阅读说明：本技术 用于共刺激的新型平台、新型car设计以及过继性细胞疗法的其他增强 (Novel platform for co-stimulation, novel CAR design and other enhancements of adoptive cell therapy ) 是由 P·M·乔杜里 于 2018-09-27 设计创作，主要内容包括：本公开提供了促进过继性细胞疗法的组合物和方法。本公开提供了包含与NFkB活性的特异性激活剂组合的嵌合抗原受体(CAR)、合成免疫受体(SIR)等的多核苷酸、载体、系统和细胞,以改善细胞增殖、表达并减少凋亡,从而改善过继性细胞疗法中的细胞持久性。(The present disclosure provides compositions and methods for facilitating adoptive cell therapy. The present disclosure provides polynucleotides, vectors, systems and cells comprising Chimeric Antigen Receptors (CARs), Synthetic Immune Receptors (SIRs), etc., in combination with specific activators of NFkB activity to improve cell proliferation, expression, and reduce apoptosis, thereby improving cell persistence in adoptive cell therapy.)

用于共刺激的新型平台、新型CAR设计以及过继性细胞疗法的 其他增强

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119要求于2017年9月27日提交的美国临时申请序列第62/564,249号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本文提供了用于癌症、感染、变应性、变性和免疫病症的过继性细胞疗法的新型共刺激模块和新型嵌合抗原受体。

序列表的通过引入

此文件附有序列表，标题为“Sequence_ST25.txt”，创建于2018年9月27日，并具有60,347,260字节数据，在IBM-PC，MS-Windows操作系统上格式化。出于所有目的，序列表特此通过引用整体并入本文。

背景技术

过继性T细胞免疫疗法已成为癌症的最前沿治疗方法。可以将T细胞工程化以表达识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CAR)的基因。CAR是工程化的免疫受体，可以重定向T细胞以选择性杀死肿瘤细胞。它们在癌症免疫疗法中使用的一般前提是快速产生靶向肿瘤的T细胞，绕过主动免疫的障碍和递增动力学，从而充当“活的药物”。与接合HLA-肽复合物的生理T细胞受体(TCR)不同，CAR接合不需要肽加工或识别HLA表达的分子。因此，CAR识别任何HLA背景上的抗原，与需要与患者的单倍型匹配的TCR相反。此外，CAR可靶向具有下调的HLA表达或蛋白酶体抗原加工的肿瘤细胞，这是两种有助于肿瘤从TCR介导的免疫中逃脱的机制。CAR的广泛适用性的另一个特征是它们不仅能够结合蛋白质，而且能够结合碳水化合物和糖脂结构，再次扩大了潜在靶的范围。

发明内容

本公开提供一种免疫细胞或其免疫细胞群，其表达(i)至少一种非天然存在的免疫受体和(ii)至少一种选择性激活NF-κB信号传导途径的非天然存在的试剂。在一个实施例中，所述至少一种非天然存在的免疫受体包含至少一种抗原结合结构域和至少一种跨膜结构域。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种非天然存在的免疫受体能够募集至少一种TCR相关信号传导模块。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种非天然存在的免疫受体是嵌合抗原受体(CAR)或重组TCR。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种非天然存在的免疫受体的所述至少一种抗原结合结构域与选自由以下组成的群组的抗原结合：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也称为CD2子集1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)；岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、***受体(CGHR或GR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、RasG12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、粘连蛋白-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂选自由以下组成的群组：vFLIP K13、K13-opt、NEMO突变体、NEMO融合蛋白、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任何NF-κB激活蛋白或蛋白片段、NF-κB途径抑制剂的任何抑制剂、任何能够选择性激活NF-κB的基因编辑系统、其任何同源物或变体以及其任何组合。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂是非病毒来源的。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂是基因编辑系统。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂诱导NEMO/IKKγ的低聚。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂诱导IKK复合物的激活。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂不激活AKT途径。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂以组成型或诱导型方式表达。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂瞬时表达。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂稳定表达。在另一个或进一步的实施例中，通过使所述细胞与化合物接触来翻译后控制所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂表达为具有转换结构域的一个或多个拷贝的融合构建体。在另一个或进一步的实施例中，通过施用治疗有效量的诱导转换结构域二聚的化合物将所述至少一种能够选择性激活NF-κB途径的非天然存在的试剂的活性控制在翻译后水平。在另一个或进一步的实施例中，转换结构域包含FKBP12结构域的一个或多个拷贝。在另一个或进一步的实施例中，化合物是AP20187或利米度塞(Rimiducid)或其同源物。在另一个或进一步的实施例中，所述免疫细胞是T淋巴细胞(T细胞)、CAR-T细胞、表达TCR的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、组织驻留淋巴细胞、干细胞、诱导性多能干细胞或自然杀伤(NK)细胞。在另一个或进一步的实施例中，所述免疫细胞已被工程化为缺乏功能性天然T细胞受体(TCR)信号传导复合物和/或β2微球蛋白。在另一个或进一步的实施例中，将所述至少一种非天然存在的免疫受体和/或所述至少一种能够选择性激活NF-κB信号传导途径的试剂克隆到内源TCR基因中，使得所述至少一种非天然存在的免疫受体和/或所述至少一种能够选择性激活NF-κB信号传导途径的试剂处于TCR基因的内源调节元件/启动子的控制下。本公开还提供了如本文所述的免疫细胞或免疫细胞群用于预防和治疗疾病的用途，所述疾病选自由以下组成的群组：癌症、传染性疾病、免疫性疾病和过敏性疾病。在另一个或进一步的实施例中，编码所述至少一种非天然存在的免疫受体和所述至少一种能够选择性激活NF-κB信号传导途径的非天然存在的试剂的至少一种多核苷酸是由单个启动子表达的。在另一个或进一步的实施例中，编码所述至少一种非天然存在的免疫受体和所述至少一种能够选择性激活NF-κB信号传导途径的非天然存在的试剂的至少一种多核苷酸使用两个或更多个单独的启动子表达。在另一个或进一步的实施例中，所述至少一种多核苷酸包含编码所述至少一种非天然存在的免疫受体的第一核酸编码序列与编码所述能够选择性激活NF-κB的非天然存在的试剂的第二核酸序列分开，使得在表达所述第一和第二核酸编码序列时，非天然存在的免疫受体和能够选择性激活NF-κB的非天然存在的试剂没有物理或化学连接。在另一个或进一步的实施例中，将编码所述至少一种非天然存在的免疫受体和/或所述至少一种能够选择性激活NF-κB的非天然存在的试剂的多核苷酸克隆到内源TCR基因中，使得所述至少一种非天然存在的免疫受体和/或所述至少一种能够选择性激活NF-κB的非天然存在的试剂处于TCR基因的内源调节元件/启动子的控制下。在另一个或进一步的实施例中，所述TCR基因的一个或多个恒定链在功能上被重新表达。

本公开还提供了至少一种重组多核苷酸，其编码至少一种非天然存在的免疫受体，所述至少一种重组多核苷酸包含(a)第一核酸结构域，所述第一核酸结构域编码内源蛋白的部分或整个跨膜和/或细胞质结构域以及任选的细胞外结构域，其中所述内源蛋白在淋巴细胞的表面上表达并触发所述淋巴细胞的激活和/或增殖；(b)任选地，多核苷酸接头；(c)与所述第一核酸结构域可操作连接的第二核酸结构域，其中所述第二核酸结构域编码一个或多个非天然TCR抗原结合结构域；(d)任选的编码共刺激结构域的第三核酸结构域；以及(e)任选的编码辅助模块的附加核酸结构域。

本公开还提供了至少一种重组多核苷酸，其包含编码非天然存在的免疫受体的第一核酸；和编码包含选择性NF-κB激活剂的辅助模块的第二核酸。在一个实施例中，所述第一核酸和所述第二核酸由编码可切割肽接头的寡核苷酸接头分开。在另一个实施例中，所述至少一种重组多核苷酸包含两种重组多核苷酸，使得所述第一核酸和第二核酸由单独的载体表达。在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂是非天然存在的选择性NF-κB激活剂。在另一个或进一步的实施例中，所述非天然存在的免疫受体选自由以下组成的群组：CAR、Ab-TCR、TFP、cTCR、SIR和重组TCR。在另一个或进一步的实施例中，所述非天然存在的免疫受体包含(i)细胞外抗原特异性结构域，(ii)跨膜结构域以及(iii)任选的包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的细胞内信号传导结构域，其中(iii)位于非天然存在的免疫受体的C端。在另一个或进一步的实施例中，在表达所述第一和第二核酸序列时，非天然存在的免疫受体和选择性NF-κB激活剂多肽没有物理或化学连接。在另一个或进一步的实施例中，所述细胞外抗原特异性结构域与以下的任何一种或多种结合：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也称为CD2子集1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；AFP/MHC复合物；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；WT1/MHC I复合物；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；NY-ESO-1/MHC I复合物、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-LAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；HPV E6/MHC I复合物；人***瘤病毒E7(HPV E7)；HPV E7/MHC I复合物；AFP/MHC I复合物；Ras/MHC I复合物；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)；岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、***受体(CGHR或GR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、粘连蛋白-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原。在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂选自由以下组成的群组：vFLIP K13、NEMO突变体、NEMO融合蛋白、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、FKBPx2-RIP-ID、IKK1、FKBPx2-IKKa、IKK2、FKBPx2-IKK2、Tcl-1、MyD88-L265、任何NF-κB激活蛋白或蛋白片段、NF-κB途径抑制剂的任何抑制剂、能够选择性激活NF-κB的基因编辑系统、选择性激活NF-κB的RNA干扰系统以及其任何组合。在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂被表达为具有FKBP结构域的一个或多个拷贝的融合构建体。在另一个或进一步的实施例中，所述细胞外抗原特异性结构域选自由以下组成的群组：对预定的靶抗原具有特异性的抗体或其片段的重链(vH)可变区；对预定的靶抗原具有特异性的抗体或其片段的轻链(vL)可变区；对预定的靶抗原具有特异性的单链可变片段(scFv)或其片段；对预定的靶抗原具有特异性的抗体片段(例如，Fv、Fab、(Fab′)2)；对预定的靶抗原具有特异性的单结构域抗体(SDAB)片段；对预定的靶抗原具有特异性的骆驼科动物vHH结构域；对预定的靶抗原具有特异性的非免疫球蛋白抗原结合支架；对预定的靶抗原具有特异性的受体或其片段；对预定的靶抗原具有特异性的配体或其片段；对一种或多种预定的靶抗原具有特异性的双特异性-抗体、-抗体片段、-scFV、-vHH、-SDAB、-非免疫球蛋白抗原结合支架、-受体或-配体；以及自身抗原或其片段。

本公开还提供了至少一种载体，其包含本文及以上描述的任何前述多核苷酸构建体中的至少一种多核苷酸。在一个实施例中，所述载体选自由以下组成的群组：DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、睡美人转座子载体和piggybac转座子载体。

