一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料
阅读说明：本技术 一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料 (Surface-enhanced Raman scattering magnetic composite nano material for detecting cancer cells ) 是由 薛婷 沈折玉 吴爱国 李勇 于 2019-02-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料。所述复合纳米材料包括：作为核心的磁性纳米粒子,所述磁性纳米粒子表面组装有贵金属纳米粒子；贵金属纳米粒子,所述贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面；拉曼信号分子,所述拉曼信号分子固定于所述贵金属纳米粒子表面；亲水性高分子或生物大分子,所述亲水性高分子或生物大分子包裹在所述贵金属纳米粒子的表面；和位于表层的靶分子,所述靶分子偶联于所述亲水性高分子或生物大分子表面,且与待测物具有特异性相互作用。所述复合纳米材料可有效实现癌细胞的检测和分离。(The invention relates to a surface-enhanced Raman scattering magnetic composite nano material for detecting cancer cells. The composite nanomaterial comprises: the magnetic nano-particles are used as cores, and the surfaces of the magnetic nano-particles are assembled with noble metal nano-particles; the noble metal nano particles are assembled on the surfaces of the magnetic nano particles; a Raman signal molecule fixed on the surface of the noble metal nanoparticle; the hydrophilic polymer or the biological macromolecule is coated on the surface of the noble metal nano particle; and the target molecules are positioned on the surface layer, coupled to the surfaces of the hydrophilic macromolecules or the biological macromolecules and have specific interaction with the object to be detected. The composite nano material can effectively realize the detection and separation of cancer cells.)
技术领域
本发明涉及材料领域，具体地涉及一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料。
背景技术
当肿瘤发展到特定阶段，癌细胞会脱落并进入血液，形成循环肿瘤细胞(CTC)。当CTC被输送到远端组织并适应新的环境时，癌症便发生了转移[Cell 2006,127,679-695]。这是导致大部分癌症病人死亡的主要原因。血液中CTC的浓度可反映肿瘤的发展程度[Nature 2007,450,1235-1239]。临床研究已经证实，当肿瘤只有1～2mm时，常规方法(如影像学诊断)无法检测到肿瘤，然而可在血液中检测到CTC[Chin J Cancer Res 2012,24,403-407]。癌症的确诊一般通过侵入性活检进行，该方法存在取样偏倚、深层肿瘤取样困难、对患者造成伤害等问题[BJU Int2011,108,171-178；Theranostics 2016,6,1425-1439]。而CTC的检测对患者无损伤性、取样简单，对患者体外早期诊断、愈后及存活时间判断、快速判断治疗效果、体内耐药性检测、个体化治疗、肿瘤复发检测等具有重要意义[Theranostics 2017,7,2606-2019；J Clin Oncol 2018,36,2353-2354；CancerMetastasis Rev 2012,31,663-71]。
目前，CTC检测技术包括密度梯度沉淀法、尺寸排除过滤法、自驱动微型机、磁珠和微流控芯片等[Chem Soc Rev 2017,46,2038-2056]。CTC在血液中数目极少(5.0×109个红细胞与1.0×107个白细胞中只有几个CTC)，因此CTC的检测需要超灵敏的方法。表面增强拉曼散射(SERS)利用贵金属纳米粒子的独特性质，可用于分子水平的表征，是检测CTC的最佳手段之一[Nat Mater2017,16,918–924]。
但是，现有的利用SERS技术检测CTC的方法多存在无法同时实现CTC的有效检测和分离的问题，即无法以一种材料实现CTC数目的检测和从血液中分离出癌细胞以进行下一步的分子分型表征、定量聚合物酶链反应(PCR)、全基因组测序以及移植研究等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效实现癌细胞的检测和分离的复合纳米材料及其制备方法和其在检测和分离癌细胞方面的用途。
本发明的第一方面，提供了一种复合纳米材料，所述复合纳米材料包括：
1)作为内核的磁性纳米粒子；
2)贵金属纳米粒子，所述贵金属纳米粒子组装于所述磁性纳米粒子表面；
