.8。

作为优选方案之一，所述制备方法包括：将巯基修饰的透明质酸的溶液逐滴加入二乙烯砜的溶液中形成混合溶液，以碱性物质将所述混合溶液的pH值调节至6.5～7.5，之后于2～8℃反应1～3h，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸。

进一步地，所述制备方法包括：将巯基修饰的透明质酸溶解于水中，形成所述巯基修饰的透明质酸的溶液。

进一步地，所述制备方法包括：将二乙烯砜溶解于水中，形成所述二乙烯砜的溶液。

进一步地，所述巯基修饰的透明质酸与二乙烯砜的质量比为1∶5～1∶9。

进一步地，所述二乙烯砜基修饰的透明质酸的结构式如式(3)所示：

其中，式(3)中n的取值范围为30～220，x的取值范围为0.7～0.9。

作为优选方案之一，所述制备方法包括：将羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸、二乙烯砜基修饰的透明质酸和磷酸缓冲溶液混合均匀，获得所述用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水。

进一步地，所述羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸与二乙烯砜基修饰的透明质酸的质量比为(2～5)∶(0.1～1.2)∶(0.1～1.2)，优选为(2.5～3)∶(0.2～0.4)∶(0.2～0.4)。

本发明实施例的另一个方面提供了一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水，其包括2～5wt％羟丁基壳聚糖、0.1～1.2wt％巯基修饰的透明质酸、0.1～1.2wt％二乙烯砜基修饰的透明质酸，其余部分包括磷酸缓冲溶液。

作为优选方案之一，所述3D打印生物墨水中羟丁基壳聚糖的含量为2～5wt％，巯基修饰的透明质酸的含量为0.1～1.2wt％，二乙烯砜基修饰的透明质酸的含量为0.1～1.2wt％。

进一步地，所述3D打印生物墨水中羟丁基壳聚糖的含量为2.5～3wt％，巯基修饰的透明质酸的含量为0.2～0.4wt％，二乙烯砜基修饰的透明质酸的含量为0.2～0.4wt％。

亦即，所述3D打印生物墨水中羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸的质量百分比分别为2～5wt％、0.1～1.2wt％、0.1～1.2wt％，优选百分比为2.5～3wt％、0.2～0.4wt％、0.2～0.4wt％。

进一步地，所述3D打印生物墨水具有可打印性，在37℃下3D打印成型的固化时间小于20s。

进一步地，所述3D打印生物墨水具有良好的生物相容性，可维持种子细胞(如神经干细胞，间充质干细胞)生存，促进细胞的增殖与分化，从而进行脊髓损伤的修复。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水于构建软组织器官修复的3D打印支架中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种3D打印支架，它是由前述用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水经3D打印成型固化形成。

进一步地，在没有外加交联剂的条件下，所形成的复合水凝胶支架可通过迈克尔加成反应发生二次自交联，所述3D打印支架的力学强度可调控在0.2KPa～10KPa，与脊髓组织的力学强度完全匹配。

进一步地，所述新型3D打印生物墨水可通过改变巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸的比例调控水凝胶支架的力学强度在0.2KPa-10KPa，从而与不同软组织器官的力学性能匹配，可构建用于不同软组织器官修复的3D打印支架，包括皮肤、心脏、肝脏、肌肉、软骨等。

进一步地，所述3D打印生物墨水的打印条件温和，可在细胞培养的温度条件下实现生物3D打印，确保细胞存活率达到90％以上。

藉由上述技术方案，在该双网络生物墨水体系中，一方面利用羟丁基壳聚糖的温敏性能使生物墨水在细胞培养温度下(37℃)能够快速固化(固化时间低于20秒)，另一方面利用巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸之间发生迈克尔加成反应，使水凝胶在没有交联剂的处理下自动实现打印后的二次固化，显著提高水凝胶支架力学强度。三组分结合使得该生物墨水在打印过程既能确保支架结构快速固化成型，又能使所打印的3D支架结构更加稳固，不易塌陷。本发明设计的生物墨水适合于装载神经干细胞的生物3D打印，成型后的支架力学强度可与脊髓组织相匹配，这种3D打印支架适合神经干细胞的粘附，增殖，以及神经元分化，可有效促进脊髓损伤的修复。此外，该生物墨水可通过改变巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸的比例调控水凝胶支架的力学强度，从而与不同软组织器官的力学性能匹配，可构建用于不同软组织器官修复的3D打印支架。