本公开还提供了免疫效应细胞或干细胞，其包含至少一种本文及以上所述的重组多核苷酸、构建体或载体。在一个实施例中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在另一个或进一步的实施例中，所述免疫效应细胞是人T细胞、人NKT细胞或合成的T细胞、NK细胞或可以产生免疫效应细胞的干细胞，任选地，其中所述T细胞是二酰甘油激酶(DGK)和/或Ikaros缺陷的和/或Brd4缺陷的。

本公开还提供了一种方法，其用于(i)延长表达免疫细胞的寿命，(ii)刺激免疫细胞的增殖，(iii)刺激免疫细胞产生细胞因子，(iv)增强免疫细胞的抗原呈递，(v)保护免疫细胞免于凋亡，所述方法包括用编码选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽的多核苷酸转染或转化免疫细胞。在一个实施例中，所述选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽选自由以下组成的群组：vFLIP K13、K13-opt、NEMO突变体、NEMO融合蛋白、IKK1-S176E-S180E、IKK2-S177E-S181E、RIP、IKKα、IKKβ、Tcl-1、MyD88-L265、任何NF-κB激活蛋白或蛋白片段、NF-κB途径抑制剂的任何抑制剂、其任何同源物或变体以及其任何组合。在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽以组成型或诱导型方式表达在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽通过使T细胞与化合物接触来进行翻译后控制。在另一个或进一步的实施例中，所述选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽表达为具有FKBP结构域的一个或多个拷贝的融合构建体。在另一个或进一步的实施例中，通过施用治疗有效量的诱导FKBP结构域二聚的化合物将所述选择性NF-κB激活剂或NF-κB特异性刺激多肽的活性控制在翻译后水平。在另一个或进一步的实施例中，所述化合物是AP20187或利米度塞。

本公开还提供了一种制备表达非天然存在的免疫受体的免疫效应细胞的方法，包括在使得非天然存在的免疫受体得到表达的条件下，将本公开的至少一种载体或至少一种重组多核苷酸构建体引入免疫效应细胞或可以产生免疫效应细胞的造血干细胞或祖细胞中，并且所述免疫效应细胞与缺乏NFkB特异性刺激多肽的CAR-T细胞相比包含(i)延长的寿命，(ii)改善的T细胞增殖和/或(iii)减少的凋亡。在另一个或进一步的实施例中，所述方法进一步包括提供免疫效应细胞群；和从所述群中去除调节性T细胞，从而提供调节性T衰竭的细胞群；其中所述步骤在将载体或编码CAR和/或NFkB特异性刺激多肽的重组多核苷酸引入所述群之前进行。在另一个或进一步的实施例中，使用抗CD25抗体或抗GITR抗体从所述细胞群中去除调节性T细胞。在另一个或进一步的实施例中，所述方法进一步包括：提供免疫效应细胞群；和从所述群中富集P-糖蛋白(P-gp或Pgp；MDR1、ABCB1、CD243)阳性细胞，从而提供富集P-糖蛋白(P-gp或Pgp；MDR1、ABCB1、CD243)的细胞；其中所述步骤在将载体或编码CAR和/或NFkB特异性刺激多肽的重组多核苷酸引入之前或之后进行。在另一个或进一步的实施例中，使用选自由以下组成的群组的任何一种或多种方法来富集所述P-糖蛋白阳性细胞：i)使用一种P-糖蛋白特异性抗体或多种P-糖蛋白特异性抗体的混合液进行免疫选择，ii)在P-糖蛋白作为泵起作用的条件下，用一种或多种荧光染料进行染色并富集较少被染料染色的细胞，所述荧光染料是P-糖蛋白、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)、阿霉素和放线菌素D的底物，iii)选择对作为P-糖蛋白底物的光毒性化合物具有抗性的细胞，所述光毒性化合物如以下中的任何一种或多种：TH9402、2-(4，5-二溴-6-氨基-3-亚氨基-3H-呫吨-9-基)-苯甲酸甲酯盐酸盐、2-(4，5-二溴-6-氨基-3-亚氨基-3H-呫吨-9-基)-苯甲酸乙酯盐酸盐、2-(4，5-二溴-6-氨基-3-亚氨基-3H-呫吨-9-基)-苯甲酸辛酯盐酸盐、2-(4，5-二溴-6-氨基-3-亚氨基-3H-呫吨-9-基)-苯甲酸正丁酯盐酸盐、2-(6-乙基氨基-3-乙基亚氨基-3H-呫吨-9-基)-苯甲酸正丁酯盐酸盐或其衍生物或其组合，以及iv)选择对作为P-糖蛋白底物的细胞毒性化合物具有抗性的细胞，所述细胞毒性化合物如长春新碱、长春碱、紫杉酚、紫杉醇、米托蒽醌、依托泊苷、阿霉素、柔红霉素和放线菌素-D。

本公开还提供了一种产生RNA工程细胞群的方法，其包含将体外转录的一种或多种RNA或合成的一种或多种RNA引入细胞或细胞群中，其中所述一种或多种RNA包含根据本公开的一种或多种重组多核苷酸。

本公开还提供了一种为受试者提供抗疾病免疫的方法，其包含向所述受试者施用有效量的本公开的免疫效应细胞或可以产生免疫效应细胞的干细胞，其中所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，或自体NKT细胞或同种异体NKT细胞，或可以产生免疫效应细胞的自体或同种异体造血干细胞，或可以产生免疫效应细胞的自体或同种异体iPSC。在另一个或进一步的实施例中，所述同种异体T细胞或同种异体NKT细胞或造血干细胞或iPSC缺乏功能性TCR或功能性HLA的表达或功能性TCR或功能性HLA的表达低。

本公开还提供了一种包含免疫效应细胞或可以产生免疫效应细胞的干细胞的组合物，其包含非天然存在的免疫受体和选择性NFkB激活剂，其中所述非天然存在的免疫受体包含与相关的疾病相关抗原结合的抗原结合结构域，所述疾病相关抗原选自由以下组成的群组：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、VEGFR2/KDR、LewsAg、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、绒毛膜***受体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、KSHV-K8.1蛋白、KSHV-gH蛋白、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、粘连蛋白-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原。

本公开还提供了一种治疗或预防受试者的与疾病相关抗原的表达相关的疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效量的包含非天然存在的免疫受体和选择性NFkB激活剂的免疫效应细胞，其中所述非天然存在的免疫受体包含与相关的疾病相关抗原结合的抗原结合结构域，所述疾病相关抗原选自由以下组成的群组：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体HI(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、绒毛膜***受体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、KSHV-K8.1蛋白、KSHV-gH蛋白、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、粘连蛋白-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原，从而治疗受试者或预防受试者的疾病。在另一个或进一步的实施例中，所述与疾病相关抗原的表达相关的疾病选自由以下组成的群组：增殖性疾病、癌前状态、癌症和与疾病相关抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在另一个或进一步的实施例中，所述癌症是选自以下中的一种或多种的血液学癌症：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、急性B细胞淋巴性白血病(B-ALL)、急性T细胞淋巴性白血病(T-ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症或白血病前期。在另一个或进一步的实施例中，所述癌症选自由以下组成的群组：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、默克尔细胞癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移性病变。在另一个或进一步的实施例中，所述疾病与病毒感染有关，所述病毒包括但不限于HIV1、HIV2、HTLV1、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒8、流感病毒、副流感病毒、禽流感病毒、MERS和SARS冠状病毒、克里米亚刚果出血热病毒、鼻病毒、肠病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒、RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、水痘病毒、单纯疱疹病毒1和2、水痘带状疱疹病毒、HIV-1、HTLV1、肝炎病毒、肠病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、尼帕和裂谷热病毒、日本脑炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒、或与结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌属、耶氏肺孢子虫、弓形体病、立克次氏体、诺卡氏菌、曲霉菌、毛霉菌或念珠菌。在另一个或进一步的实施例中，所述疾病是免疫或退行性疾病，包括但不限于糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、寻常型天疱疮、强直性脊柱炎、桥本氏甲状腺炎、SLE、结节病、硬皮病、混合性***病、移植物抗宿主病或阿尔茨海默氏病。

在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。通过说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1描绘了抗体、T细胞受体(TCR)、CAR和下一代CAR和SIR的草图。

图2描绘了将第二代CAR生物活性和结构与描绘了缺乏CD28或41BB但表达NF-κB刺激分子(NEMO和/或K13，或其突变体)的CAR的本公开的实施例进行比较的草图。

图3显示了mNEMO-K270A、hNEMO-K277A对NF-κB的强激活以及hNEMO-K277I和hNEMO-K277G突变体对NF-κB的弱激活。

图4显示了靶向MPL并使用161-scFv靶向结构域的双特异性T细胞衔接子的活性。将HEL-pLenti-hGluc和T细胞分别与以下上清液在4℃预孵育2小时：单独的培养基和pLenti-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02(042517-P02-SC)。孵育后，将细胞在U型底96孔板中以1∶1或5∶1的E∶T比在37℃下共培养4小时。将50μl细胞+上清液/孔转移至384孔板，一式三份。使用15ul CTZ测定缓冲液(1∶100)进行hGLuc测定。

图5A-C显示了靶向进入TRAC基因座中的CRISPR/Cas9介导的TFP基因和拯救TRAC表达的策略。在顶部，具有TRAC第一外显子5′端(灰色)的TRAC基因座，TRAC gRNA(蓝色)和相应的PAM序列(红色)。两个蓝色箭头指示预测的Cas9双链断裂。在底部，CRISPR/Cas9靶向整合到TRAC基因座中。靶向构建体(AAV)含有剪接受体(SA)，后面是F2A编码序列、TFP基因和polyA序列，其两侧为与TRAC基因座同源的序列(LHA和RHA，左右同源臂)。一旦整合，内源TCRα启动子驱动TFP表达，而TRAC基因座被破坏。B)靶向构建体表达TFP并通过2A序列共表达TRAC(TCRα恒定链)。C)靶向构建体表达TFP，并通过2A序列共表达信号肽，所述信号肽与存在于RHA中的第一外显子符合读框，使得TCRα启动子驱动TFP表达，以及驱动缺乏TCRα可变区(TRAV)的TRAC表达；TRAJ，TCRα连接区；2A，自切割2A序列。pA：SV40/β-珠蛋白polyA序列。

图6A-E显示了用于靶向盒以将Ab-TCR导向至TRAC基因座的各种构建体设计。

图7A-F显示了用于靶向盒以将cTCR(SIR)导向至TRAC基因座的各种构建体设计。

图8A-D显示了用于靶向盒以将cTCR(SIR)和TCR导向至TRAC基因座的各种构建体设计。

图9A-D显示了用于靶向盒以将单链cTCR(SIR)导向至TRAC基因座的各种构建体设计。

具体实施方式

通过将基于scFv(单链片段可变)的抗原结合结构域与惰性CD8跨膜结构域融合构建最初的第一代CAR，所述跨膜结构域与源自CD3-ζ或Fc受体γ链的胞质信号传导结构域连接(图1)。