3)拉曼信号分子，所述拉曼信号分子固定和/或吸附于所述贵金属纳米粒子表面；
4)亲水性高分子和/或生物大分子，所述亲水性高分子和/或生物大分子具有多个与所述贵金属纳米粒子进行结合的结合官能团，且所述亲水性高分子和/或生物大分子通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属纳米粒子的表面；
5)靶分子，所述靶分子偶联于所述亲水性高分子和/或生物大分子表面，且与待测物具有特异性相互作用。
在另一优选例中，所述复合纳米材料中，所述磁性纳米粒子位于所述复合纳米材料的中心，所述贵金属纳米粒子包裹于所述磁性纳米粒子的整个外表面，且所述贵金属纳米粒子经亲水性高分子和/或生物大分子和拉曼信号分子共表面修饰，且所述亲水性高分子和/或生物大分子经靶分子表面修饰。
在另一优选例中，所述复合纳米材料具有球状或类球状形状。
在另一优选例中，所述复合纳米材料的直径为50-800nm，较佳地80-500nm，更佳地120-350nm。
在另一优选例中，所述待测物为选自下组的癌细胞：循环肿瘤细胞、人***细胞、人食管癌细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人结直肠癌细胞、人肝癌细胞、人肺腺癌细胞、人胃癌细胞、人***癌细胞、人胰腺癌细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述磁性纳米粒子为球状或类球状形状；
2)所述磁性纳米粒子的粒径为80-500nm，较佳地100-280nm，更佳地150-250nm；
3)所述磁性纳米粒子的组成成分为选自下组的金属元素形成的金属氧化物：Fe、Co、Ni、Ce、La、Nd、Gd、或其组合。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子选自下组：Fe3O4、LaFe2O4、或其组合。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述贵金属纳米粒子具有选自下组的形状：球状、类球状、棒状、立方体状、三角片状、三角锥状、星状；
2)所述贵金属纳米粒子的平均粒径为10-50nm，较佳地15-45nm，更佳地20-40nm；
3)所述贵金属纳米粒子的平均粒径为所述磁性纳米粒子的平均粒径的5-20％，较佳地8-18％，更佳地10-15％；
4)所述贵金属纳米粒子的组成成分选自下组：Au、Ag、Pt、或其组合。
在另一优选例中，所述复合纳米材料具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述贵金属纳米粒子在所述磁性纳米粒子表面的负载密度为0.3×106－1000×106个/mm2，较佳地3.0×106－100×106个/mm2，更佳地20×106－50×106个/mm2；
2)所述复合纳米材料中，所述磁性纳米粒子、所述贵金属纳米粒子、所述拉曼信号分子、所述亲水性高分子和/或生物大分子和所述靶分子的摩尔比为1:1-103:10-107:1-105:10-107,较佳地1:10-100:103-105:100-104:103-105,更佳地1:40-60:104-5×104:103-3×103:104-5×104。
在另一优选例中，所述复合纳米材料具有选自下组的一个或多个特征：
1)所述拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、耐尔蓝、或其组合；
2)所述亲水性高分子选自下组：聚醚类改性化合物、聚酯类改性化合物、或其组合，所述改性化合物具有选自下组的基团：氨基、羧基、羟基、或其组合；
3)所述生物大分子选自下组：寡肽、多肽、蛋白质、多糖、或其组合；
4)所述靶分子选自下组：抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)、叶酸、单克隆抗体、半乳糖胺、RGD肽、表皮生长因子EGF、核酸适配体、或其组合。
在另一优选例中，所述亲水性高分子选自下组：聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子和/或所述贵金属纳米粒子经高分子修饰后相互组装。
在另一优选例中，所述高分子选自下组：PEI、PAA。
在另一优选例中，所述高分子修饰使得所述磁性纳米粒子和/或所述贵金属纳米粒子带有电荷，以利于组装。
在另一优选例中，所述多肽选自下组：聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、含谷氨酸化合物、含天门冬氨酸化合物、聚赖氨酸、聚精氨酸、含赖氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述蛋白质为还原型蛋白质，如还原型牛血清白蛋白(rBSA)。
在另一优选例中，所述多糖选自下组：壳聚糖、葡聚糖、甲壳素、纤维素、淀粉、琼脂、或其组合。
在另一优选例中，所述靶分子通过选自下组的基团与所述生物大分子或亲水性高分子偶联：氨基、羧基、羟基、或其组合，所述靶分子通过酰胺键与所述高分子共价键合。
本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述复合纳米材料的制备方法，包括步骤：
1)提供分别包含磁性纳米粒子、贵金属纳米粒子、拉曼信号分子、亲水性高分子或生物大分子和靶分子的溶液；
2)将含磁性纳米粒子的溶液滴加入含贵金属纳米粒子的溶液，震荡反应得到含表面组装贵金属纳米粒子的磁性纳米粒子的溶液A；
3)活化靶分子后，将含靶分子的溶液加入到含亲水性高分子或生物大分子的溶液，搅拌反应得到含靶分子修饰的亲水性高分子或生物大分子的溶液B；
4)将含拉曼信号分子的溶液加入溶液A，震荡反应第一时间后，将溶液B加入震荡后溶液，继续震荡反应第二时间，得到所述复合纳米材料。
在另一优选例中，步骤2)之后还包括如下步骤：磁洗涤步骤2)所得产物，并将洗涤所得产物分散于水中。
