一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法
阅读说明：本技术 一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法 (Method for quantitatively detecting collagen protein by adopting fluorescence spectrum ) 是由 李从虎 吴彦 龙槿彦 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法,涉及胶原蛋白检测技术领域,本发明包括以下步骤：(1)将含有胶原类蛋白的原料粉碎后匀浆,在4℃条件下加入胃蛋白酶作用24h,然后经离心、盐析、透析处理后,冷冻干燥制得胶原类蛋白；(2)将胶原溶于0.1mol/L醋酸水溶液中,制成不同浓度梯度的胶原类蛋白溶液；(3)对胶原类蛋白溶液进行荧光扫描,绘制标准曲线；(4)将含有胶原蛋白的待测样品溶于0.1mol/L醋酸中,进行荧光扫描,将测得的吸收峰强度与标准曲线进行比对,即测得待测样品中胶原类蛋白的含量。本发明的有益效果在于：该方法具有准确、快速、灵敏和重现性好的优点,符合准确定量的要求。(The invention discloses a method for quantitatively detecting collagen by adopting fluorescence spectrum, relating to the technical field of collagen detection and comprising the following steps: (1) pulverizing raw materials containing collagen, homogenizing, adding pepsin at 4 deg.C for 24 hr, centrifuging, salting out, dialyzing, and freeze drying to obtain collagen; (2) dissolving collagen in 0.1mol/L acetic acid water solution to prepare collagen protein solutions with different concentration gradients; (3) performing fluorescence scanning on the collagen solution, and drawing a standard curve; (4) and dissolving a sample to be detected containing collagen in 0.1mol/L acetic acid, performing fluorescence scanning, and comparing the measured absorption peak intensity with a standard curve to obtain the content of the collagen in the sample to be detected. The invention has the beneficial effects that: the method has the advantages of accuracy, rapidness, sensitivity and good reproducibility, and meets the requirement of accurate quantification.)
技术领域
本发明涉及胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法。
背景技术
胶原作为细胞外基质(ECM)的主要成分，是一种广泛分布于动物有机体皮肤、肌腱、软骨和血管等器官和组织中的天然大分子蛋白质，对动物的机体和器官起着支撑和保护的作用，其含量约占动物机体总蛋白质的三分之一。胶原具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等特点，使其在组织工程、生物医药和食品等领域具有重要的应用。
目前对蛋白质的定量检测方法已有相关报道，如TNBS法、Lorry法和Bergman法。但是对于胶原类蛋白质含量的专一性的检测方法尚未系统报道，仅以相关蛋白质的检测方法为标准进行检测，且这些方法具有操作繁琐、灵敏度较低的缺陷，如TNBS法是以检测自由氨基的量转换为胶原的含量的一种检测方法，该法要求物质纯度较高，且全程避光试验，导致试验结果经常出现误差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中胶原类蛋白质的定量检测方法容易出现误差，提供一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种采用荧光光谱定量检测胶原类蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将含有胶原类蛋白的原料粉碎后匀浆，在4℃条件下加入胃蛋白酶作用24h，然后经离心、盐析、透析处理后，冷冻干燥制得胶原类蛋白；