尽管CD3-ζ链聚集足以使T细胞具有裂解活性，但它们未能引发强烈的细胞因子应答，包括白介素-2(IL-2)，并且在重复暴露于抗原时支持T细胞扩增。为了最佳的激活和增殖，T细胞既需要T细胞受体的参与和信号传导，也需要通过T细胞上的共刺激受体(即CD28、4-1BB、OX-40)与由靶向肿瘤细胞或抗原呈递细胞表达的同源配体(即CD80/86、4-1BBL、OX-40L)结合的共刺激信号传导。为了克服T细胞共刺激的缺乏，通过合并T细胞共刺激受体的胞质信号传导结构域进一步修饰第一代CAR。这些第二代CAR增强了信号传导强度和修饰T细胞的持久性，从而具有优异的抗肿瘤活性。通过第2代CAR构建体中存在的共刺激结构域进行信号传导，导致激活若干信号传导途径，如NF-κB、AKT和ERK。特别地，AKT激活促进T细胞激活，但也显示出导致终末分化、耗竭和缺乏持久性。

图2描绘了如上所述的第2代CAR的草图，旁边是第一代CAR加上特异性NF-κB刺激分子，描绘了与其各自相关的生物活性。

当前临床使用中的CAR构建体是人工设计的，因为它们代表了若干不同蛋白质的融合。特别地，在第2代CAR构建体中包含共刺激结构域导致通过受体的非生理信号传导，这又可能有助于其毒性。一些CAR显示出固有的不依赖于抗原的信号传导，这导致不受限制的细胞激活，最终导致细胞凋亡，独立于同源抗原的过量细胞因子释放和免疫力衰竭。通过共刺激结构域(例如，41BB和CD28结构域)进行的固有信号传导显示出阻碍了T细胞存活。因此，需要改进CAR设计，以实现CAR修饰T细胞的长期持久性，而没有过度毒性的风险，如细胞因子释放综合征(CRS)。

为了克服常规第2代CAR的某些设计限制，已经描述了若干替代设计，统称为下一代CAR，包括Ab-TCR(WO 2017/070608 A1，通过引用并入本文)、TCR受体融合蛋白或TFP(WO2016/187349 A1，通过引用并入本文)、合成免疫受体(SIR)(参见WO 2018/102795 A1，通过引用并入本文)、三功能T细胞抗原偶联剂(Tri-TAC)(参见WO 2015/117229 A1，通过引用并入本文)。通常，这些替代性CAR设计缺乏共刺激结构域。

为了克服AKT激活和固有信号传导的局限性，本公开证明了使用选择性NF-κB激活剂，如NEMO突变体(例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A)、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E来提供共刺激功能。与激活大量信号传导途径的41BB和CD28衍生的共刺激结构域相反(参见图1中的第2代和第3代CAR)，选择性NF-κB激活剂，如hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E通过激活I-κB激酶(IKK)复合物来选择性激活NF-κB途径。本公开还描述了可替代的非天然存在的免疫受体(例如，CAR)设计，其中共刺激由包含与非天然存在的免疫受体(例如，CAR)共表达的选择性NF-κB激活剂的辅助模块提供。但是，与其中共刺激结构域是成熟CAR多肽的组件的第2代CAR构建体相比，包含选择性NF-κB激活剂的辅助模块并非必须是成熟免疫受体(例如，CAR)多肽的组成部分。这种设计具有优势，因为它克服了由于通过共刺激结构域的聚集和非生理性信号传导而引起的固有信号传导、过量的细胞因子产生和T细胞早期耗竭的问题。本公开进一步提供了一种通过与转换结构域融合，如与FKBP12v36结构域的串联拷贝融合使NF-κB激活剂表达来调节NF-κB激活剂的活性的方法。

本公开证明了选择性NF-κB激活剂，如例如hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176-S180E和K13-opt在T细胞中的表达扩展了其在培养中长期增殖而不经历衰老的能力，从而首次证明了单一途径(即NF-κB)的激活足以推迟T细胞的衰老。例如，与含有41BB共刺激结构域的第2代CAR构建体相比，共表达hNEMO-K277A或hNEMO-K277A-δV249-K255但缺乏任何共刺激结构域的CD19-CAR构建体表现出优异的体内功效。本公开进一步证明了NF-κB的选择性激活足以促进T细胞的增殖，延迟衰老并改善T细胞用于包括CAR-T细胞疗法在内的过继性细胞疗法的性能。因此，本公开提供了通过免疫细胞中NF-κB途径的选择性或优先(即，没有AKT激活)激活来增强免疫细胞，例如T细胞如CAR-T或TCR-T或SIR-T细胞，和/或表达非天然存在的免疫受体的免疫细胞的存活、增殖、细胞因子分泌、延迟耗竭和衰老并改善体内扩增、持久性和抗肿瘤活性的组合物和方法。此外，本公开证明了使用选择性NF-κB激活剂，如例如hNEMO-K277A或hNEMO-K277A-δV249-K255，不限于其在CAR-T细胞中的用途，因为它们可以在用于过继细胞治疗的任何T细胞中使用，包括在表达内源TCR的T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)、外源TCR、SIR等中使用。

本公开进一步证明了选择性NF-κB激活剂，如例如hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E可用于通过促进免疫细胞(例如，抗原呈递细胞，如树突状细胞)的细胞因子分泌和抗原呈递来改善疫苗的性能。例如，表达选择性NF-κB激活剂(如hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E)的骨髓衍生的树突状细胞(DC)与对照DC相比，显示出优异的细胞因子产生、抗原呈递和免疫应答(例如，抗肿瘤应答或抗感染剂应答)。

本公开进一步提供了NF-κB激活剂，包括人类来源的因此免疫原性较低的选择性NF-κB激活剂。

本公开进一步提供了NF-κB激活剂，包括可以在细胞质中表达的选择性NF-κB激活剂。本公开进一步提供了NF-κB激活剂，包括选择性NF-κB激活剂，其具有组成型活性并且由于其激活NF-κB的能力而不需要刺激(例如，用配体处理)。

本公开进一步提供了若干抗原结合结构域，其可用于产生常规CAR(例如，含有41BB共刺激结构域的第2代CAR)以及下一代CAR如SIR、zSIR、Ab-TCR和TFP，以应用于过继性细胞疗法。在一些实施例中，这些抗原结合结构域衍生自在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中表达的抗体和靶抗原。这些抗原结合结构域的vL、vH和scFv片段的SEQ ID No显示在表6A-C中。轻链(vL)和重链(vH)的互补决定区(CDR)的SEQ ID No显示在表6A-B中。基于这些抗原结合结构域的含有41BB共刺激结构域的示例性第2代CAR和下一代CAR(例如，zCAR-K13、zCAR-NEMO-K277A、SIR、Ab-TCR和TFP)的核酸和氨基酸SEQ ID显示在表10-14中。含有这些抗原结合结构域的CAR显示出不同的体外和体内特性，如与靶抗原的结合亲和力、细胞因子分泌、增殖、细胞毒性、耗竭和长期持久性。因此，含有这些靶抗原的非天然存在的免疫受体，例如CAR，可以用于产生多样化的免疫应答。包含本公开的抗原结合结构域的表达CAR的多核苷酸、多肽、表达构建体、重组工程细胞，以及制备和使用这种多肽、多核苷酸和细胞的方法描述于本领域已知的方法和通过引用整体并入本文的PCT/US2017/024843、WO 2014/160030 A2、WO 2016/187349 A1、WO 2017/070608 A1和WO 2018/102795 A1中描述的方法中。可以使用本领域已知的方法和通过引用整体并入本文的WO 2017/070608 A1、WO 2016/187349 A1、WO 2018/102795 A1、WO 2015/117229 A1中描述的方法产生表达包含这些抗原结合域的CAR的免疫细胞，并将其用于癌症、传染性和免疫性病症的过继性细胞疗法。

本公开进一步提供了用于产生表达TCR和CAR(包括下一代CAR(例如，TFP、SIR、Ab-TCR、cTCR))的同种异体T细胞的新方法，以用于现成的过继性细胞疗法。

本公开进一步提供了使用表达TCR和CAR(包括下一代CAR(例如，TFP、SIR、Ab-TCR、cTCR))的自体和同种异体T细胞的联合疗法的新方法。本公开提供了通过在表达TFP的细胞中共表达TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的恒定链在缺乏天然TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ链表达的T细胞中恢复基于CD3ε、CD3γ和CDδ链的TFP的表达和/或活性的方法。本公开进一步提供了通过在表达TFP的细胞中共表达编码TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的恒定链的全长或片段的SIR或Ab-TCR在缺乏天然TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ链表达的T细胞中恢复基于CD3ε、CD3γ和CDδ链的TFP的表达和/或活性的方法。本公开提供了在缺乏天然TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ链的T细胞中基于CD3ε、CD3γ和CDδ链的TFP可以与编码TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的恒定链的SIR或Ab-TCR组合，以用于同种异体和现成的疗法。

如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“细胞”包括多个这种细胞，并且提及“多核苷酸”包括提及一个或多个多核苷酸等。

另外，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包含(comprise、comprises、comprising)”和“包括(include、includes和including)”是可互换的，而不意在限制。

将进一步理解的是，在各个实施例的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以可替代地使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”来描述实施例。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Allen等人，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)》第22版，英国医药出版社(PharmaceuticalPress)(2012年9月15日)；Hornyak等人，《纳米科学和纳米技术引言(Introduction toNanoscience and Nanotechnology)》，CRC出版社(CRC Press)(2008)；Singleton和Sainsbury，《微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology)》第3版，修订版，J.Wiley&Sons(纽约，纽约州2006)；Smith，March《高级有机化学反应，机理和结构(Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure)》第7版，J.Wiley&Sons(纽约，纽约州2013)；Singleton，《DNA和基因组技术词典(Dictionary of DNA and Genome Technology)》第3版，Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)》第4版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(冷泉港，纽约，2012)为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。有关如何制备抗体的参考，参见Greenfield，《抗体实验室手册(Antibodies A Laboratory Manual)》第2版，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约，2013)；

和Milstein“通过细胞融合产生特异性抗体的组织培养物和肿瘤系的推论(Derivation of specific antibody-producingtissue culture and tumor lines by cell fusion)”，《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》1976年7月，6(7)：511-9；Queen和Selick，《人源化免疫球蛋白(Humanized immunoglobulins)》，美国专利第5,585,089号(1996年12月)；以及Riechmann等人，“重塑人类抗体以进行治疗(Reshaping human antibodies for therapy)”，《自然(Nature)》1988年3月24日，332(6162)：323-7。本文提供的所有标题和副标题仅是为了易于阅读，而不应解释为限制本发明。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和具体实例仅是说明性的，而不意在进行限制。

本文所有出版物均以相同程度通过引用并入本文，如同每个单独出版物或专利申请都具体且单独地指出通过引用并入。所引用的任何参考文献均不承认其中提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或具体或隐含引用的任何出版物均是现有技术。

当涉及可测量值如量、时点等时，术语“约”旨在涵盖具体值±20％或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或者在某些情况下±0.1％的变化，因为这种变化适用于执行所公开的方法或描述本文的组合物。而且，任何值或范围(例如，小于20或类似术语)明确地包括在这种值之间或最多该值的任何整数。因此，例如，“一至五个突变”明确地包括1、2、3、4和/或5个突变。