在另一优选例中，所述第一时间为3-20min，较佳地3-10min。
在另一优选例中，所述第二时间为3-20min，较佳地3-10min。
在另一优选例中，步骤2)中，所述磁性纳米粒子与所述贵金属纳米粒子的反应摩尔比为1:10－1000，较佳地1:30－500，更佳地1:50－100。
在另一优选例中，步骤3)中，所述亲水性高分子或生物大分子与所述靶分子的反应摩尔比为1:10－100，较佳地1:30－70，更佳地1:40-60。
在另一优选例中，步骤4)中，所述表面组装贵金属纳米粒子的磁性纳米粒子、所述靶分子修饰的亲水性高分子或生物大分子、所述拉曼信号分子的反应摩尔比为1:1-105:10-107，较佳地1:100-1000:103-105，更加地1:300-700:104-5×104。
本发明的第三方面，提供了一种检测癌细胞的方法，包括步骤：
1)将本发明第一方面所述复合纳米材料与待测溶液接触；
2)培养第三时间后，离心去除游离的复合纳米材料；
3)检测离心后所得混合液的SERS信号，基于所测得SERS信号确定待测溶液中癌细胞含量。
本发明的第四方面，提供了一种分离癌细胞的方法，包括步骤：
1)将本发明第一方面所述复合纳米材料与含癌细胞的溶液接触；
2)培养第三时间后，离心去除游离的复合纳米材料；
3)对离心所得混合液外加磁场作用，实现癌细胞的富集分离。
在另一优选例中，第三时间为10-60min，较佳地20-50min。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1中所制备的纳米粒子的电镜图，其中(A)、(B)、(C)、(D)分别为磁性纳米粒子，贵金属纳米粒子，贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面，贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面并连接拉曼信号分子、天然亲水性高分子及靶分子的电镜图。
图2为实施例1中所述复合纳米材料1检测癌细胞的灵敏度与特异性初步验证结果，其中(A)和(B)为所述复合纳米材料1对癌细胞(如HeLa、MCF-7)的灵敏度检测结果，(C)和(D)为所述复合纳米材料1对癌细胞(如HeLa、MCF-7)的特异性检测结果。
图3为实施例1中所述复合纳米材料1在血液中检测癌细胞的灵敏度与特异性结果，其中(A)为所述复合纳米材料1对癌细胞的灵敏度检测结果，(B)为癌细胞个数和1076cm-1处的拉曼信号强度线性关系图,(C)为所述磁性复合纳米材料1对癌细胞在血液中的特异性检测结果。
图4为癌细胞在血液中经所述纳米复合材料1分离前后的免疫荧光图。
图5为癌细胞有无释放所述纳米复合材料1的活性对比图，其中(A)为未经任何处理的癌细胞的倒置显微镜图，(B)和(C)为未释放与释放所述纳米复合材料1的癌细胞的倒置显微镜图，(D)为未释放与释放所述纳米复合材料1的细胞活性测试结果。
图6为银三角片-MBA与磁性纳米粒子@贵金属纳米粒子-MBA不同时间段SERS信号图谱。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，通过以磁性纳米粒子为基体，在其表面复合组装贵金属纳米粒子、拉曼信号分子、亲水性高分子/生物大分子和靶分子，制备得到一种可同时实现对癌细胞的有效检测和分离的复合纳米材料。在此基础上，发明人完成了本发明。
复合纳米材料(复合物或磁性复合纳米材料)
本发明提供了一种复合物，所述复合物包括：
磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子表面组装有贵金属纳米粒子，所述贵金属纳米粒子主要包括不同形状(球、棒、立方体、三角片、星等)金或银纳米粒子；
拉曼信号分子，所述拉曼信号分子连接于所述贵金属纳米粒子表面，可通过电磁增强与化学增强机理实现表面拉曼信号的增强；
人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子，所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子包裹在表面组装有所述贵金属纳米粒子的磁性纳米粒子表面，并且所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子表面连接有靶分子，所述靶分子为能与癌细胞表面抗原或受体发生特异性相互作用的抗体或配体。
所述磁性纳米粒子在外加磁场作用下，可以实现磁聚集。
所述贵金属纳米粒子主要包括不同形状(球、棒、立方体、三角片、星等)金或银纳米粒子，可通过化学键、配位键、氢键、静电相互作用力连接于磁性纳米粒子表面。
所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子，具有多个与所述贵金属纳米粒子进行结合的结合官能团(如金属-S、金属-N)，并且所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子可通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属纳米粒子。
在本发明中，所述“复合”指以选自包括(但并不限于)下组的方式进行连接：化学键、配位键、氢键、静电相互作用力。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子是通过选自下组的方式连接组装于所述磁性纳米粒子表面的：化学键、配位键、氢键、静电相互作用力。
