具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

膜的检测

一:XRD机、FTIR光谱仪

采用RINT 2500V XRD机 、傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪进行样品的检测，图1显示了Gel-CHA00和Gel-CHA05支架的FTIR光谱。对于Gel-CHA05，在波长为 3424cm-处出现的吸收峰与-OH 基团的伸缩振动有关；1638-1655cm-处的酰胺Ⅱ带是 C=O 键的伸缩振动引起的。在 1034cm-处有PO4-基团 V3 的特征吸收峰，在 565cm-和 605cm-处出现 HA 中的磷酸根 P-O 键的弯曲振动引起的吸收峰，表明复合材料表面有 HA的存在。在 1334 cm-处出现吸收峰表明 HA-Gel 复合物中 Gel 的羧基与 HA 的钙离子之间有 Ca-COO 化学键形成因此，FTIR光谱证实，在明胶系统内部涉及化学湿法沉淀的Gel-CHA05支架合成过程中，CHA完全形成。

二、有无细胞毒性

细胞接种

①将支架放置在六孔板中，并在细胞接种之前浸入4 ml体积的完全生长培养基中1小时，以实现最佳溶胀；

②1小时后将细胞接种到2个实验组中：在无支架的培养基和含Gel-CHA05的培养基中进行细胞培养，每个孔板含1×10⁵个细胞；

③每两天收集一次培养基用于进一步分析，并替换为新鲜培养基。

膜的生理特性：

1：细胞相容性（MTT/CCK-8）

①将纳米纤维膜切成直径为15 mm的圆形，厚度为0.043 mm，并放入24孔板中，以在细胞接种之前在UV辐射下灭菌6 h;

②将MSC（2×10⁴个细胞/孔）接种到膜上进行细胞增殖和粘附测定;

③培养3、7和14天后，通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四溴化铵（MTT）法（n= 3）测试细胞增殖并通过酶标仪，波长为490 nm。

2、检测细胞凋亡：

①将1×10⁵MSCs /孔接种到6孔板的纳米纤维膜上；

②然后培养3天，然后用Annexin V-EGFP / PI细胞凋亡试剂盒（KeyGEN BioTECH，南京，中国）分析（n= 3）。在流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）下评估结果；

3、通过SEM观察培养的MSC的形态。

实时PCR

通过定量聚合酶链反应（qPCR）确定Runt相关转录因子2（RUNX2，胶原蛋白α1（COL1A1）和骨桥蛋白（OPN）的成骨基因表达。使用甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为管家基因。简要地，收获细胞，分离总RNA；进行cDNA合成；基于ΔΔCq方法根据通过RT-PCR获得的定量循环（Cq）值计算相对基因表达。对每个样品进行三个独立的PCR反应。

1. RNA抽提

方法：TRlzol法。主要成分：苯酚（具有裂解细胞和变性蛋白的作用）。

RNA抽提前准备：试剂耗材准备（注意RNase free）、样品的准备。

步骤：样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min；4℃低温离心（12 000g×20min）；400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10min；4℃低温离心（12 000g×20min）；75%乙醇冲洗；晾干沉淀，DEPC-treated水溶解。

2. RNA 质量检测

方法：分光光度计测定、凝胶电泳法

3. 反转录

这个过程中根据不同的情况选择不同的反转录引物：

1. Oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

2. 随机引物（random primer）: 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。

3. 特异性引物（Specific primer）:与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

4. PCR程序（三步法）

第一步：94℃变性30s；

第二步（循环30-35次）：94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（时间按照合成速度和长度来计算）；

第三步：72℃终止延伸5-10min。

5. 引物

引物设计步骤：

找到目的基因的CDs序列（存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计）；用软件设计和评价引物（Oligo软件）；blast引物特异性。

要求：

引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。

6. PCR酶：可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。

7. PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。

8. PCR产物检测：一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

Western Blod

检测蛋白：RUNX2，胶原蛋白α1（COL1A1，）和骨桥蛋白（OPN，）的成骨基因表达。使用甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参 。

操作步骤：

①样品中蛋白提取及蛋白浓度测定（含三类样品和两种蛋白浓度测定方法）；收集蛋白样品(Proteinsample preparation)：（1）倒掉细胞培养瓶中的培养液，尽量倒干净，可用移液枪轻轻吸走残余培养液，操作时间宜迅速；（2）每瓶细胞加3ml-4ml 4℃预冷的PBS（磷酸缓冲盐溶液）（0.01M pH7.2-7.3）。平放“十字”轻轻摇动1min洗涤，弃去洗涤液，重复三次。PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（苯甲基磺酰氟）（100mM），摇匀置于冰上，PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要反复摇动；（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作迅速），然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中（全程宜在冰上操作）；（6）将离心管于4℃下12000rpm离心5min（提前预冷离心机）；（7）将离心后的上清液分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃冰箱保存。