术语“Ab-TCR”或“AbTCR”是指如WO 2017/070608 A1中所述的下一代CAR平台，其通过引用并入本文。在一个实施例中，Ab-TCR包含与融合至能够募集至少一个TCR信号传导模块的TCR模块的靶抗原特异性结合的抗体部分。可以在Ab-TCR的构建体中使用的示例性TCR模块以SEQ ID NO：959-964(表6D)并在WO 2017/070608 A1中提供，其通过引用并入本文。在TCR模块TCRb-IAH-6MD中，在人TCRb链(SEQ ID NO：15053)(参见表4、5和6D)中发现的三个氨基酸残基(F133、E136和Q139)分别突变为在鼠TCRb链中发现的残基异亮氨酸、丙氨酸和组氨酸，以便增强这一模块的表达。类似地，在TCR模块IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD中，在人TCRa链(SEQ ID NO：15041)中发现的四个氨基酸残基(P91、E92、S93、S94)突变为在鼠TCRa链中发现的残基S、D、V、P，以便增强这一模块的表达(参见表3和6D)。共表达编码NEMO-K277A的辅助模块的示例性Ab-TCR以SEQ ID NO：3124-3523(表14)提供。但是，编码NEMO-K277A的辅助模块是任选的。可以在没有NEMO-K277A的情况下构建具有本公开中描述的抗原结合结构域(即，vL和vH片段、配体和受体等)的Ab-TCR。这样，这一辅助模块以及上游Furine-SGSG-F2A序列可从Ab-TCR中删除。可替代地，可以将编码NEMO-K277A的辅助模块替换为编码其他蛋白质的辅助模块，如hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E和MyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2等。此外，Ab-TCR中存在的TCR模块可以被WO 2017/070608 A1中所述的其他TCR模块代替。例如，由SEQ ID NO：3124-3323表示的Ab-TCR含有TCR模块IgCL-TCRb-IAH-6MD(SEQ ID NO：960)和IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD(SEQ ID NO：963)，它们可以分别被TCR模块IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD(SEQ ID NO：961)和IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD(SEQ ID NO：964)代替。共表达编码NEMO-K277A的辅助模块并含有TCR模块IgCL-TCRg-6MD(SEQ ID NO：959)和IgG1-CH1-TCRd-6MD(SEQ ID NO：962)的示例性Ab-TCR提供在SEQ ID NO：3324-3523中。这些构建体中的抗原结合结构域的顺序与表14中所示的构建体的顺序相同，并且因此靶向特定抗原并含有特定抗原结合结构域的基于IgCL-TCRg-6MD(SEQ ID NO：959)和IgG1-CH1-TCRd-6MD(SEQ ID NO：962)的Ab-TCR可以通过参考表14来鉴定。

术语“辅助模块”是指在免疫细胞(例如，T细胞，如CAR-T细胞或TCR-T细胞)中表达以降低、调节或修饰免疫细胞的活性的以下中的一种或多种：hNEMO-K277A(或NEMO-K277A)、hNEMO-K277A-δ-V249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E(或IKK2-SS/EE)、IKK1-S176E-S180E(或IKK1-SS/EE)、MyD88-L265P、TCL-1a、MTCP-1、CMV-141、41BBL、CD40L、vFLIP-K13、MC159、cFLIP-L/MRITα、cFLIP-p22、HTLV1 Tax、HTLV2 Tax、HTLV2Tax-RS突变体、FKBPx2-K13、FKBPx2-HTLV2-Tax、FKBPx2-HTLV2-Tax-RS、IL6R-304-vHH-Alb8-vHH、IL12f、PD1-4H1 scFV、PD1-5C4 scFV、PD1-4H1-Alb8-vHH、PD1-5C4-Alb8-vHH、CTLA4-易普利姆玛-scFv、CTLA4-易普利姆玛-Alb8-vHH、IL6-19A-scFV、IL6-19A-scFV-Alb8-vHH、sHVEM、sHVEM-Alb8-vHH、hTERT、Fx06、靶向shRNA的Brd4、IgSP-[hTRAC-opt2]、IgSP-[hTRBC-opt2]以及其组合。在一些实施例中，辅助模块与免疫受体如CAR或TCR共表达以增加、降低、调节或修饰CAR或TCR或表达CAR或表达TCR的细胞的表达或活性。可以使用单个载体或使用两个或更多个不同的载体将辅助模块与CAR或TCR共表达。在进一步的实施例中，辅助模块包含FKBP(FK506结合蛋白)-融合蛋白，如FKBPx2-NEMO，其活性可以通过施用二聚体分子来控制。在一些实施例中，辅助模块在抗原呈递细胞，例如树突状细胞中表达。

如本文所用，“亲和力”旨在描述结合强度的量度。在某些情况下，亲和力取决于结合剂与其靶标之间(例如，抗体和包括对结合结构域具有特异性的表位的抗原之间)的立体化学拟合的紧密度，它们之间接触面积的大小以及带电和疏水基团的分布。亲和力通常是指结合剂与其靶标结合的“能力”。本领域中使用多种方法来测量“亲和力”。例如，用于计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。结合亲和力可以使用本领域已知的各种技术来确定，例如，表面等离振子共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术。确定结合亲和力的示例性方法采用表面等离子体共振。表面等离子体共振是一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，乌普萨拉，瑞典和皮斯卡塔韦，新泽西州)。如本文所用，术语“特异性结合”意指抗体与抗原之间的结合亲和力为至少10^-6M的接触。在某些方面，抗体以至少约10^-7M，并且优选10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M的亲和力接触。

如本文所用，“AKT途径”或“PI3K-AKT途径”是信号转导途径，其响应于细胞外信号而促进存活和生长。涉及的关键蛋白是PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)和Akt(蛋白激酶B)。

如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆或多克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以是“人源化”、“嵌合”或非人类抗体。

术语“抗体片段”指抗体的至少一部分，其保留与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′h)、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHl结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)如vL或vH、骆驼科vHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体以及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段也可以合并单结构域抗体、最大抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》23：1126-1136，2005)。抗原结合片段也可以基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)接枝到支架中(参见描述纤连蛋白多肽微抗体的美国专利第6,703,199号)。

术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者，并且其通常确定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

“抗癌剂”是指抑制异常细胞***和生长、抑制赘生性细胞的迁移、抑制侵袭性或防止癌症生长和转移的试剂。所述术语包括化学治疗剂、生物试剂(例如，siRNA、病毒载体如工程化MLV、腺病毒、递送细胞毒性基因的疱疹病毒)、抗体等。

术语“抗癌作用”是指可以通过各种方式表现出的生物学作用，包括但不限于肿瘤体积的减少，癌细胞数量的减少，转移数量的减少，预期寿命的增加，癌细胞增殖的减少，癌细胞存活的减少，或与癌症病况有关的各种生理症状的改善。“抗癌作用”也通过CAR首先预防癌症发生的能力来显示。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。这一免疫应答可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。本公开包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发期望的免疫应答的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可能是多肽以外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物成分的流体。

靶抗原的非限制性实例包括：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也称为CD2子集1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)；岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、***受体(CGHR或GR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、RasG12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、粘连蛋白-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突状细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将其呈递给T细胞。

术语“抗感染作用”是指可以通过各种方式表现出来的生物学作用，包括但不限于例如，感染剂效价的减少，感染剂菌落数的减少，与感染病况有关的各种生理症状的改善。“抗感染作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先在预防感染发生方面的能力表现。

术语“抗肿瘤作用”或“抗癌作用”是指可以通过各种方式表现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积的减小，肿瘤细胞数量的减少，肿瘤细胞增殖的减少或肿瘤细胞存活的降低。

“抗原结合结构域”或“抗原结合模块”或“抗原结合区段”或“抗原特异性结构域”(ASD)是指由于其一级、二级或三级序列、翻译后修饰和/或电荷以高特异性程度结合抗原导致的多肽或肽。抗原结合结构域可源自不同来源，例如抗体(全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体)、非免疫球蛋白结合蛋白、配体或受体。但是，有许多促进免疫应答的替代方法，如连接的细胞因子(导致识别带有细胞因子受体的细胞)、亲和体、天然存在的受体的配体结合结构域、受体的可溶性蛋白质/肽配体(例如，在肿瘤细胞上)、肽和疫苗，它们各自可用于本发明的各种实施例中。在一些实施例中，如本领域技术人员将理解的，几乎任何以高亲和力结合给定抗原的分子都可以用作ASD。在一些实施例中，抗原结合结构域包含T细胞受体(TCR)或其部分。在示例性实施例中，编码包含scFV的抗原结合结构域的核酸在本文以SEQ ID NO：642-902并在表6C中列出。在示例性实施例中，编码包含scFV的抗原结合结构域的氨基酸在本文表6C中以SEQ ID NO：4555-4815列出。

术语“缔合常数(Ka)”定义为受体与配体缔合的平衡常数。

“自身抗体”是指由对自身抗原具有特异性的B细胞产生的抗体。

术语“自身抗原”是指刺激自身免疫应答产生，如自身抗体产生的内源性抗原。自身抗原还包括来自正常组织的自身抗原或抗原，其是细胞介导的或抗体介导的免疫应答的靶标，可能导致自身免疫疾病的发展。自身抗原的实例包括但不限于桥粒芯蛋白1、桥粒芯蛋白3和其片段。

“亲和力”是指结合剂与其靶标之间的相互作用的强度(例如，抗体与其抗原靶标，受体与其同源物等之间的相互作用的强度)。亲和力可以是弱的或强的。计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能测定(例如，流式细胞术测定)中的抗体活性也反映了抗体亲和力。可以使用功能测定(例如，流式细胞术测定)在表型上表征和比较抗体和亲和力。

如本文所用，术语“主链”是指CAR(表1)和辅助模块的特定组合，如表2所述。在示例性实施例中，在表2中描述了包括各种主链的CAR和辅助模块的特定组合。在一个实施例中，CAR和辅助模块由单个核酸分子编码。在另一个实施例中，CAR由第一核酸分子编码，并且辅助模块由第二核酸分子编码。在一些实施例中，辅助模块由多于一个的核酸分子编码，取决于辅助模块中组分的数量。

如本文所用，“有益结果”可以包括但不限于减轻或缓和疾病状况的严重程度，防止疾病状况恶化，治愈疾病状况，防止疾病状况发展，降低患者发展疾病状况的机会和延长患者寿命或预期寿命。作为非限制性实例，“有益结果”或“期望结果”可以是缓和一种或多种症状，减轻缺陷程度，癌症进展的稳定(即，不恶化)状态，延迟或减慢转移或侵袭性，以及改善或缓解与癌症相关的症状。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个结构域(例如，可以以比非特异性结构域更高的亲和力与靶标结合的免疫球蛋白可变结构域序列)的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段、配体结构域或其片段(视情况而定)。所述术语涵盖抗体和抗体片段，或配体和配体片段。在另一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在另一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。双特异性分子可以是双特异性T细胞结合抗体，其中第一抗原结合结构域与T细胞上表达的抗原(例如，CD3ε)结合，并且第二抗原结合结构域与引起疾病或疾病相关细胞(例如，癌细胞)上表达的抗原结合。双特异性抗体可用于诱导针对表达被其第二抗原结合结构域识别的靶抗原的细胞的T细胞介导的细胞毒性。本公开中描述的抗原结合结构域可用于构建双特异性T细胞接合子。包含本公开中描述的抗原结合结构域(例如，scFv)的示例性双特异性T细胞接合子的核酸序列以SEQ ID NO：3545-3830表示(表13)。相应的氨基酸序列以SEQ ID NO：7458-7721表示。