进一步地，所述3D打印生物墨水能进行负载细胞的3D打印，打印后能快速原位成型且不变形；所形成的支架材料具有良好的生物相容性且力学性能与脊髓组织相匹配，有望应用于脊髓损伤的修复。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，羟丁基壳聚糖的制备：

1.壳聚糖精制：取5g壳聚糖，溶于250mL 1％的盐酸溶液中，滤去不溶物，搅拌下加入1mol/L氢氧化钠溶液至反应液pH＝8，收集生成的絮状沉淀，水洗至中性后，用250mL70％的乙醇脱盐三次，再用250mL95％的乙醇脱盐3次，抽滤收集沉淀，放置于80℃烘箱中烘干，从而获得精制的壳聚糖。

2.壳聚糖碱化：将1g精制的壳聚糖分散在20mL质量浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，N₂气氛中室温条件下搅拌24h。反应结束后过滤并挤出多余的碱液，获得碱化的壳聚糖。

3.壳聚糖醚化：将碱化后的壳聚糖分散在10mL异丙醇和10mL水的混合溶液中，搅拌24h后滴加20mL 1，2-环氧丁烷，反应1h后移入60℃油浴锅中搅拌回流24h。反应结束后用10％盐酸溶液调节pH＝7，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析72h，除去未反应的反应物和生成的盐。滤去不溶物后冻干，获得羟丁基壳聚糖(请参阅图1)。

第二步，巯基修饰的透明质酸的制备：

1.将1g透明质酸粉末溶解在50mL水中，加入2.5g离子交换树脂，于20℃搅拌反应12h后抽滤，用四丁基氢氧化铵溶液调节溶液pH＝7，-50℃冷冻干燥48h，获得四丁铵修饰的透明质酸。

2.将0.75g四丁铵修饰的透明质酸，1.2g 3，3’-二硫代丙酸，0.35g 4-二甲基氨基吡啶加入37.5mL无水二甲亚砜溶液中，N₂保护下室温搅拌溶解后，加0.2mL二碳酸二叔丁酯溶液，于20℃继续搅拌反应24h，反应结束后透析72h，-50℃冷冻干燥48h，获得中间产物二硫代丙酸修饰的透明质酸。

3.取0.4g二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于40mL三次水中，加入0.4g二硫苏糖醇和0.4g氯化钠，搅拌至溶解后，将反应液的pH值用氢氧化钠调至8.5，继续25℃搅拌3h后，加入固体氯化钠，使反应液中氯化钠的质量体积浓度增至5％，随后将反应液的pH值用盐酸溶液调至3.5。将反应溶液倒入450mL预冷的无水乙醇中沉淀，离心除去无水乙醇，并用无水乙醇清洗两次，沉淀放入真空干燥箱中干燥。接着用30mL三次水溶解，并在-50℃冷冻干燥48h，获得巯基修饰的透明质酸(请参阅图1)。

第三步，二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备：

将0.1g巯基修饰的透明质酸溶解于5mL三次水中，获得A溶液；将0.7g二乙烯砜溶解于5mL三次水中，获得B溶液。将A溶液逐滴滴加入B溶液中，混合溶液用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调至pH＝7，在冰浴中于4℃搅拌2h后，产物用三次水透析72h后冻干，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸(请参阅图1)。