具体地，通过化学键、配位键、氢键、静电相互作用力在磁性纳米粒子表面组装贵金属纳米粒子，贵金属纳米粒子的组装使相邻的贵金属纳米粒子之间产生电磁场叠加，形成热点；随后，在复合纳米粒子表面修饰拉曼信号分子，使复合球具有SERS信号；修饰亲水性高分子或生物大分子-靶分子，提高磁性复合纳米球的稳定性并降低与正常细胞的非特异性相互作用，同时特异性识别癌细胞，使得磁性复合纳米粒子与肿瘤细胞产生特异性相互作用。将该磁性复合纳米材料用于癌细胞的检测，检测限为1细胞/毫升，癌细胞浓度与SERS强度的线性关系为Y＝4.6391X+70.178(R2＝0.9953)，可根据SERS强度实现癌细胞的定量。过量靶分子溶液与被捕获细胞共培养，实现磁性复合纳米材料的释放，释放磁性复合纳米材料的细胞状态优于未释放磁性复合纳米材料的细胞，进一步实现了癌细胞的培养扩增、鉴定及分子表型分析等。
更具体地，本发明提供了一种用于检测癌细胞的SERS磁性复合纳米材料，所述的SERS磁性复合纳米材料能特异性靶向各类癌细胞，并同时借助Raman光谱仪与外加磁场有效实现癌细胞的检测与分离。
所述用于检测癌细胞的SERS磁性复合纳米材料，由作为核心的磁性纳米粒子、贵金属纳米粒子、拉曼信号分子、人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子以及靶分子构成。
所述磁性纳米粒子在外加磁场作用下，可以实现磁聚集，从而实现CTC的富集与分离；所述贵金属纳米粒子主要包括不同形状(球、棒、立方体、三角片、星等)金或银纳米粒子，可通过化学键、配位键、氢键、静电相互作用力连接于磁性纳米粒子表面；所述拉曼信号分子为2-巯基苯甲酸、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、耐尔蓝、或其组合；所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子，具有多个与所述贵金属纳米粒子进行结合的结合官能团，并且所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子可通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属纳米粒子；所述靶分子为与肿瘤细胞有特异性相互作用的化合物，能靶向作用于癌细胞，所述靶分子偶联于所述人工合成或天然的亲水性高分子或生物大分子，优选为抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)、叶酸、单克隆抗体或半乳糖胺等。
更具体地，所述复合材料包括：
a)作为内核的磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子有较好的磁响应性；
b)贵金属纳米粒子，所述贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面；
c)拉曼信号分子，所述拉曼信号分子固定和/或吸附于所述贵金属纳米粒子表面；
d)亲水性高分子或生物大分子，所述亲水性高分子或生物大分子具有多个与所述贵金属粒子进行结合的结合官能团(-SH和/或-NH2)，且所述亲水性高分子或生物大分子通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属纳米粒子的表面(金属-S键和/或金属-N键)。
在另一优选例中，在含待测物溶液中，所述待测物与所述复合纳米材料通过所述靶分子结合形成易于磁分离的复合物。
在另一优选例中，所述待测物选自下组：循环肿瘤细胞、人***细胞、人食管癌细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人结直肠癌细胞、人肝癌细胞、人肺腺癌细胞、人胃癌细胞、人***癌细胞、人胰腺癌细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述复合纳米材料具有球状或类球状形状。
在另一优选例中，所述复合纳米材料的直径为50-800nm，较佳地80-500nm，更佳地120-350nm。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子为球状或类球状形状。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子的粒径为80-500nm，较佳地100-280nm，更佳地150-250nm。
在另一优选例中，所述磁性纳米粒子的组成成分为选自下组的金属元素形成的金属氧化物：Fe、Co、Ni、Ce、La、Nd、Gd、或其组合。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子具有选自下组的形状：球状、类球状、棒状、立方体状、三角片状、三角锥状、星状。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子的平均粒径为10-50nm，较佳地15-45nm，更佳地20-40nm。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子的平均粒径为所述磁性纳米粒子的平均粒径的5-20％，较佳地8-18％，更佳地10-15％。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子的组成成分选自下组：Au、Ag、Pt、或其组合。
在另一优选例中，所述贵金属纳米粒子在所述磁性纳米粒子表面的负载密度为0.3×106－1000×106个/mm2，较佳地3.0×106－100×106个/mm2，更佳地20×106－50×106个/mm2。
在另一优选例中，所述复合纳米材料中，所述磁性纳米粒子、所述贵金属纳米粒子、所述拉曼信号分子、所述亲水性高分子或生物大分子和所述靶分子的摩尔比为1:1-103:10-107:1-105:10-107,较佳地1:10-100:103-105:100-104:103-105,更加地1:40-60:104-5×104:103-3×103:104-5×104。
在另一优选例中，所述拉曼信号分子为在拉曼光谱中具有明显共轭振动的有机分子。
在另一优选例中，所述“固定”和/或所述“吸附”为化学键合和/或物理吸附。