“与...结合相同的表位”意指抗体、scFv或其他抗原结合结构域与靶抗原结合并具有与示例性抗体、scFv或其他抗原结合结构域相同的表位的能力。作为一个实例，可以使用标准表位作图技术来确定示例性抗体、scFv或其他结合剂和其他抗体的表位。本领域众所周知的表位作图技术包括《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，卷66(Glenn E.Morris编辑，1996)胡玛纳出版社(Humana Press)托托瓦，新泽西州中的表位作图方案。例如，线性表位可以通过例如在固体载体上同时合成大量的肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)，并且在肽仍然附着于载体时使肽与抗体反应来确定。这种技术是本领域已知的并且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人，(1984)《美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》8：3998-4002；Geysen等人，(1985)《美国科学学院学报》82：78-182；Geysen等人，(1986)《分子免疫学(Mol.Immunol.)》23：709-715中。CAR的抗原结合结构域结合的表位也可以通过表位聚类(Epitope Binning)测定来确定。表位聚类是用于表征然后分选针对靶蛋白的单克隆抗体文库的竞争性免疫测定。以成对方式相对于文库中的所有其他抗体测试针对类似靶标的抗体，以查看抗体是否阻断彼此与抗原表位的结合。在每种抗体具有针对文库中所有其他抗体产生的谱之后，相对于文库中其他抗体，为每种抗体产生竞争性阻断谱。密切相关的聚类谱表明抗体具有相同或密切相关的表位，并且被“聚类”在一起。类似地，构象表位易于通过确定氨基酸的空间构象来鉴定，如通过，例如氢/氘交换、X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，表位作图方案，见上文。蛋白质的抗原性区域也可使用标准抗原性和亲水性图鉴定，如使用例如可从Oxford Molecular Group得到的Omiga版本1.0软件程序计算的那些。这一计算机程序使用Hopp/Woods方法，Hopp等人，(1981)《美国科学学院学报》78：3824-3828；用于确定抗原性谱，以及Kyte-Doolittle技术，Kyte等人，(1982)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157：105-132；用于亲水性图。为了确定所选择的针对靶标(例如，CD19)的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用商业上可获得的试剂(Pierce，罗克福德，伊利若州)将每种抗体生物素化。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用CD19胞外结构域包被的ELISA板进行。生物素化的mAb结合可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测。由本公开的scFv和CAR结合的人CD20抗原的示例性表位以SEQ ID NO：15149-15154提供。由本公开的scFv和CAR结合的人BCMA的示例性表位以SEQ ID NO：15155-15159提供。由本公开的scFv和CAR结合的人MPL抗原的示例性表位提供于SEQ ID NO：15160中。

如本文所用，术语“其生物学等效物”在指参考蛋白质、抗体或其片段、多肽或核酸时意在与“其等效物”同义，意指具有最小同源性的同时仍保持期望结构或功能的那些蛋白质、抗体或其片段、多肽或核酸。除非在本文具体叙述，否则可以预期上述任何内容也包括其等效物。例如，等效物意指至少约70％同源性或同一性，或至少80％同源性或同一性，和可替代地，或至少约85％，或可替代地至少约90％，或可替代地至少约95％，或可替代地至少98％同源性或同一性，并且表现出与参考蛋白、多肽、抗体或其片段或核酸基本上等效的生物活性。可替代地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补物杂交的多核苷酸。或者，当提及多肽或蛋白质时，其等效物是由在严格条件下与编码参考多肽或蛋白质的多核苷酸或其互补物杂交的多核苷酸表达的多肽或蛋白质。

如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内都存在的非连续抗原结合位点。这些特定区域已经由Kabat等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chern.)》252：6609-6616(1977)；Kabat等人，美国卫生与公共服务部，″具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of proteins of immunological interest)″(1991)；Chothia等人，《分子生物学杂志》196：901-917(1987)；和MacCallum等人，《分子生物学杂志》25 262：732-745(1996)描述，当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，涉及抗体或移植抗体或其变体的CDR的任何一种定义的应用都旨在落入本文所定义和使用的术语的范围内。如本文所用，抗体的不同CDR也可以通过不同定义的组合来定义。例如，可以基于Kabat定义vHCDR1，并且可以基于Chothia定义VHCDR2。涵盖每个上述参考文献所定义的CDR的氨基酸残基如下：

CDR定义

(残基编号对应于鉴定的参考)

可以构成本公开的CAR的抗原结合结构域的不同vL和vH区段的CDR的SEQ ID分别以SEQ ID NO：13204-14121和SEQ ID NO：14122-15039(表6A，B)并在通过引用并入本文的PCT/US2017/064379中的表5至6中提供。

在一些实施例中，提及特异性结合靶抗原的抗原结合模块(如Fab样或Fv样抗原结合模块)是指所述抗原结合模块与靶抗原结合(a)亲和力是其对其他分子的结合亲和力的至少约10倍(例如，约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1000倍或更高)；或(b)K_d不超过其与其他分子结合的K_d的约1/10(例如，1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1175、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更少)。结合亲和力可以通过本领域已知的方法来确定，如ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)。K_d可以通过本领域已知的方法来确定，如利用例如Biacore仪器的表面等离子共振(SPR)测定或利用例如Sapidvne仪器的动力学排阻测定(KinExA)。

“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状况，典型地以细胞无序生长为特征。癌症的实例包括但不限于B细胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、皮肤癌、脑瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、***癌、原发灶未知的癌症、内分泌癌、睾丸癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、生殖器官癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑色素瘤、头颈癌、脑癌(例如，多形胶质母细胞瘤)、***癌，包括但不限于雄激素依赖性***癌和非雄激素依赖性***癌以及白血病。其他癌症和细胞增殖性病症在本领域中将是容易识别的。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体，例如扩散或循环的肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵入性阶段无关。示例性实体瘤包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如腺癌、肉瘤和癌，如影响乳腺、肝、肺、脑、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、膀胱上皮细胞)、***和咽的那些。腺癌包括癌症，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施例中，癌症是黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤。还可以使用本公开的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移性病变。可以治疗或预防的其他癌症的实例包括胰腺癌、骨癌、皮肤癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、头颈癌、***区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病(包括急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱导的那些)以及所述癌症的组合。转移性癌症，例如表达PD-L1的转移性癌症的治疗(Iwai等人(2005)《国际免疫学(Int.Immunol.)》17：133-144)可以使用本文描述的抗体分子实现。可抑制其生长的示例性癌症包括典型地对免疫疗法有反应的癌症。此外，可以使用本文所述的分子治疗复发性或难治性恶性肿瘤。

“化学治疗剂”是已知可用于癌症化学疗法的化合物。化疗治疗剂的非限制性实例可包括烷基化剂，如噻替哌(thiotepa)和

环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和优多帕(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它酮(bullatacinone))；喜树碱(包括拓扑替康(topotecan)合成类似物)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如《德国应用化学英文国际版(Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.)》33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨喋呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；

多糖复合物(JHS天然产品，尤金，俄勒冈州)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(；sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞图辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类化合物，例如

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，普林斯顿，新泽西州)、紫杉醇的无克列莫佛的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(美国制药伙伴公司(American Pharmaceutical Partners)，Schaumberg，伊利若州)和

多西他塞(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer，安东尼，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBINE；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康和5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；亚叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃罗替尼(erlotinib))和VEGF-A抑制剂和上述任何一种的药学上可接受的盐，酸或衍生物或其组合。

“嵌合抗原受体”(CAR)是使用称为过继性细胞转移的技术的预期用作癌症疗法的人工的(非天然存在的)免疫细胞(例如，T细胞)受体。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。复合物的抗原结合、信号传导和刺激功能已通过基因重组方法控制至一条多肽链，所述多肽链通常被称为嵌合抗原受体(CAR)。参见，例如，Eshhar，美国专利第7,741,465号；Eshhar，美国专利申请公开第2012/0093842号。专门构建CAR，以响应CAR结合的特定抗原刺激T细胞激活和增殖。通常，CAR是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两个，当在免疫效应细胞中表达时，其为细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性以及细胞内的信号产生。在一些实施例中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，这一组多肽彼此邻接。一方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一方面，胞质信号传导结构域进一步包含衍生自至少一种如下文定义的共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个实施例中，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-lBB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个实施例中，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N端)包含任选的前导序列。在一个实施例中，CAR进一步包含在细胞外抗原结合结构域的N端处的前导序列，其中在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间，前导序列任选地从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。在各种实施例中，CAR是包含抗原特异性结构域(ASD)、铰链区(HR)、跨膜结构域(TMD)、任选的共刺激结构域(CSD)和细胞内信号传导结构域(ISD)的重组多肽。在第1代CAR构建体中通常不存在任选的共刺激结构域。包含本公开中描述的不同的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)并共表达编码NEMO-K277A和PAC的辅助模块的若干示例性的第1代CAR的靶抗原、抗原结合结构域名称和核酸序列以SEQ ID NO：1594-1899表示(表12)。这些CAR构建体携带人CD8信号肽、CD8铰链和跨膜区以及人CD3ζ细胞内信号传导结构域。这些构建体还在抗原结合结构域和CD8铰链区之间携带MYC接头，这是任选的。包含本公开中描述的不同的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)并共表达编码vFLIP K13和PAC的辅助模块的若干示例性的第1代CAR的核酸序列以SEQ ID NO：1016-1317表示(表13)。包含本公开中描述的不同的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)并合并41BB共刺激结构域的若干示例性的第2代CAR的核酸序列以SEQ ID NO：1318-1593表示(表13)。这些CAR构建体还在抗原结合结构域和跨膜结构域之间携带MYC接头，并且携带通过Furine-SGSG-T2A序列与CAR盒分开的编码嘌呤霉素抗性基因(PAC)的辅助模块。在上述第1代和第2代CAR中，编码vFLIP-K13、NEMO-K277A和PAC的辅助模块是任选的。因此，可以在没有vFLIP-K13、NEMO-K277A和/或PAC的情况下构建具有本公开中描述的抗原结合结构域(即，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)的CAR。这样，这些辅助模块以及上游切割接头序列(例如，F2A、P2A或T2A)可以从由SEQ ID NO：1016-1899表示的CAR中删除。可替代地，编码vFLIP-K13、NEMO-K277A和/或PAC的辅助模块可以被编码其他蛋白的辅助模块替代，如hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E、以及MyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2、TCL-1A、MTCP-1和CMV-141等。如本文所用，术语“CAR”或“CARs”也涵盖将抗原特异性赋予细胞的较新方法，如抗体-TCR嵌合分子或Ab-TCR或Ab-TCR(WO2017/070608A1，通过引用并入本文)、TCR受体融合蛋白或TFP(WO 2016/187349 A1，通过引用并入本文)、合成免疫受体(SIR)(参见WO 2018/102795 A1，通过引用并入本文)、三功能T细胞抗原偶联剂(Tri-TAC)(参见WO 2015/117229 A1，通过引用并入本文)。包含本公开中描述的并基于CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ链的不同的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、vHH、配体和受体等)并共表达任选辅助模块NEMO-K277A的若干示例性的TFP的核酸序列分别以SEQ ID NO：1900-2205、2206-2511、2512-2817、2818-3123表示(表13)。表13中列出的不同CAR架构和BiTE的构建体中含有的抗原结合结构域的顺序与表12中给出的zCAR-K277A架构中的构建体的顺序相同。因此，可以通过检查表12和表13来确定属于给定架构(例如，zCAR-K13)并含有特异性抗原结合结构域的CAR的氨基酸和核酸SEQ IDNO。因此，表12显示，在zCAR-NEMO-K277A架构上并且含有huFMC63-11-(vL-vH)抗原结合结构域的CAR是表12中的第2种构建体，并且分别由核酸和氨基酸SEQ ID NO：1595和5508表示。可以通过检查表13来确定zCAR-K13架构上相应CAR的核酸和氨基酸SEQ ID No，其显示这一架构上的第2种构建体分别具有核酸和氨基酸SEQ ID NOs：1017和4930。可以使用类似的方法来确定属于不同架构和BiTE的其他CAR构建体的核酸和氨基酸SEQ ID No。表10提供了属于不同主链并基于HIV1-N49P6 vL和vH抗原结合结构域靶向HIV-1包膜糖蛋白的若干示例性CAR的核酸和氨基酸SEQ ID No。表11提供了属于表10所示主链但含有不同抗原结合结构域的若干示例性CAR的核酸和氨基酸SEQ ID No。因此，可以通过首先确定其在表10中的排名顺序来确定在包含表11中所示的抗原结合结构域的特定主链上的CAR的核酸和氨基酸SEQ ID No。因此，由于含有vFLIP-K13主链的第1代CAR是表10列表中的第三CAR，所以共表达vFLIP-K13并且含有HIV1-N49P7抗原结合结构域的第1代CAR的核酸SEQ ID NO可以容易地根据表11确定为SEQ ID NO：8740(即，所述系列中始于8738的第3个构建体)。使用类似的方法，确定这一CAR构建体的氨基酸SEQ ID NO为SEQ ID NO：11438。由于CAR在设计上是模块化的，因此本领域普通技术人员可以通过使用在本公开中公开的不同模块和示例性CAR和BiTE构建体的序列容易地确定含有不同抗原结合结构域或辅助模块的CAR/BiTE的核酸和氨基酸序列。典型地，使用“CAR-T细胞”，其是指经工程化以表达嵌合抗原受体的T细胞。因此，带有这种CAR的T淋巴细胞通常被称为CAR-T淋巴细胞。CAR还可以在除T细胞以外的细胞中表达，如在造血干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、NK细胞和巨噬细胞中。