(2)将胶原溶于0.1mol/L醋酸水溶液中，制成不同浓度梯度的胶原类蛋白溶液，于4℃条件下静置24h；
(3)对步骤(2)中不同浓度梯度的胶原类蛋白溶液进行荧光扫描，以胶原类蛋白溶液浓度为横坐标，以最大吸收峰强度为纵坐标，绘制标准曲线；
(4)将含有胶原蛋白的待测样品按照步骤(1)处理后，溶于0.1mol/L醋酸中，于4℃条件下静置24h后，进行荧光扫描，将测得的吸收峰强度与标准曲线进行比对，即测得待测样品中胶原类蛋白的含量。
有益效果：本发明以不同浓度的胶原类蛋白样品在荧光光谱的测试条件下绘制标准曲线，计算出线性回归方程，同时，以同样方法提出和纯化出待测样品，通过线性回归方程得到待测样品的浓度，该方法具有准确、快速、灵敏和重现性好的优点，符合准确定量的要求。
优选地，所述步骤(1)中的胶原类蛋白包括胶原、明胶或胶原衍生物。
优选地，所述步骤(1)中含有胶原类蛋白的原料包括牛皮、猪皮或鱼皮等。
优选地，所述步骤(2)中胶原类蛋白溶液的浓度为0.1-1.0mg/mL。
优选地，所述步骤(3)中荧光扫描的步骤包括：将静置的胶原类蛋白溶液移至四通石英比色皿中，20℃下恒温30min，采用荧光光度计扫描样品，激发波长范围是250-280nm，扫描范围为235-450nm，狭缝宽度为1-10nm。
优选地，采用荧光光度计扫描样品，激发波长范围是253nm，扫描范围为235-450nm，狭缝宽度为5nm。
优选地，所述步骤(3)中荧光扫描的步骤包括：将静置的胶原类蛋白溶液移至四通石英比色皿中，20℃下恒温30min，采用荧光光度计扫描样品，激发波长与发射波长差的范围为10-30nm，扫描范围为240-400nm，狭缝宽度为1-10nm。
优选地，采用荧光光度计扫描样品，激发波长与发射波长差的范围为30nm，扫描范围为240-400nm，狭缝宽度为5nm。
有益效果：胶原类蛋白溶液的波长差30nm的荧光光谱在275nm处有荧光吸收峰，对荧光强度进行拟合后，荧光强度拟合的线性良好，相关系数接近于1。
优选地，在步骤(3)进行荧光扫描过程中添加外源荧光探针，所述外源荧光探针为8-苯胺基萘-1-磺酸或芘。
有益效果：本发明以胶原、明胶及其衍生物的内源荧光氨基酸和外源探针为基础，较系统的、全面的采用荧光光谱法对其进行定量检测，为研究胶原类蛋白质奠定了一定的基础。
优选地，所述外源荧光探针为8-苯胺基萘-1-磺酸，荧光测试条件为激发波长为300-400nm，发射波长400-650nm，狭缝宽度为1-10nm。
优选地，所述外源荧光探针为芘，将芘溶解于无水乙醇得到1.0×10-4mol/L的芘乙醇溶液，将0.1mL的芘乙醇溶液与10mL不同浓度的胶原类蛋白溶液混合后，挥发掉混合液中的乙醇，然后采用荧光光度计扫描样品，扫描条件为：激发波长335nm，发射波长扫描范围350-450nm。狭缝宽度为1-10nm。
本发明的优点在于：利用本发明所优化的方法，以不同浓度的胶原类蛋白质样品在荧光光谱的测试条件下制作标准曲线，计算出线性回归方程。同时，以同样方法提取和纯化出待测样品，通过线性回归方程得到待测样品的浓度。该方法具有准确、快速、灵敏和重现性好的优点，符合准确定量的要求。
附图说明
图1为本发明实施例1中胶原在激发波长253nm处的荧光光谱图；
图2为本发明实施例1中胶原溶液的标准曲线图；
图3为本发明实施例2中胶原在波长差30nm的同步荧光光谱图；
图4为本发明实施例2中胶原溶液的标准曲线图；
图5为本发明实施例3中胶原在外源探针ANS下的荧光光谱图；
图6为本发明实施例3中胶原溶液的标准曲线图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
采用固定波长荧光扫描测定牛皮中的胶原含量
(1)取新鲜牛皮，脱脂、脱毛后水洗，再切成碎块匀浆；称取10g匀浆，加入300mL0.5mol/L的醋酸和0.1g的胃蛋白酶(活力值为1:10000)，在4℃下作用48h后，以10000rpm速度离心15min。取上清液用NaCl盐析至浓度为3mol/L。将沉淀样品再次溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，再用0.7mol/L的NaCl进行盐析。将沉淀再次溶解于0.5mol/L的醋酸中，用0.1mol/L的醋酸溶液透析3d。最后，将样品用冷冻真空干燥机(-55℃)冷冻48h，并在4℃下保存备用；
(2)取步骤(1)中制得的胶原溶解于0.1mol/L的醋酸水溶液中，制备成0.1-0.9mg/mL的胶原溶液，在4℃下静置24h；
(3)将静置的胶原溶液移至四通石英比色皿中，20℃下恒温30min，用荧光光度计扫描样品。扫描条件为：激发波长与发射波长的波长差为30nm，扫描范围为240-350nm。激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5nm。以胶原溶液浓度为横坐标，最大发射波长吸收峰强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算出线性回归方程。
(4)按照步骤(1)中提取出三种不同浓度的待测胶原溶液，分别以荧光光谱技术和TNBS法测定待测样品的浓度，同时以荧光光谱技术检测待测样品的重复性。