在另一优选例中，所述拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、耐尔蓝、或其组合。
在另一优选例中，所述亲水性高分子或所述生物大分子的各分子链通过多个“金属－S键”和/或“金属-N键”与所述贵金属纳米粒子化学键合。
在另一优选例中，所述亲水性高分子选自下组：聚醚类改性化合物、聚酯类改性化合物、或其组合，所述改性化合物具有选自下组的基团：氨基、羧基、羟基、或其组合。
在另一优选例中，所述生物大分子选自下组：寡肽、多肽、蛋白质、多糖、或其组合。
在另一优选例中，所述多肽选自下组：聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、含谷氨酸化合物、含天门冬氨酸化合物、聚赖氨酸、聚精氨酸、含赖氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述蛋白质为还原型蛋白质，如还原型牛血清白蛋白(rBSA)。
在另一优选例中，所述多糖选自下组：壳聚糖、葡聚糖、甲壳素、纤维素、淀粉、琼脂、或其组合。
在另一优选例中，所述靶分子通过选自下组的基团与所述生物大分子或亲水性高分子偶联：氨基、羧基、羟基或其组合。
在另一优选例中，所述靶分子选自下组：抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)、叶酸、单克隆抗体、半乳糖胺、RGD肽、表皮生长因子EGF、核酸适配体或其组合。
在另一优选例中，所述靶分子通过酰胺键与所述高分子共价键合。
制法
典型地，所述复合纳米材料是如下制备的：
(1)磁性纳米粒子的制备(以Fe3O4为例)
将0.68g FeCl3·6H2O、1.8g NaAc、0.75g PEI(即聚醚酰亚胺)溶于20mL乙二醇中，然后将该混合溶液转移至反应釜中，放于烘箱220℃保存2h后取出。冷却至室温后，加入乙醇和纯水，磁洗涤数次，最终分散在100mL去离子水中。离心(1000rpm)5分钟，将上清液移至新管中，于4℃冰箱保存。
(2)贵金属纳米粒子的制备
贵金属化合物溶液加热至沸腾，快速加入还原剂，加热一段时间后，冷却至室温，于4℃冰箱保存。所述贵金属化合物选自下组：氯金酸、氯化金、氯化亚金、氯金酸钾、氯金酸钠、硝酸银、醋酸银、三氟乙酸银、三氟甲烷磺酸银、六氟锑酸银、四氟硼酸银、或其组合。所述还原剂选自下组：柠檬酸三钠、硼氢化钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、草酸钠、没食子酸、抗坏血酸、水合肼、葡萄糖酸钠、葡聚糖、过氧化氢或其组合。
(3)贵金属纳米粒子在磁性纳米粒子表面的组装
将磁性纳米粒子溶液滴加至贵金属纳米粒子溶液中，然后将混合物转至摇床，室温震荡(200rpm)20min。磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中，得到溶液A。
应理解，在上述制备方法中，是将磁性纳米粒子溶液滴加至贵金属纳米粒子溶液中，如顺序相反，贵金属纳米粒子在滴加至磁性纳米粒子溶液并分散开来的过程中会立即聚集，无法均匀连接至磁性纳米粒子表面。所述磁性纳米粒子与所述贵金属纳米粒子的反应摩尔比为5－6：10－45，较佳地5－6：10－30，更佳地5－6：10－20。
(4)亲水性高分子或生物大分子-靶分子溶液的制备
靶分子经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化后，加入至亲水性高分子或生物大分子溶液中，搅拌过夜即得到所述亲水性高分子或生物大分子-靶分子溶液。通过超滤离心管(MW～3kDa)使得亲水性高分子或生物大分子-靶分子溶液浓度纯化为1.1～6.0mg/mL,得到溶液B。
(5)拉曼信号分子溶液的制备
称取拉曼信号分子分散至乙醇溶液中，制得拉曼信号分子溶液C(0.25～2.5mM)。
(6)磁性复合纳米材料的制备
将所述拉曼信号分子溶液C(0.25～2.5mM)加入至4mL所述溶液A中，而后将样品转移至摇床，室温震荡(200rpm)5min，通过SERS检测，取信号高所加入信号分子溶液的浓度为最佳浓度。随后加入溶液B(1.1～6.0mg/mL)，室温震荡(200rpm)5min，同上通过SERS检测，取信号高所加入溶液B的浓度为最佳浓度磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中，离心(1000rpm)5min，将上清液移至新管中，最终得到所述磁性复合纳米材料。
与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：
(1)所述复合纳米材料不仅可实现对癌细胞的有效检测，还可在外加磁场作用下实现对癌细胞的有效分离；
(2)所述复合纳米材料对癌细胞具有优异的检测效果，其检测灵敏度可高达1细胞/毫升，且检测时SERS强度与癌细胞浓度具有优异的线性关系，可方便地根据SERS强度判断癌细胞浓度；
(3)所述复合纳米材料对癌细胞具有优异的分离效果，模拟血液样本癌细胞密度在～300细胞/毫升时，经富集与磁分离操作后，免疫荧光测定几乎未检测到白细胞却检测到了癌细胞的存在；
(4)所述复合纳米材料的制备方法具有工艺简单、成本低等特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1复合纳米材料1的制备
Fe3O4[email protected]的制备
1)Fe3O4-PEI的制备
将0.68g FeCl3·6H2O、1.8g NaAc、0.75g PEI溶于20mL乙二醇中，然后将该混合溶液转移至反应釜中，放于烘箱220℃保存2h后取出。冷却至室温后，加入乙醇和纯水，磁洗涤数次，最终分散在100mL去离子水中。离心(1000rpm)5分钟，将上清液移至新管中，于4℃冰箱保存。
2)AuNPs的制备
50mL氯金酸(1mM)溶液加热至沸腾，快速加入2.256mL柠檬酸钠水溶液(1.0％)，20min后，停止加热，冷却至室温，于4℃冰箱保存。