“密码子优化”或“控制物种密码子偏好性”是指特定宿主细胞的优选密码子使用。如本领域技术人员所理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达是有利的。遗传密码是冗余的，具有64个可能的密码子，但大多数生物体典型地使用这些密码子的子集。在物种中最常使用的密码子被称为最优密码子，而不太常使用的密码子被分类为稀有密码子或利用率低密码子。

可以制备含有特定原核或真核宿主优选密码子的优化编码序列(也参见Murray等人(1989)《核酸综述(Nucl.Acids Res.)》17：477-508)，例如，与由非优化序列产生的转录物相比，提高翻译速率或产生具有期望特性的重组RNA转录物，如更长的半衰期还可以修饰翻译终止密码子以反映宿主偏好。本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性质，可以使用核苷酸序列不同的多种DNA化合物来编码本公开的给定多肽。

如本文所用，“共表达”是指两个或更多个多核苷酸或基因的表达。基因可以是编码例如单个蛋白或嵌合蛋白作为单个多肽链的核酸。本文所述的CAR或TCR可由单个多核苷酸链编码并表达为单多肽链，随后将其切割成不同的多肽，每个多肽代表不同的功能单元。在一些实施例中，当CAR或TCR由两个或更多个功能多肽单元组成时，使用一个或多个多核苷酸链来共表达不同的功能单元。在一个实施例中，共刺激由辅助模块提供，所述辅助模块与CAR或TCR共表达，但不是CAR或TCR多肽的组成部分。这种为CAR-或TCR-表达细胞或任何细胞提供共刺激但不是CAR或TCR多肽的组成部分的辅助模块被称为CAR非依赖性共刺激模块或CICM。在另一个实施例中，不同的多核苷酸链通过编码可切割接头(例如，T2A、F2A、P2A、E2A等)的核酸序列连接(表6D)。在另一个实施例中，还在可切割接头序列的上游添加Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG)基序(SEQ ID NO：4844)，以增强切割效率。编码CAR或TCR的不同单元的多核苷酸可以通过IRES(内部核糖体进入位点)序列连接。可替代地，CAR或TCR的不同功能单元由两个不同的多核苷酸编码，所述多核苷酸不通过接头连接，而是由例如两个不同的载体编码。示例性可切割接头和Furine切割位点的核酸和氨基酸序列提供于表6D中。

“保守取代”或“保守序列修饰”是指不显著影响或改变编码蛋白的结合特性或功能的氨基酸修饰。例如，“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变本公开的CAR构建体的结合特征或功能的氨基酸修饰(例如，恒定链、抗体、抗体片段或非免疫球蛋白结合结构域中的保守改变)。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的CAR中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的结合和/或功能测定测试改变的CAR。

术语“T细胞受体-α的恒定区”或“T细胞受体-α的恒定链”或“TCRα”或“Cα”被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的以SEQ ID NO：15041提供的蛋白质或等效残基(即，同源物)。本公开还提供了可用于SIR和Ab-TCR的构建的TCRα多肽的某些突变(表3和6D)。例如，证明表达增加和错配减少的Cα突变位点位于SEQ ID NO 15041的91、92、93和94位。在Cα中具有Thr 48 Cys(T48C)突变且在Cβ1或Cβ2链中具有Ser-57-Cys(S57C)突变的TCR多肽(在本文中其他位置有更全面的描述)导致两条TCR恒定链(α和β)之间的额外的二硫键。这又导致在免疫细胞中与内源TCR链的错配减少和功能性增强。类似地，在Cα(SEQ ID NO：15048)中具有Ser 61 Arg(S61R)突变且在Cβ1或Cβ2链中具有Arg 79 Gly(R79G)突变的CAR(在本文其他地方有更全面的描述)导致与内源TCR链的错配减少和功能性增强，这是由于配对的“旋钮和孔”设计。本公开提供了具有根据下表3的一个或多个或所有突变的Cα多肽，其可以用于构建SIR和Ab-TCR。

人基因组编码两条高度同源的TCRβ恒定链；TCRβ1(TCRβ1或TCRb1或cβ1)和TCRβ2(TCRβ2或TCRb2或cβ2)。本公开的CAR可以包含这两条链中的任一个。类似地，其他哺乳动物物种的TCRβ1或TCRβ2链均可用于本公开的方法。

术语“T细胞受体-β1的恒定链”或“T细胞受体-β1的恒定区”(TCR-β1或TCRβ1或TCRb1或hTCR-β1或Cβ1)被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的提供为SEQ ID NO：15051的蛋白质或等效残基(即，同源物)。

术语“T细胞受体β2的恒定链”或“T细胞受体β2的恒定区”(TCR-β2或TCRβ2或TCRb2或Cβ2)被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的提供为SEQ ID NO：15052的蛋白质或等效残基(即，同源物)。

术语“T细胞受体β的恒定链”或“T细胞受体β的恒定区”(TCR-β或TCRβ或TCRb或Cβ)被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的提供为SEQ ID NO：15051-15053的蛋白质或等效残基(即，同源物)。

Cβ2(SEQ ID NO：15052)和Cβ1(SEQ ID NO：15051)的蛋白质序列都是已知的(表6D)。使用本领域的典型和普通技术通过比对序列容易地鉴定Cβ2和β1的序列之间的差异。本公开还提供了可用于SIR和Ab-TCR的构建的TCRβ的某些突变。例如，本文提供了Cβ中的突变位点，其证明了表达增加和与内源TCRα链的错配减少。Cβ1和Cβ2中的这些突变位点位于SEQ ID NO：15051和15052的18、22、57、79133、136和139位，并在下表4和5中进行了总结。Cβ1和Cβ2中的突变位点位置相同。两个序列之间的唯一区别是位置136处的突变。在这一位置，Cβ2中存在谷氨酸(E)，而Cβ1中存在缬氨酸。

术语“TCR-γ的恒定链”或“TCR-γ的恒定区”(TCR-γ或TCRγ或TCRg或TCR-γ1或TCRγ1或TCRg1或Cγ)被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的提供为SEQ ID NO：15068的蛋白质或等效残基(即，同源物)。

术语“TCR-δ恒定链”或“TCR-δ恒定区”(TCR-δ或TCRδ或TCRd或Cδ)被定义为来自非人类物种，例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等的提供为SEQ ID NO：15069的蛋白质或等效残基(即，同源物)。

将认识到，蛋白质可以彼此具有同一性或同源性并且保留类似或相同的功能。本公开包括与本文描述的任何序列具有85％、90％、95％、97％、98％、98.5％、99％或99.9％同一性的TCR恒定区，同时保留生物活性。

因此，本发明提供了具有选自由以下组成的群组中的序列的T细胞受体恒定链：(a)与SEQ ID NO：15041具有至少98％同一并且可以在位置61、91、92、93、和/或94处具有一个或多个突变的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：15051具有至少98％同一并且可以在位置18、22、57、79、133、136和/或139处具有一个或多个突变的氨基酸序列；(c)与SEQ ID NO：15052具有至少98％同一并且可以在位置18、22、57、79、133、136和/或139处具有一个或多个突变的氨基酸序列；(d)与SEQ ID NO：15068具有至少98％同一性的氨基酸序列；以及(e)与SEQ ID NO：15069具有至少98％同一性的氨基酸序列。(a)-(e)中任一项的T细胞受体恒定链保留与其具有同一性或同源性的野生型T细胞受体恒定链的至少一种生物学活性。

术语“组成型活性”是指具有信号传导活性而不需要刺激的分子，例如，蛋白质。示例性组成型活性蛋白是NEMO-K277A和vFLIP K13，因为它们在合适的细胞中表达时可以激活NF-κB信号传导，而无需其他刺激。

术语“共刺激分子”或“共刺激受体”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激细胞外分子是除抗原受体或其配体以外的有助于有效的免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于I类MHC分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、Dap10、CD27、CD28、CD2、CD5、CD8、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40和4-1BB(CD137)。这种共刺激分子的进一步的实例包括CD8、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD1OO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IP0-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体。共刺激受体可以在T细胞以外的细胞如NK细胞或巨噬细胞上表达。