第四步，羟丁基壳聚糖/透明质酸生物墨水的制备

将0.06g羟丁基壳聚糖加入1.4mL磷酸缓冲溶液中，在冰水浴中搅拌至溶解完全，随后加入0.006g巯基修饰的透明质酸，继续在冰水浴中搅拌溶解完全，待用。

将0.006g二乙烯砜基修饰的透明质酸加入0.6mL磷酸缓冲溶液中，搅拌溶解，待用。

将上述配置好的两种溶液混合均匀，获得3D打印生物墨水，其打印成型的支架力学强度可达1.7KPa。

本实施例中的用于脊髓损伤修复的新型3D打印生物墨水的力学性能数据结果图请参阅图2，成胶行为数据结果图请参阅图3。本实施例中的用于脊髓损伤修复的新型3D打印生物墨水打印后3D支架中神经干细胞活死染色结果图请参阅图4，3D支架中神经干细胞分化结果图请参阅图5，其中蓝色为细胞核染色，绿色为星形胶质细胞染色，红色为神经元染色。

实施例2

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，羟丁基壳聚糖的制备：

1.壳聚糖精制：将5g壳聚糖溶于250mL 1％的盐酸溶液中，搅拌下用氢氧化钠溶液调节反应液pH＝7，收集生成的絮状沉淀并水洗至中性后，用70％的乙醇脱盐三次，再用95％的乙醇脱盐3次，抽滤收集沉淀，放置于80℃烘箱中烘干，从而获得精制的壳聚糖。

2.壳聚糖碱化：将1g精制的壳聚糖分散在15mL质量浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，N₂气氛围中室温搅拌12h，获得碱化的壳聚糖。

3.壳聚糖醚化：将碱化后的壳聚糖分散在异丙醇溶液中，搅拌12h后滴加15mL 1，2-环氧丁烷，反应0.5h后移入40℃油浴锅中搅拌回流12h。反应结束后用盐酸溶液调节pH至6.5，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析48h后，滤去不溶物后冻干，获得羟丁基壳聚糖。

第二步，巯基修饰的透明质酸的制备：

1.将1g透明质酸粉末溶解在50mL水中，加入1g离子交换树脂，在25℃温度下搅拌18h后抽滤，用四丁基氢氧化铵溶液调节溶液pH＝6.5，-40℃冷冻干燥60h，获得四丁铵修饰的透明质酸。

2.将0.6g四丁铵修饰的透明质酸，1.0g 3，3’-二硫代丙酸，0.2g 4-二甲基氨基吡啶加入37.5mL无水二甲亚砜溶液中，N₂氛围中25℃搅拌溶解，加0.1mL二碳酸二叔丁酯溶液，继续搅拌反应18h，反应结束后透析72h，产物-40℃冷冻干燥48h冻干，获得二硫代丙酸修饰的透明质酸。

3.取0.4g二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于三次水中，配成1％的硫代丙酸修饰的透明质酸溶液，加入0.2g二硫苏糖醇和0.4g氯化钠，搅拌至溶解后，将反应液的pH值用氢氧化钠调至8.0，继续20℃搅拌2h后，加入固体氯化钠，使反应液中氯化钠的质量体积浓度增至4％，随后将反应液的pH值用盐酸溶液调至3.0。将反应溶液倒入预冷的无水乙醇中沉淀，离心清洗，沉淀放入真空干燥箱中干燥，并在-40℃冷冻干燥60h，获得巯基修饰的透明质酸。

第三步，二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备：

将0.1g巯基修饰的透明质酸溶解于5mL三次水中，获得A溶液；将0.5g二乙烯砜溶解于5mL三次水中，获得B溶液。将A溶液逐滴滴加入B溶液中，混合溶液用氢氧化钠水溶液调至pH＝6.5，在2℃水浴中搅拌1h后，产物用透析48h后冻干，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸。

第四步，羟丁基壳聚糖/透明质酸生物墨水的制备

将0.04g羟丁基壳聚糖和0.002g巯基修饰的透明质酸加入1.4mL磷酸缓冲溶液中，冰水浴中搅拌至溶解完全，待用。

将0.002g二乙烯砜基修饰的透明质酸加入0.6mL磷酸缓冲溶液中，搅拌溶解，待用。

将上述配置好的两种溶液混合均匀，获得3D打印生物墨水。

实施例3

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，羟丁基壳聚糖的制备：

1.壳聚糖精制：将5g壳聚糖溶于250mL 1％的盐酸溶液中，搅拌下加入氢氧化钠溶液至反应液pH＝7，收集生成的絮状沉淀并水洗至中性后，用70％的乙醇脱盐三次，再用95％的乙醇脱盐3次，收集沉淀，放置于80℃烘箱中烘干，获得精制的壳聚糖。