3)Fe3O4[email protected]的制备
900μL Fe3O4-PEI溶液滴加到3mLAuNPs溶液中，然后将混合物转至摇床，室温震荡(200rpm)20min。磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中。
4)rBSA-FA的制备
将50mg FA(即叶酸)、40mg EDC与24mg NHS溶于50mL PBS(pH 7.4，10mM)中，室温下搅拌8h，得到FA-NHS。将260μL NABH4(1M)加入20mL牛血清白蛋白(BSA,20mg/mL)溶液中，搅拌1h后得到还原型牛血清白蛋白(rBSA)。随后，将5mL rBSA溶液加入50mL FA-NHS溶液，搅拌过夜后，得到rBSA-FA。超滤离心管(MW～3kDa)纯化rBSA-FA，最终得到rBSA-FA溶液(4.5mg/mL)。
5)MBA(即4-巯基苯甲酸)溶液的制备
称取MBA分散至乙醇溶液中，制得MBA溶液(10mM)。
6)Fe3O4[email protected]的制备
将40μL MBA溶液加入至4mL Fe3O4[email protected]溶液中，而后将样品转移至摇床，室温震荡(200rpm)5min。随后加入40μL rBSA-FA溶液(4.5mg/mL)，室温震荡(200rpm)5min，磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中，离心(1000rpm)5min，将上清液移至新管中，最终得到Fe3O4[email protected]，即复合纳米材料1。
实施例2复合纳米材料2的制备
LaFe2O4[email protected]
1)LaFe2O4-PEI的制备
称取一定量FeCl3·6H2O和LaCl3溶解于80mL乙二醇中，加入醋酸钠与聚乙二醇2000，充分混合均匀后剧烈搅拌1小时，随后移入100mL高温高压反应釜中，置于200℃烘箱中反应16小时。冷却至室温后，加入乙醇和纯水，磁洗涤数次，最终分散在100mL去离子水中。加入PEI,搅拌过夜，磁洗涤，离心(1000rpm)5分钟，将上清液移至新管中，于4℃冰箱保存。
2)AuNPs的制备
氯金酸溶液加热至沸腾，快速加入柠檬酸钠水溶液(1.0％)，20min后，停止加热，冷却至室温，于4℃冰箱保存。
3)LaFe2O4[email protected]的制备
将一定量LaFe2O4-PEI溶液滴加至AuNPs溶液中，然后将混合物转至摇床，室温震荡(200rpm)20min。磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中。
4)rBSA-FA的制备
将50mg FA、40mg EDC与24mg NHS溶于50mL PBS(pH 7.4，10mM)中，室温下搅拌8h，得到FA-NHS。将260μL NABH4(1M)加入20mL牛血清白蛋白(BSA,20mg/mL)溶液中，搅拌1h后得到还原型牛血清白蛋白(rBSA)。随后，将5mL rBSA溶液加入50mL FA-NHS溶液，搅拌过夜后，得到rBSA-FA。超滤离心管(MW～3kDa)纯化rBSA-FA，最终分散至纯水中得到rBSA-FA溶液。
5)MBA溶液的制备
称取MBA分散至乙醇溶液中，制得MBA溶液(10mM).
6)LaFe2O4[email protected]的制备
将40μL MBA溶液加入至4mL LaFe2O4[email protected]溶液中，而后将样品转移至摇床，室温震荡(200rpm)5min。随后加入40μL rBSA-FA溶液(4.5mg/mL)，室温震荡(200rpm)5min，磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中，离心(1000rpm)5min，将上清液移至新管中，最终得到LaFe2O4[email protected]，即复合纳米材料2。
实施例3复合纳米材料3的制备
Fe3O4@AgNPs-PEI-R6G-rBSA-EpCAM
1)Fe3O4的制备
将FeCl3·6H2O、丙烯酸钠、醋酸钠溶解在乙二醇与二甘醇的混合溶液中，搅拌均匀，转移至反应釡中，200℃，10h，冷却至室温后，加入乙醇和纯水，磁洗涤数次，最终分散在100mL去离子水中。离心(1000rpm)5分钟，将上清液移至新管中，于4℃冰箱保存。
2)纳米AgNPs-PEI的制备
将AgNO3加入至乙醇中,搅拌至完全溶解,然后将其逐滴滴入到预先配好的含有PVP(K230)的乙醇中，再将混合液转入四氟乙烯内衬高压釜中,置于180℃烘箱中反应18h。自然冷却到室温,离心分离。所得产物用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次,最终分散至水中，加入PEI，搅拌过夜，去离子水洗涤数次，于4℃冰箱保存。
3)Fe3O4@AgNPs-PEI的制备
将一定量Fe3O4溶液滴加至AgNPs-PEI溶液中，然后将混合物转至摇床，室温震荡(200rpm)20min。磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中。
4)rBSA-EpCAM的制备
将EpCAM、EDC与NHS溶于50mL PBS(pH 7.4，10mM)中，室温下搅拌8h，得到EpCAM-NHS。将260μL NABH4(1M)加入20mL牛血清白蛋白(BSA,20mg/mL)溶液中，搅拌1h后得到还原型牛血清白蛋白(rBSA)。随后，将5mL rBSA溶液加入50mL EpCAM-NHS溶液，搅拌过夜后，得到rBSA-EpCAM。超滤离心管(MW～3kDa)纯化rBSA-EpCAM，最终分散至纯水中得到rBSA-EpCAM溶液。
5)R6G(即罗丹明)溶液的制备
称取R6G分散至乙醇溶液中，制得R6G溶液.