“共刺激细胞内信号传导结构域”或“共刺激结构域”(CSD)可以是共刺激受体的细胞内部分。共刺激分子可以代表以下蛋白家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导性淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)以及NK细胞激活受体。这种分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD8、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。胞内信号传导结构域可以包含其所来源的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。本公开的CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。

术语“cTCR”是指野生型TCR核酸编码序列和与抗原结合结构域连接的相应的野生型TCR蛋白。在一些实施例和参考对照中使用了cTCR。例如，具有CD19结合结构域和CD19-CAR(包含突变的TCR链和CD19结合结构域)的cTCR将具有与靶抗原不同的表达和/或不同的结合亲和力。

术语“胞质的”或“细胞质的”是指以其成熟形式位于细胞的细胞质中的试剂，例如蛋白质。胞质蛋白可以转运到细胞核中，但不是跨膜蛋白，并且不分泌到细胞外。示例性胞质蛋白是vFLIP K13。

术语“退行性疾病”是指基于变性细胞变化的连续过程所导致的疾病，其影响组织或器官，其将随着时间的推移而逐渐恶化，无论是由于正常的身体穿戴或生活方式选择，例如，锻炼或饮食习惯。示例性的退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、腓骨肌萎缩症、克雅氏病、弗里德希氏共济失调、糖尿病(II型)和动脉粥样硬化。

如本文所用的术语“源自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或不包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在源自抗体分子的抗原结合结构域的情况下，抗原结合结构域保留足够的抗体结构，使得其具有所需的功能，即，结合抗原的能力。它不暗示或包括对产生抗体的特定方法的限制，例如，它不意味着为了提供抗原结合结构域，必须从抗体序列开始并删除不需要的序列，或施加突变，以达到抗原结合结构域。

如本文所用的术语“二聚分子”是指促进第一转换结构域与第二转换结构域缔合的分子。在实施例中，二聚分子不是天然存在于受试者中，或者不会以会导致明显二聚化的浓度存在。在实施例中，二聚分子是小分子，例如雷帕霉素(rapamycin)或rapalogue，例如，RAD001、利米度塞或AP20187。利米度塞(AP1903)是具有均二聚活性的脂质可渗透性他克莫司(tacrolimus)类似物。利米度塞均二聚化含有单个酸取代(Phe36Val)的人蛋白质FKBP12(Fv)的类似物。利米度塞用于使非天然存在的免疫受体的含Fv的药物结合结构域均二聚化，从而在细胞疗法期间导致下游信号传导激活。利米度塞可以是约0.01至1mg/kg，并且在细胞培养物中具有约0.1nM的EC50。AP20187可以以约2至10mg/kg/天的单剂量或多剂量施用。

短语“与靶抗原的表达相关的疾病”或“与本文所述抗原相关的疾病”包括但不限于与本文所述靶抗原的表达相关的疾病或与表达本文所述靶抗原的细胞相关的病况，包括，例如，增殖性疾病，如癌症或恶性肿瘤，或癌前状态，如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达本文所述靶抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一方面，与本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌症是血液学癌症。在一方面，与本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌症是实体癌。与本文所述的肿瘤抗原表达相关的进一步的疾病包括但不限于与本文所述的肿瘤抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前状态或增殖性疾病。与本文所述靶抗原表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如，自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性病症(过敏和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达靶抗原的细胞表达或在任何时间表达编码靶抗原的mRNA。在另一个实施例中，表达靶抗原的细胞产生靶抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且靶抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在另一实施例中，表达靶抗原的细胞在某一点产生可检测水平的靶抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的靶抗原蛋白。

如本文所用，“被基因修饰的细胞靶向的疾病”涵盖本发明的基因修饰的细胞靶向以任何方式参与任何疾病的任何细胞，而不论基因修饰的细胞靶向于患病细胞还是健康细胞，以实现治疗有益结果。遗传修饰的细胞包括但不限于遗传修饰的T细胞、NK细胞、造血干细胞、多能胚胎干细胞或胚胎干细胞。遗传修饰的细胞表达常规CAR和含有常规CAR与本发明的辅助模块的新主链，所述CAR可以靶向在靶细胞表面上表达的任何抗原。可以被靶向的抗原的实例包括但不限于在B细胞上表达的抗原；在癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤上表达的抗原；在各种免疫细胞上表达的抗原；以及在与各种血液疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关细胞上表达的抗原。其他可被靶向的抗原对于本领域技术人员是显而易见的，并且可被本发明的CAR结合其替代实施例靶向。

术语“解离常数(Kd)”定义为受体-配体相互作用的解离平衡常数。

如本文所用，“不同组的非天然存在的免疫受体”或“不同组的SIR”或“不同组的CAR”是指具有与不同组的T细胞受体恒定链或“主链”连接的相同结合结构域的多个非天然存在的免疫受体，其中每个包含结合结构域和不同T细胞恒定链或主链的构建体提供与靶抗原结合的不同范围和/或不同的表达水平。例如，结合结构域与其靶标的结合亲和力随恒定结构域的突变组成(例如，突变体TCRa+TCRb)变化。在一些实施例中，本公开的SIR(单链或异二聚体)的结合亲和力大于具有相同结合结构域的野生型TCR(例如，cTCR)。在一个实施例中，SIR的表达水平比cTCR高至少1.25倍至约10,000倍(以及其之间的任何数字)，其中SIR和cTCR仅在TCR结构域的突变上有所不同。在另一个实施例中，SIR对靶标的结合亲和力比具有针对相同抗原的结合结构域的cTCR高至少1.5倍至约10,000倍。在又一个实施例中，SIR具有比针对相同抗原的cTCR更高的结合亲和力，但是低于具有相同结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，表达SIR的效应细胞与靶抗原的结合比相应的表达cTCR的效应细胞的结合高至少1.25倍，但比相应的cTCR的高低于100,000倍。在一些实施例中，抗原结合结构域具有约10^-4M至10^-8M的解离常数(K_D，反映其结合亲和力)。在一些实施例中，抗原结合结构域与上述抗原中的一种或多种结合。在一些实施例中，对于靶抗原，抗原结合域的K_D为约10^-4M至10^-8M，例如约10^-5M至10^-7M，例如约10^-5M至10^-6M。在一个实施例中，抗原结合结构域的结合亲和力比参照抗体小至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一个实施例中，所编码的抗原结合结构域具有比参考抗体小至少5倍的结合亲和力。在一些实施例中，参考抗体是抗原结合结构域所源自的抗体。例如，本公开涵盖针对特定抗原靶标的SIR的多样性群体，其可以基于核酸序列密码子优化和/或TCR链中促进配对或表达的突变和/或在结合结构域和TCR结构域之间使用接头来加以设计和筛选。

如本文所用，“表位”被定义为能够引发免疫应答的抗原的部分，或者是与抗体或抗体片段结合的抗原的部分。表位可以是蛋白质序列或子序列。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其他元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

当提及CAR使用时，术语“功能部分”是指CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留了其一部分(亲本CAR)的CAR的生物学活性。功能部分涵盖，例如，CAR的保留与亲本CAR以类似程度、相同程度或更高程度地识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的那些部分。提及亲本CAR时，功能部分可以包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。

如本文所用，“遗传修饰的细胞”、“重定向的细胞”、“遗传工程的细胞”或“修饰的细胞”是指表达本公开的CAR的细胞。在一些实施例中，遗传修饰的细胞包含编码CAR的载体。在一些实施例中，遗传修饰的细胞包含编码同一载体中的CAR和一个或多个辅助分子的载体。在一些实施例中，遗传修饰的细胞包含编码CAR的第一载体和编码辅助分子的第二载体。在一些实施例中，遗传修饰的细胞包含编码CAR的第一载体和编码多于一个辅助分子的第二载体。在一些实施例中，遗传修饰的细胞包含编码CAR的第一载体和编码第一辅助分子的第二载体和编码第二辅助分子的第三载体。

如本文所用，“铰链区”(HR)是指在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水性区域。铰链区包括但不限于抗体或其片段或衍生物的Fc片段、抗体或其片段或衍生物的铰链区、抗体的CH2区域、抗体的CH3区域、人工间隔序列或其组合。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链，和由多肽制成的人工间隔区，其可以小至例如IgG(例如，人IgG4)的Gly3或CH1和CH3结构域。在一些实施例中，铰链区是以下中的任何一个或多个：(i)IgG4的铰链、CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链和CH2，(iv)CD8a的铰链区，(v)IgG1的铰链、CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区或(vi)IgG1的铰链和CH2区。其他铰链区域对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本公开的替代实施例结合使用。

术语“免疫病症”是指以免疫系统功能障碍为特征的疾病。自身免疫疾病是由对正常身体部位的异常免疫应答引起的病况。至少有80种类型的自身免疫性疾病。

如本文所用，“免疫细胞”是指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助性T细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。

如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。

“免疫效应功能”或“免疫效应应答”、“效应功能”是指分化细胞的特异功能。T细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的辅助活性。例如，免疫效应功能或应答是指T或NK细胞促进靶细胞杀伤或抑制靶细胞生长或增殖的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的实例。在抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)的情况下，抗原呈递和细胞因子分泌是效应功能的实例。

如本文所用，“免疫应答”是指免疫，包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎性反应、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃免疫。

如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”(ISD)或“胞质结构域”是指分子的细胞内信号传导部分。细胞内信号传导结构域产生促进细胞免疫效应功能的信号。免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。转导效应功能信号的结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的z链或其任何同源物(例如，h链、FceR1g和b链、MB1(Iga)链、B29(Igb)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(D、d和e)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。其他细胞内信号传导结构域对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本公开的替代实施例结合使用。

在另一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包括初级细胞内信号传导结构域。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在另一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，一级细胞内信号传导结构域可以包含CD3z的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子如CD28或41BB的胞质序列。

初级细胞内信号传导结构域可以包含称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、普通FeRγ(FCER1G)、FeγRIIa、FeRβ(FeεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAPlO和DAP12的序列的那些。

如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物或细胞材料。一方面，术语“分离的”是指分别与存在于天然来源中的其他DNA或DNA、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离的核酸(如DNA或RNA)、或蛋白质或多肽(例如，抗体或其衍生物)、或细胞或细胞器、或组织或器官。术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或在化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质的核酸。此外，“分离的核酸”意指包括不作为片段天然存在并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且意在涵盖纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还用于指与其他细胞或组织分离的细胞或组织，并且意在涵盖培养的和工程化的细胞或组织两者。