2.壳聚糖碱化：将1g精制的壳聚糖分散在25mL质量浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，N₂气氛围中室温搅拌48h，获得碱化后的壳聚糖。

3.壳聚糖醚化：将碱化后的壳聚糖分散在水溶液中，搅拌48h后滴加25mL1，2-环氧丁烷，反应2h后移入70℃油浴锅中搅拌回流48h。反应结束后用盐酸溶液调节pH至7.5，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析96h后，滤去不溶物后冻干，获得羟丁基壳聚糖。

第二步，巯基修饰的透明质酸的制备：

1.将1g透明质酸粉末溶解在50mL水中，加入3g离子交换树脂，在30℃温度下搅拌24h后抽滤，用四丁基氢氧化铵溶液调节溶液pH＝7.5，-60℃冷冻干燥72h，获得四丁铵修饰的透明质酸。

2.将0.9g四丁铵修饰的透明质酸，1.4g 3，3’-二硫代丙酸，0.5g 4-二甲基氨基吡啶加入37.5mL无水二甲亚砜溶液中，N₂氛围中30℃搅拌溶解，加0.3mL二碳酸二叔丁酯溶液，继续搅拌反应30h，反应结束后透析72h，产物-60℃冷冻干燥72h，获得二硫代丙酸修饰的透明质酸。

3.取0.4g二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于三次水中，配成1％的二硫代丙酸修饰的透明质酸溶液，加入0.8g二硫苏糖醇和0.4g氯化钾，搅拌至溶解后，将反应液的pH值用氢氧化钠调至9.0，30℃搅拌4h后，加入固体氯化钾，使反应液中氯化钾的质量体积浓度增至6％，随后将反应液的pH值用盐酸溶液调至4.0。将反应溶液倒入预冷的无水乙醇中沉淀，离心清洗，沉淀放入真空干燥箱中干燥，并在-60℃冷冻干燥72h，获得巯基修饰的透明质酸。

第三步，二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备：

将0.1g巯基修饰的透明质酸溶解于5mL三次水中，获得A溶液；将0.9g二乙烯砜溶解于5mL三次水中，获得B溶液。将A溶液逐滴滴加入B溶液中，混合溶液用氢氧化钠水溶液调至pH＝7.5，在8℃水浴中搅拌3h后，产物用透析48h后冻干，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸。

第四步，羟丁基壳聚糖/透明质酸生物墨水的制备

将0.1g羟丁基壳聚糖和0.024g巯基修饰的透明质酸加入1.4mL磷酸缓冲溶液中，冰水浴中搅拌至溶解完全，待用。

将0.024g二乙烯砜基修饰的透明质酸加入0.6mL磷酸缓冲溶液中，搅拌溶解，待用。

将上述配置好的两种溶液混合均匀，获得3D打印生物墨水。

对照例1

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，巯基修饰的透明质酸的制备：

1.将1g透明质酸粉末溶解在50mL水中，加入2.5g离子交换树脂，搅拌12h后抽滤，用四丁基氢氧化铵溶液调节溶液pH＝7，冻干，获得四丁铵修饰的透明质酸。

2.将0.75g四丁铵修饰的透明质酸，1.2g 3，3’-二硫代丙酸，0.35g 4-二甲基氨基吡啶加入37.5mL无水二甲亚砜溶液中，N₂保护下室温搅拌溶解后，加0.2mL二碳酸二叔丁酯溶液，继续搅拌反应24h，反应结束后透析72h，冻干，获得中间产物二硫代丙酸修饰的透明质酸。