6)Fe3O4@AgNPs-PEI-R6G-rBSA-EpCAM的制备
将40μL R6G溶液加入至4mL Fe3O4@AgNPs-PEI溶液中，而后将样品转移至摇床，室温震荡(200rpm)5min。随后加入40μL rBSA-EpCAM溶液(4.5mg/mL)，室温震荡(200rpm)5min，磁洗涤数次，最终分散于4mL去离子水中，离心(1000rpm)5min，将上清液移至新管中，最终得到Fe3O4@AgNPs-PEI-R6G-rBSA-EpCAM，即复合纳米材料3。
实施例4性能检测
电镜
图1为实施例1中所制备的纳米粒子的电镜图，其中(A)、(B)、(C)、(D)分别为磁性纳米粒子，贵金属纳米粒子，贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面，贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面并连接拉曼信号分子、天然亲水性高分子及靶分子的电镜图。
从图1(A)、(B)可以看出：磁性纳米粒子与贵金属纳米粒子的直径分别为200～230nm与30～40nm；从图1(C)可以看出：贵金属纳米粒子组装至磁性纳米粒子的表面形成磁性纳米粒子@贵金属纳米粒子核/卫星式结构，粒径为230～250nm；从图1(D)可以看出：磁性纳米粒子@贵金属纳米粒子表面覆盖有一层透明状物质，其为进一步用拉曼信号分子和天然亲水性高分子/生物大分子及靶分子功能化形成具有靶向癌细胞功能的磁性SERS纳米粒子，粒径为230～250nm。
细胞中的灵敏度
将3～3000个癌细胞(如HeLa/MCF-7)加入3mL细胞培养基中，然后加入200μL所述磁性复合纳米材料溶液，于培养箱培养30min后，经离心(1000rpm)5min除去未结合至细胞表面的纳米粒子。加入PBS，磁洗涤数次，最后分散于200μL PBS中，共聚焦拉曼显微镜测量SERS信号。
图2为实施例1中所述复合纳米材料1检测癌细胞的灵敏度与特异性初步验证结果，其中(A)和(B)为所述复合纳米材料1对癌细胞(如HeLa、MCF-7)的灵敏度检测结果，(C)和(D)为所述复合纳米材料1对癌细胞(如HeLa、MCF-7)的特异性检测结果。
图2A与图2B表面随着细胞数目的增多，SERS信号随之增强，其检测灵敏度为1细胞/毫升。
混合细胞中的特异性
对于混合细胞中该磁性复合纳米材料的特异性研究，分别将200μL有无接枝所述靶分子的复合材料溶液加入2.0mL含105个靶分子受体表达较低的细胞中(如叶酸受体表达较低的A549细胞)、10个靶分子受体表达较高的细胞(如叶酸受体表达较高的HeLa/MCF-7)或无所述受体表达较高的细胞培养基中。随后操作与灵敏度研究相同。将靶分子受体表达较低的细胞与该磁性复合纳米材料共培养并经一定的处理后，拉曼检测几乎无SERS信号。然而一旦存在受体表达的细胞时，拉曼检测即存有SERS信号。这表明了纳米粒子对表达受体细胞的特异性作用。另外，没有接枝靶分子的磁性复合纳米材料与靶分子受体表达较高的细胞共培养并经一定的处理后，无SERS信号，这表明了靶分子的靶向作用(图2C与图2D)。
检测与分离
将含有癌细胞的血液样品缓慢加入3.0mL淋巴细胞分离液中，400×g离心25min，将处于低密度细胞层中的单核细胞和癌细胞取出后，离心洗涤数次，后分散于2mL细胞培养液中。随后，将200μL所述磁性复合纳米材料溶液加入共混细胞(如1000Hela，～107WBC)中，培养30min后，离心(1000rpm)5.0min除去游离纳米颗粒，磁富集，洗涤数次，最后分散于200μL PBS中，实现血液中肿瘤细胞的捕获与富集。
血液中灵敏度
对于血液中该磁性复合纳米材料的灵敏度研究，在2.0mL血液中(～2×107白细胞)加入2.0mL含2～2000癌细胞(如HeLa细胞)的PBS溶液。所述磁性复合纳米粒子与之共培养，经捕获和富集血液中的癌细胞后，共聚焦拉曼显微镜测量SERS信号。
图3为实施例1中所述复合纳米材料1在血液中检测癌细胞的灵敏度与特异性结果，其中(A)为所述复合纳米材料1对癌细胞的灵敏度检测结果，(B)为癌细胞个数和1076cm-1处的拉曼信号强度线性关系图,(C)为所述磁性复合纳米材料1对癌细胞在血液中的特异性检测结果。
图3A表明肿瘤细胞数越多，SERS信号越强，检测限为1细胞/毫升。SERS强度和癌细胞浓度之间的线性关系为Y＝4.6391X+70.178(R2＝0.9953)。
血液中特异性
对于血液中该磁性复合纳米材料的特异性研究，在2.0mL血液中(～2×107白细胞)加入2.0mL含有或不含癌细胞(10个)的PBS溶液。有无接枝所述靶分子的复合材料溶液与之共培养，经捕获和富集操作后，共聚焦拉曼显微镜测量SERS信号。特异性实验显示(图3C)，只有当所述磁性复合纳米材料与含有癌细胞的混合细胞共培养时，拉曼检测才有SERS信号，这表明了所述磁性复合纳米材料在血液中具有较好的特异性。
血液中癌细胞的分离