以上步骤可简单概述为：收集细胞、裂解细胞、离心取上清、保存

注意：不同公司裂解液可能有不同的使用方法（3）（4）步骤请根据实际购买裂解液说明书操作。1M指1mol/L

②配胶上样及电泳；

(1) 清洗玻璃板，组装电泳槽，即将玻璃板对齐后用夹卡紧。然后垂直放在架子上准备灌胶；（2）配分离胶（分子量越大，胶浓度越小），大致可参考下表配方1，根据蛋白分子量大小选择不同浓度的胶，先加入ddH2O(双蒸水),之后每加一种成分都要搅拌均匀。AP（过硫酸铵）、TEMED（四甲基乙二胺）最后加。此处以12%分离胶15ml为例，参见配方2；(3) 配好分离胶后，进行灌胶。用10ml移液枪吸取5ml胶沿玻璃注入，待胶面升到绿带中间线高度时即可。用移液枪或注射针垂直于玻璃板水平移动加入ddH2O(或异丙醇)，使得胶平整，凝固加快；（4）配制4%的浓缩胶,参见配方3；待到板内胶凝固，倒掉上层液体，适当倾斜装置，用滤纸吸干多余水分。灌入浓缩胶，水平插入梳子（注意不要有气泡），等到胶凝固，约半个小时。将内槽从制胶器上解下装入外槽，加好上腔液和下腔液（电泳缓冲液）然后轻轻向上拔出梳子（最好在加入电泳液后再拔梳子，不要干拔）；(5) 测定好蛋白含量的蛋白上清液以最低蛋白浓度的样品为参照，将所有样品蛋白浓度调到一致（有的实验室用裂解液调浓度，有的用buffer调浓度，有的用其他试剂来调浓度。根据自身实际情况选择），按照上样缓冲液说明书加入一定量的上样缓冲液（缓冲液中一般含指示剂，如溴酚兰），沸水浴或者加热到98℃-100℃处理5分钟使蛋白变性。待冷却后可以准备上样。

注意：上样缓冲液一般有2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。如果最低浓度过小，我们可以选择5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。另外，水浴或者加热后有的实验室会进行离心操作，按实际情况选择。

配方1 不同浓度SDS-PAGE分离胶最佳分离范围

配方2 12%分离胶15ml各组分取样量

配方3 4%的浓缩胶各组分取样量

2.2上样：

（1）先上Marker(4ul-5ul)根据说明书选择量的大小（Marker的作用是显示不同分子量蛋白的位置），然后按顺序加样品到后续孔中，样品量一般10-15ul,不能超过20ul.；（2）盖好电泳仪盖子，连接电源，注意正负极不要接反了。恒压80V，当样品到下层胶后换成120V.溴酚兰指示剂到分离胶底部（距底部1CM左右）时停止电泳。

③转膜 ；以前转膜通常都要切胶，切下我们目的蛋白位置的胶，其他的丢弃。现在逐渐推广整块胶来转膜（当然，真正这么做的实验室还不是很多）。

3.1切胶：

首先，计算好要切的胶的长度和宽度，剪下相同长宽的NC膜。然后准备滤纸，滤纸要比NC膜长和宽大一点，浸泡于转膜液中，可以用中性笔在NC膜的左上角做一个标记，镊子夹取尽量夹边缘。结合Maker位置，根据目的蛋白分子量大小，切下合适大小的胶，泡在转膜液中。

3.2制作“三明治”

在加有电转液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将转膜的夹子打开，注意要正确放置，一般带有颜色的是让黑的一面保持水平（根据实验室器材实际情况正确使用），垫上一张专用泡沫垫，用玻璃棒来回擀，去除气泡。按下列顺序装配：

3.3 开始转膜

把制作好的“三明治”用夹子夹好，装入转膜仪中。红色（白色）对红色，黑色对黑色，因为电转过程中会有热量产生，注意在转膜仪周围加入碎冰和水来降温。一般用恒流电（如100mA或350mA,根据实验室转膜仪规格选择相应电流）。转移结束后，取出NC膜。

3.4 丽春红染色

将转好后的膜用丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用双蒸水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。注意：丽春红染色主要是观察蛋白转膜成功没有，丽春红染色是可逆的，可以用适当溶液冲洗掉（如PBS溶液）。

④封闭 ；

将膜用TBS（TRIS-HCL缓冲液）从下向上浸湿后，移至含有封闭液的容器中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。然后将NC膜从封闭液取出，用TBS洗膜两次（也可以不用TBS洗涤，用吸水滤纸吸干残留液即可）。

注意：封闭液可以向试剂公司购买，当然也可以用脱脂奶粉配成封闭液（在TBST溶液（TBS加吐温-20）加入5%脱脂奶粉）进行封闭。

⑤一抗孵育 ；

5.1孵育

准备好抗体，用TBST按需求稀释好抗体（如抗体原液和TBST比例为1:500），将稀释好的一抗和NC膜一起孵育，每条膜加入2ml左右稀释后的抗体，4℃过夜（为节省成本，一抗可以回收使用，直至无法孵出抗体）。