胶原溶液的标准曲线如图2所示，图1为胶原在激发波长253nm处的荧光光谱，胶原溶液在激发波长253nm时出现了两个荧光峰，分别为于278nm和295nm。在278nm处，对其荧光强度进行拟合，其回归线方程为Y＝4.08+31.44X，R2＝0.996；在295nm处，对其荧光强度进行拟合，其回归线方程为Y＝-1.28+42.23X，R2＝0.995。两处荧光强度拟合的线性良好，相关系数均接近于1，表明其可以作为标准曲线检测胶原样品的浓度。以该法测定3种不同浓度的待测样品并与TNBS法进行比较(表1)，发现测定结果与已知方法结果相近，表明准确度较高；此外标准偏差均低于10％，表明该法重复性较好。
实施例2
采用同步荧光光谱扫描测定牛皮中的胶原含量
(1)取新鲜牛皮，脱脂、脱毛后水洗，再切成碎块匀浆；称取10g匀浆，加入300mL0.5mol/L的醋酸和0.1g的胃蛋白酶(活力值为1:10000)，在4℃下作用48h后，以10000rpm速度离心15min。取上清液用NaCl盐析至浓度为3mol/L。将沉淀样品再次溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，再用0.7mol/L的NaCl进行盐析。将沉淀再次溶解于0.5mol/L的醋酸中，用0.1mol/L的醋酸溶液透析3d。最后，将样品用冷冻真空干燥机(-55℃)冷冻48h，并在4℃下保存备用；
(2)取步骤(1)中制得的胶原溶解于0.1mol/L的醋酸水溶液中，制备成0.2-0.6mg/mL的胶原溶液，在4℃下静置24h；
(3)将静置的胶原溶液移至四通石英比色皿中，20℃下恒温30min，用荧光光度计扫描样品。扫描条件为：激发波长与发射波长的波长差为30nm，扫描范围为240-350nm。激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5nm。以胶原溶液浓度为横坐标，最大吸收峰强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算出线性回归方程。
(4)按照步骤(1)中提取出三种不同浓度的待测胶原溶液，分别以荧光光谱技术和TNBS法测定待测样品的浓度，同时以荧光光谱技术检测待测样品的重复性。
胶原的标准曲线如图4所示，图3为胶原在波长差30nm的同步荧光光谱，在位于275nm处出现了荧光吸收峰，对其荧光强度进行拟合，其回归线方程为Y＝7.97+91.17X，R2＝0.994，荧光强度拟合的线性良好，相关系数均接近于1，表明其可以作为标准曲线检测胶原样品的浓度。以该法测定3种不同浓度的待测样品并与TNBS法进行比较(表1)，发现测定结果与已知方法结果相近，表明准确度较高；此外标准偏差均低于10％，表明该法重复性较好。
实施例3
采用外源荧光探针法测定牛皮中的胶原含量
(1)取新鲜牛皮，脱脂、脱毛后水洗，再切成碎块匀浆；称取10g匀浆，加入300mL0.5mol/L的醋酸和0.1g的胃蛋白酶(活力值为1:10000)，在4℃下作用48h后，以10000rpm速度离心15min。取上清液用NaCl盐析至浓度为3mol/L。将沉淀样品再次溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，再用0.7mol/L的NaCl进行盐析。将沉淀再次溶解于0.5mol/L的醋酸中，用0.1mol/L的醋酸溶液透析3d。最后，将样品用冷冻真空干燥机(-55℃)冷冻48h，并在4℃下保存备用；
(2)取步骤(1)中制得的胶原溶解于0.1mol/L的醋酸水溶液中，制备成0.2-0.6mg/mL的胶原溶液，在4℃下静置24h；
(3)将8-苯胺基萘-1-磺酸(ANS)溶解于0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)得到浓度为8mmol/L的ANS溶液。将2mL的胶原溶液与20μL的ANS溶液混合均匀，静置10min后，用荧光分光光度计记录20℃下的荧光光谱。激发波长为380nm，发射波长为400-650nm。激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5nm。以胶原溶液浓度为横坐标，最大吸收峰强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算出线性回归方程。
(4)按照步骤(1)中提取出三种不同浓度的待测胶原溶液，分别以荧光光谱技术和TNBS法测定待测样品的浓度，同时以荧光光谱技术检测待测样品的重复性。
胶原溶液的标准曲线如图6所示，图5为胶原在外源探针ANS下的荧光光谱，在位于521nm处出现了荧光吸收峰，对其荧光强度进行拟合，其回归线方程为Y＝16.94+14.5X，R2＝0.975，荧光强度拟合的线性良好，相关系数均接近于1，表明其可以作为标准曲线检测胶原样品的浓度。以该法测定3种不同浓度的待测样品并与TNBS法进行比较(表1)，发现测定结果与已知方法结果相近，表明准确度较高；此外标准偏差均低于10％，表明该法重复性较好。
表1为实不同浓度的待测样品并与TNBS法进行比较结果
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。