3.取0.4g二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于40mL三次水中，加入0.4g二硫苏糖醇和0.4g氯化钠，搅拌至溶解后，将反应液的pH值用氢氧化钠调至8.5，继续室温搅拌3h后，加入固体氯化钠，使反应液中氯化钠的质量体积浓度增至5％，随后将反应液的pH值用盐酸溶液调至3.5。将反应溶液倒入450mL预冷的无水乙醇中沉淀，离心除去无水乙醇，并用无水乙醇清洗两次，沉淀放入真空干燥箱中干燥。接着用30mL三次水溶解，并冷冻干燥，获得巯基修饰的透明质酸。

第二步，二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备：

将0.1g巯基修饰的透明质酸溶解于5mL三次水中，获得A溶液；将0.7g二乙烯砜溶解于5mL三次水中，获得B溶液。将A溶液逐滴滴加入B溶液中，混合溶液用0.1M氢氧化钠水溶液调至pH＝7，在冰浴中搅拌2h后，产物用三次水透析72h后冻干，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸。

第三步，生物墨水的制备

将0.006g巯基修饰的透明质酸，在冰水浴中搅拌溶解完全，待用。

将0.006g二乙烯砜基修饰的透明质酸加入0.6mL磷酸缓冲溶液中，搅拌溶解，待用。

将上述配置好的两种溶液混合均匀，获得3D打印生物墨水。

本对照例最终所获3D打印生物墨水固化速度慢，在打印过程中不易快速成型，不能用于生物3D打印构建支架。

对照例2

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，羟丁基壳聚糖的制备：

1.壳聚糖精制：取5g壳聚糖，溶于250mL 1％的盐酸溶液中，滤去不溶物，搅拌下加入1mol/L氢氧化钠溶液至反应液pH＝8，收集生成的絮状沉淀，水洗至中性后，用250mL70％的乙醇脱盐三次，再用250mL95％的乙醇脱盐3次，抽滤收集沉淀，放置于80℃烘箱中烘干，从而获得精制的壳聚糖。

2.壳聚糖碱化：将1g精制的壳聚糖分散在20mL质量浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，N₂气氛中室温条件下搅拌24h。反应结束后过滤并挤出多余的碱液，获得碱化的壳聚糖。

3.壳聚糖醚化：将碱化后的壳聚糖分散在10mL异丙醇和10mL水的混合溶液中，搅拌24h后滴加20mL 1，2-环氧丁烷，反应1h后移入60℃油浴锅中搅拌回流24h。反应结束后用10％盐酸溶液调节pH＝7，用截留分子量8000～14000的透析袋透析72h，除去未反应的反应物和生成的盐。滤去不溶物后冻干，获得羟丁基壳聚糖。

第二步，二乙烯砜基修饰的透明质酸的制备：

将0.1g巯基修饰的透明质酸溶解于5mL三次水中，获得A溶液；将0.7g二乙烯砜溶解于5mL三次水中，获得B溶液。将A溶液逐滴滴加入B溶液中，混合溶液用0.1M氢氧化钠水溶液调至pH＝7，在冰浴中搅拌2h后，产物用三次水透析72h后冻干，获得二乙烯砜基修饰的透明质酸。

第三步，羟丁基壳聚糖/透明质酸生物墨水的制备

将0.06g羟丁基壳聚糖加入1.4mL磷酸缓冲溶液中，在冰水浴中搅拌至溶解完全，待用。

将0.006g二乙烯砜基修饰的透明质酸加入0.6mL磷酸缓冲溶液中，搅拌溶解，待用。

将上述配置好的两种溶液混合均匀，获得3D打印生物墨水。

本对照例最终所获3D打印生物墨水在打印过程中所构建的支架力学性能较差，支架结构易坍塌。

对照例3

一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水的制备方法的具体步骤如下：

第一步，羟丁基壳聚糖的制备：

1.壳聚糖精制：将5g壳聚糖溶于250mL 1％的盐酸溶液中，搅拌下加入氢氧化钠溶液至反应液pH＝7，收集生成的絮状沉淀并水洗至中性后，用70％的乙醇脱盐三次，再用95％的乙醇脱盐3次，收集沉淀，放置于80℃烘箱中烘干，获得精制的壳聚糖。