5.2洗涤：

将膜从一抗液中取出，放入新鲜的TBST溶液（每条膜加2ml）,在摇床上快速摇动5min，共重复洗涤五次（或者共洗3次，每次10分钟）。

⑥二抗孵育 ；

二抗和TBST比例常见的有1:1000和1:5000，按照需要稀释。将膜放入二抗孵育1小时（有的实验室也孵育2小时，根据实际情况选择）。

注意:二抗常常偶联碱性磷酸酶，二抗来源应和一抗相匹配，即可特异性结合。

洗涤：将膜从二抗中取出，放入新鲜的TBST溶液（每条膜加2ml）,在摇床上快速摇动5min，共重复洗涤五次（或者共洗3次，每次10分钟）。

⑦显色曝光(两种方式)括传统的暗室显色和仪器曝光机两种方式。

7.1暗室显色：

（1）将发光液A和B在保鲜膜上1:1混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液（每条膜80-100ul）充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中；（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；打开红灯，在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min（20-25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。将曝光好的胶片用扫描仪扫描，用图像处理系统进行灰度值分析

7.2仪器显色曝光：

配方：

folin—酚试剂法配方

试剂甲：包括（a）和（b）液，其中，（a）10 g Na₂CO₃，2 g NaOH和0.25 g酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆-4H₂O）。溶解于500毫升蒸馏水中；（b）0.5 g硫酸铜（CuSO₄-5H₂O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100 g钨酸钠（Na₂WO₄-2H₂O），25 g钼酸钠（Na₂MOO₄-2H₂O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150 g硫酸锂（Li₂SO₄），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1 N（H+浓度为1mol/L）左右。（实验中所需标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或 G-球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9% NaCl溶液）

茜素红染色

目的：使用茜素红染色（ARS，Sigma-Aldrich）定量和定性评估了工程化膜的矿化潜力。

步骤：

①以每膜1×10⁴的密度播种MSC，每3天用新鲜培养基替换培养基；

②在第14天和第21天，将细胞用PBS（2x）洗涤；

③并在室温下于4％甲醛中固定30分钟；

④然后再用PBS（2x）洗涤20分钟；

⑤然后将细胞用40 mM ARS染色，并将板在室温下孵育30分钟；

⑥用去离子水（4x）洗涤，干燥并用Epson Perfection V50照片扫描仪进行扫描并转换成二进制图像；

⑦之后，使用10％乙酸和氢氧化铵对ARS进行脱色；

⑧等分试样的吸光度（使用酶标仪（Spectra iD3））在405nm下测量上清（μL）。

微型计算机断层扫描（micro-CT）

分析缺损周围每个标本的关注区域（ROI），以计算组织体积（TV），骨体积（BV）和骨体积分数（BVF，BV/TV）。

组织学分析

用10％的甲酸溶液将骨样品脱钙。脱钙后的样品按升序进行脱水，然后渗透并用石蜡包埋，然后切成4μm的切片。将切片用苏木精和曙红（H＆E）或Masson三色染色以进行显微镜检查。用装有数码相机的光学显微镜观察染色的切片。H＆E染色显示表明骨形成的细胞反应；Masson的三色染色用于鉴定矿化的骨（蓝色）和类骨质（红色），结果见图5。

细胞培养

买兔子原代BMSC。然后，将细胞在补充有10％胎牛血清的α-MEM中于37°C培养。每三天更换一次介质。细胞达到90％汇合后，将其用胰蛋白酶消化以进行传代。将第三次BMSC传代与荧光标记的抗体（Beyotime，上海，中国）孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术检测包括CD29，CD90，CD11b和CD45在内的不同细胞表面标志物的表达水平。来自第三代的细胞用于随后的实验。（自行分离：无菌条件下取幼年7月龄新西兰大白兔雄性，剔除周围筋肉，剪开两端，用无菌注射器吸10％胎牛血清的α-MEM反复冲洗骨髓腔，培养冲洗液，条件同细胞培养条件），结果见图3。

动物模型

7月龄新西兰大白兔雄性（2.5-3.5kg），并使其在无病原体的条件下饲养。为了评估胶原+支架的骨修复能力，采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，剂量3mg/kg，碘伏消毒3便后普手术单，沿股骨远端外侧做2-3cm长纵行切口，暴露股骨远侧端部位，在每只大兔股骨远端关节面3-4mm为股骨髁中心，使用电钻钻出直径6mm，深度8mm的圆柱形骨缺损空洞，生理盐水冲洗，分别做一下处理，①骨缺损组；②骨缺损+胶原+支架；③骨缺损+支架。在钻孔后第4和8周对每组的2只处死。收集各组大鼠外周血，通过ELISA检测骨桥蛋白（OPN），骨钙蛋白（BGP）（备用）。所有测试均按照制造商的说明进行。收集股骨，行micro—CT检测后脱钙，进行组织学检测。（如做股骨头坏死，换部位即可）。结果见图2。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。