在1.0mL血液中(～107白细胞)加入2.0mL含1000个癌细胞的PBS溶液。经捕获和富集操作后，分离出血液中的癌细胞，PBS磁洗涤数次。后用4％多聚甲醛培养10min，0.1％Triton-X 100打孔5min以及1％BSA处理后，用Hoechst(0.5μg/mL，5min)、Alexa Fluor 647标记抗CK8单克隆抗体(2μg/mL，过夜)、Alexa Fluor 488标记抗CD45单克隆抗体(1μg/mL，过夜)染色，最后共聚焦荧光显微镜进行成像。癌细胞为CK8表达阳性，CD45表达阴性[ChinMed J 2005,118,1987-1993]，因此免疫荧光显示癌细胞呈递CK8信号(红色)而无CD45信号(绿色)。同理，白细胞为CK8表达阴性，CD45表达阳性[Sci Rep 2018,8,1188-1197]，免疫荧光呈递CD45信号(绿色)而无CK8信号(红色)。蓝色(Hoechst染色)为细胞核信号。
图4为癌细胞在血液中经所述纳米复合材料1分离前后的免疫荧光图。
图4表明，经分离后的样品几乎未检测到白细胞却有效检测到了癌细胞的存在。
癌细胞表面纳米粒子的释放
将200μL所述磁性复合纳米材料分散于2.0mL细胞培养液中，与癌细胞(如HeLa细胞)共培养30min后，将培养基改为含有过量靶分子的新鲜培养基。孵育24h后，倒置显微镜下观察细胞状态。
图5为癌细胞有无释放所述纳米复合材料1的活性对比图，其中(A)为未经任何处理的癌细胞的倒置显微镜图，(B)和(C)为未释放与释放所述纳米复合材料1的癌细胞的倒置显微镜图，(D)为未释放与释放所述纳米复合材料1的细胞活性测试结果。
图5A-C显示了正常癌细胞、未释放复合纳米材料1的癌细胞及释放了复合纳米材料1的癌细胞的状态，实验结果表明释放了复合纳米材料1的癌细胞的状态要好于未释放复合纳米材料1的癌细胞状态。
有未释放纳米粒子的细胞活性测试
在96孔板的每个孔中加入200μL浓度约为6000细胞/毫升的癌细胞。培养过夜后，将培养基改为含有所述磁性复合纳米材料的培养基。培养30min后，用含过量靶分子的新鲜培养基与细胞共培养三天。最后，往各孔板中加入10μL MTT。4h后，吸除培养基，加入200μLDMSO，酶联免疫检测仪测量各孔吸光值。结果表明未释放复合纳米材料1的癌细胞的活性要小于释放了复合纳米材料1的癌细胞的活性(图5D)。
实施例2-3所得复合纳米材料2-3的形貌、对癌细胞的检测和分离效果与实施例1所得复合纳米材料1相当。
对比例1混合纳米材料C1的制备
1)将0.5mL AgNO3(20M)、6.0mL C6H5Na3O7·2H2O(30M)、6.0mL PVP(0.7mM)和240μLH2O2(30wt％)的混合物加入至99.5mL纯水中，室温下搅拌混合均匀后，加入1.0mL NaBH4(100mM)，溶液颜色变为淡黄色后，储存在暗室中反应2小时，颜色变为蓝色，制得银三角片纳米溶液。
2)将40μL MBA(100μM)溶液加入8.0mL银三角片纳米溶液中。磁搅拌2.0min后，得MBA-银三角片溶液。80μL rBSA溶液(2.5μg/mL)加入至4.0mL MBA-银三角片溶液，反应5min后得MBA-银三角片-rBSA。
3)将50mg FA、40mg EDC与24mg NHS溶于50mL PBS(pH 7.4，10mM)中，室温下搅拌8h，得到FA-NHS。
4)将2mL FA-NHS溶液加入至12mL MBA-银三角片-rBSA溶液中，搅拌16h后，使用超滤离心管(Mw～30kDa)进行浓缩，分散至超纯水中得MBA-银三角片-rBSA-FA溶液。
5)将2.0mL含有FeCl3·6H2O(2.0mM)和FeCl2·4H2O(1.0mM)的溶液逐滴加入100mL二乙二醇(DEG)中，往混合液中通入氮气,持续50min后，升温至170℃并回流15分钟。于1.0小时内注入50mL氨溶液(即，第一次注入20毫升，然后每20分钟注入10毫升)，并于170℃下继续反应1.0h，冷却至室温，分别使用1.0mM的硝酸和纯水磁洗涤数次。最后，分散至水溶液中制得四氧化三铁溶液。
6)将0.5ml rBSA(10mg/mL)溶液加入至12.0mL四氧化三铁溶液中(CFe＝3.67mM)。恒温震荡箱震荡2.0h后，往混合液中加入32.0mg EDC、19.2mg NHS和4.0mL FA溶液(0.8mg/mL),持续震荡16.0小时后，磁洗涤数次，分散至水溶液中制得四氧化三铁-rBSA-FA。
7)1.0mL MBA-银三角片-rBSA-FA(CAg＝0.2mg/mL)和300μL四氧化三铁-rBSA-FA(CFe＝0.2mg/mL)混合制得MBA-银三角片-rBSA-FA与四氧化三铁-rBSA-FA的混合液。
同实施例1，区别在于：采用MBA-银三角片与四氧化三铁-rBSA-FA的混合物代替Fe3O4[email protected]应用于循环肿瘤细胞的检测。
结果：由于银三角片的几何角易被刻蚀，从而导致SERS信号发生变化，以致无法实现有效的CTC检测。另外，黏附在CTC表面的纳米粒子成分不易控制，而具有SERS功能的贵金属纳米颗粒在磁性纳米颗粒表面的组装与相应的混合物相比，具有更好的CTC检测和分离功能。
图6为银三角片-MBA与磁性纳米粒子@贵金属纳米粒子-MBA不同时间段SERS信号图谱，可以看出银三角片-MBA的SERS信号随着放置时间的变长而减小，而磁性纳米粒子@贵金属纳米粒子-MBA的SERS信号随着放置时间的变长基本保持不变。
上述结果表明：相比于本发明所述贵金属纳米粒子组装于磁性纳米粒子表面所得复合纳米材料，简单地将银三角片与磁性纳米粒子混合所得混合纳米材料C1是无法实现有效的CTC检测的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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