2.壳聚糖碱化：将1g精制的壳聚糖分散在20mL质量浓度为50％的氢氧化钠水溶液中，N₂气氛围中室温搅拌24h，获得碱化后的壳聚糖。

3.壳聚糖醚化：将碱化后的壳聚糖分散在10mL异丙醇和10mL水的混合溶液中，搅拌24h后滴加20mL 1，2-环氧丁烷，反应1h后移入60℃油浴锅中搅拌回流24h。反应结束后用盐酸溶液调节pH至中性，用截留分子量8000～14000的透析袋透析72h后，滤去不溶物后冻干，获得羟丁基壳聚糖。

第二步，巯基修饰的透明质酸的制备：

1.将1g透明质酸粉末溶解在50mL水中，加入2.5g离子交换树脂，在20℃温度下搅拌12h后抽滤，用四丁基氢氧化铵溶液调节溶液pH＝7，-50℃冷冻干燥48h，获得四丁铵修饰的透明质酸。

2.将0.75g四丁铵修饰的透明质酸，1.2g 3，3’-二硫代丙酸，0.35g 4-二甲基氨基吡啶加入37.5mL无水二甲亚砜溶液中，N₂氛围中25℃搅拌溶解，加0.2mL二碳酸二叔丁酯溶液，继续搅拌反应24h，反应结束后透析72h，产物-50℃冷冻干燥48h，获得二硫代丙酸修饰的透明质酸。

3.取0.4g二硫代丙酸修饰的透明质酸溶于三次水中，配成1％的二硫代丙酸修饰的透明质酸溶液，加入0.4g二硫苏糖醇和0.4g氯化钠，搅拌至溶解后，将反应液的pH值用氢氧化钠调至8.5，25℃搅拌3h后，加入固体氯化钠，使反应液中氯化钠的质量体积浓度增至5％，随后将反应液的pH值用盐酸溶液调至3.5。将反应溶液倒入预冷的无水乙醇中沉淀，离心清洗，沉淀放入真空干燥箱中干燥，获得巯基修饰的透明质酸。

第三步，羟丁基壳聚糖/透明质酸生物墨水的制备

将0.06g羟丁基壳聚糖和0.006g巯基修饰的透明质酸加入1.4mL磷酸缓冲溶液中，获得3D打印生物墨水。

本对照例最终所获3D打印生物墨水在打印过程中所构建的支架力学性能较差，支架结构易坍塌。

通过实施例1-3，可以发现，藉由本发明的上述技术方案获得的用于脊髓损伤修复的新型3D打印生物墨水体系中，可用于干细胞的生物3D打印，打印条件温和，一方面利用羟丁基壳聚糖的温敏性能使生物墨水在细胞培养温度下(37℃)能够快速固化成胶(固化时间低于20秒)，另一方面利用巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸之间可发生二次自交联，发生迈克尔加成反应，使水凝胶在没有交联剂的处理下自动实现打印后的二次固化，进一步提高水凝胶支架力学强度。三组分结合使得该生物墨水在打印过程既能确保支架结构快速固化成型，又能使所打印的3D支架结构更加稳固，不易塌陷；并且，本发明的生物墨水适合于装载神经干细胞的生物3D打印，打印成型后所获得的复合水凝胶支架力学强度可与脊髓组织匹配，并具有良好的生物相容性，有利于神经干细胞的黏附、增殖、生长和神经元分化，可以促进脊髓损伤的修复。此外，该生物墨水可通过改变巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸的比例调控水凝胶支架的力学强度，从而与不同软组织器官的力学性能匹配，可构建用于不同软组织器官修复的3D打印支架。

此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其他原料和条件进行了实验，并同样制得了打印条件温和，并具有良好的生物相容性的可用于脊髓损伤修复的新型3D打印生物墨水。

本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。