如本文所用，术语“接头”(也称为“接头结构域”或“接头区”)是指分别将本文公开的CAR多核苷酸或多肽的两个或更多个结构域或区域连接在一起的寡核苷酸或多肽(或编码多肽的寡核苷酸)。接头可以在长度为1至500个氨基酸或长度为3至1500个核苷酸中的任何位置。在一些实施例中，“接头”是可切割的或不可切割的。除非另有说明，否则本文所用的术语“接头”是指不可切割接头。所述不可切割接头可以由柔性残基构成，所述柔性残基允许相邻的蛋白质结构域相对于彼此***。这种残基的非限制性实例包括甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头包括非柔性残基。可切割接头的实例包括2A接头(例如，T2A)、2A样接头或其功能等效物以及其组合。在一些实施例中，接头包括小核糖核酸病毒2A样接头、猪捷申病毒(P2A)的CHYSEL序列、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus，T2A)或其组合、变体和功能等效物。在一些实施例中，接头序列可包含导致2A甘氨酸和2B脯氨酸之间切割的基序(参见例如，T2A序列，SEQ ID NO：4839和4840，C端Gly-Pro)。以SEQ ID NO：925至SEQ ID NO：930提供了若干示例性可切割接头的核酸序列，以SEQ ID NO：4838至SEQID NO：4843提供了若干示例性接头的氨基酸序列。本领域技术人员容易理解可用于本文的其他可切割接头。

在一个实施例中，还在可切割接头序列的上游添加Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG)基序(SEQ ID NO：931-32)以增强切割效率。可切割接头的潜在缺点是在N端蛋白质末端的小2A标签可能影响蛋白质功能或有助于蛋白质的抗原性的可能性。为了克服这一限制，在一些实施例中，在SGSG基序的上游添加了Furine切割位点(RAKR)(SEQ ID NO：933-935)，以促进翻译后残留的2A肽的切割。

如本文所用的术语“柔性多肽接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成的肽接头，以将多肽链连接在一起(例如，将可变重链和可变轻链区连接在一起)。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n(SEQ ID NO：4191-4192)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO：4193或4194)。在WO2012/138475中描述的接头也包括在本公开的范围内，其通过引用并入本文。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非***细胞；它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。

术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等人，《分子疗法(Mol.Ther.)》17(8)：1453-1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的

基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX^TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。慢病毒载体的其他实例是pLENTI-EF1α(SEQ ID NO：3837)、pLENTI-EF1α-DWPRE(SEQ ID NO：3838)、pCCLc-MNDU3-WPRE(SEQ ID NO：7779)和pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE(SEQ ID NO：7780)。pLenti-EF1a-DWPRE通过缺失WPRE序列从pLENTI-EF1α载体衍生。从EF1α启动子删除内部Sac II片段，以产生EF1α(EF1a)-D-SACII-启动子(SEQ ID NO：3842)。在一个示例性实施例中，可以使用本领域已知的方法将编码CAR、CAR加辅助模块或辅助模块的核酸片段克隆在存在于pLENTI-EF1α和pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE载体中的Nhe I和Sal I位点之间。

如本文所用，“哺乳动物”是指哺乳动物类的任何成员，包括但不限于人类和非人类的灵长类动物，如黑猩猩和其他猿和猴物种；耕畜，如牛、山羊、猪、山羊和马；家畜，如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，无论是男性还是女性，成年和新生的受试者以及胎儿都旨在包括在所述术语的范围内。

如本文所用，“裸DNA”是指以适当方向克隆在合适的表达载体中以表达的编码CAR的DNA。可以使用的病毒载体包括但不限于SIN慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、杂交载体和/或质粒转座子(例如，睡美人转座子系统)或基于整合酶的载体系统。可以结合本发明的替代实施例使用的其他载体对于本领域技术人员将是显而易见的。

如本文所用，“天然的”或“天然存在的”或“内源的”是指细胞天然的或在细胞中天然表达的基因、蛋白质、核酸(例如，DNA、RNA等)或其片段。因此，T细胞的天然或内源TCRα链多肽由连接至TCRα恒定链的可变结构域(Vα)组成。天然或内源TCRα链前体多肽还由从成熟多肽上切割下来的氨基端信号肽组成。

NF-κB必需调节剂(NEMO)是指NF-κB激活所需的IκB激酶复合物的支架蛋白组分。NF-κB是控制炎症、细胞增殖和凋亡的转录因子。

“NF-κB途径”或“NF-κB信号传导途径”是指导致NF-κB亚基的核易位和NF-κB亚基应答基因转录激活的信号转导途径。NF-κB是指转录因子家族，与炎性和免疫应答中涉及的若干基因的调控表达有关。迄今为止，这一家族的五个已知成员已被表征，并且包括c-Rel、NF-κB1(p50和其前体p105)、NF-κB2(p52和其前体p105)、p65(RelA)和RelB。尽管已描述了NF-κB的许多二聚体形式，但经典的NF-κB复合物是p65/RelA和p50亚基的异二聚体，并且已发现在大多数细胞中与称为IκBs的抑制蛋白家族相关，其中最常见的是IκBα。在经典的NF-κB途径中，多种细胞因子(如TNFα和IL-1)的刺激导致激活多亚基IκB激酶(IKK)复合物，其含有两个催化亚基IKK1/IKKα和IKK2/IKKβ和调节亚基NEMO/IKKγ。激活的IKK复合物导致IκB蛋白的诱导磷酸化和其后续降解，从而从其抑制影响中释放NF-κB。一旦释放，NF-κB便会自由迁移至细胞核并与具有其同源结合位点的特定基因的启动子结合。核中NF-κB二聚体的转录活性通过它们的磷酸化进一步修饰。已经描述了一种NF-κB激活的替代(或非经典)途径，所述途径涉及蛋白酶体介导的将p100/NF-κB2加工成p52亚基。

“NF-κB刺激分子”或“NF-κB刺激剂”或“NF-κB激活剂”是指辅助分子的一个子集，其促进NF-κB信号传导途径的活性或NF-κB信号传导途径下游靶基因的活性/表达。在一些实施例中，NF-κB激活剂是非天然存在的NF-κB激活试剂。示例性的非天然存在的NF-κB激活试剂是hNEMO-K277A。在一个实施例中，NF-κB刺激分子或NF-κB刺激剂是选择性NF-κB刺激剂或选择性NF-κB激活剂。如本文所述，“选择性NF-κB激活剂”或“选择性NF-κB刺激剂”是指选择性激活NF-κB信号传导途径而不激活或最低限度激活其他信号传导途径的试剂。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度地激活一种或多种信号传导途径，所述一种或多种信号传导途径选自由以下组成的群组：AKT、PI3K、JNK、p38激酶、ERK、JAK/STAT和干扰素信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活AKT信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活AKT信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活PI3K信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活ERK信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活JNK信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活p38激酶信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活JAK/STAT信号传导途径。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度激活干扰素信号传导途径。本领域已知许多测量NF-κB信号传导途径激活的方法，包括但不限于测量磷酸化的IκBα、磷酸化的p65/RelA、总IκBα、p65核转位、NF-κB应答基因的上调、电泳迁移率变动测定(EMSA)和基于NF-κB的报告基因测定等。这些测定可单独或联合用于本公开的方法中，以鉴定NF-κB途径的选择性激活剂。本领域已知许多测量信号传导途径(例如，AKT、PI3K、JNK、p38激酶、ERK、JAK/STAT和干扰素信号传导途径)激活的方法，包括但不限于测量不同激酶和属于不同途径的下游底物的磷酸化、下游转录因子的核转位、下游应答基因的上调、电泳迁移率变动测定(EMSA)和基于荧光素酶的报告基因测定等。这些测定单独或联合用于本公开的方法中，以选择NF-κB信号传导途径的选择性激活剂。与其他辅助分子如41BB相比，选择性NF-κB刺激剂特异性激活NF-κB。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子具有以下作用中的一种或多种：(i)延长T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的寿命，(ii)刺激T细胞增殖，(iii)保护T细胞例如CAR-T细胞免于凋亡，(iv)延迟T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的衰老，(v)延迟T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的耗竭，(vi)延迟T细胞的终末分化，(vii)促进T细胞产生细胞因子如IL2，(viii)促进包括CAR-T细胞和TCR-T细胞在内的T细胞的体内扩增，(ix)促进包括CAR-T细胞和TCR-T细胞在内的T细胞的体内持久性，(x)改善包括CAR-T和TCR-T细胞在内的T细胞的体内活性(例如，抗肿瘤活性)。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可在T细胞以外的细胞，如抗原呈递细胞，例如树突状细胞中表达。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可用于增强抗原呈递细胞产生的抗原呈递、细胞因子产生和免疫应答。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可能是病毒或非病毒(例如，人)来源的。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可以在细胞中瞬时或稳定表达。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可以在细胞中以组成型或诱导型方式表达。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可以在与转换结构域，例如FKBP12v36结构域的串联拷贝融合的细胞中表达。含有NF-κB刺激分子的示例性转换结构域以SEQ ID NO：973-977、1006-1009、7763-7767和7781-7782(表7)提供。包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB刺激分子可以从含有CAR/TCR编码序列的载体表达，或者可以存在于不同的载体上。例如，在一些实施例中，包含编码CAR/TCR的多核苷酸的载体进一步包含编码病毒和细胞信号传导蛋白的多核苷酸，所述病毒和细胞信号蛋白是NF-κB刺激分子或选择性NF-κB激活剂，其(i)延长T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的寿命，(ii)刺激T细胞增殖，(iii)保护T细胞例如CAR-T细胞免于凋亡，(iv)延迟T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的衰老，(v)延迟T细胞例如CAR-T细胞或TCR-T细胞的耗竭，(vi)延迟T细胞的终末分化，(vii)促进T细胞产生细胞因子如IL2，(viii)促进包括CAR-T细胞和TCR-T细胞在内的T细胞的体内扩增，(ix)促进包括CAR-T细胞和TCR-T细胞在内的T细胞的体内持久性，和/或(x)改善包括CAR-T和TCR-T细胞在内的T细胞的体内活性(例如，抗肿瘤活性)。在一些实施例中，NF-κB刺激分子的编码序列通过编码可切割接头的寡核苷酸与CAR主链编码序列连接。在示例性实施例中，这种NF-κB刺激性分子包括但不限于来自卡波济肉瘤相关疱疹病毒的vFLIP-K13、密码子优化的K13(K13-opt)、NEMO突变体((例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277L、hNEMO-K277A-δV249-K255、mNEMO-K270A等)、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A、MTCP-1、IKKα和IKKβ(表7)。在一个实施例中，编码CAR的载体进一步编码vFLIP-K13。在另一个实施例中，编码CAR的载体进一步编码hNEMO-K277A。在一些实施例中，NF-κB刺激分子由与编码本文所述的CAR的载体不同的载体编码。在一些实施例中，包含编码CAR的载体的效应细胞还包含编码NF-κB刺激分子的载体。在一些实施例中，通过修饰编码相应内源蛋白的基因组基因座来编码NF-κB刺激分子。例如，可以通过同源重组修饰hNEMO基因的一个或多个拷贝，以将其突变为K277A突变体形式。可用于在内源人NEMO基因中产生K277A突变的示例性靶向构建体以SEQ ID NO：7771表示。可用于在内源人NEMO基因中产生K277A-δ-V249-K255突变的示例性靶向构建体以SEQ ID NO：7772表示。这些靶向构建体可以使用本领域已知的技术，用靶向NEMO的基因编辑系统，例如CRISP/Cas9或TALON，导入人T细胞中。酿脓链球菌Cas9的示例性NEMO gRNA靶序列以SEQ IDNO：7759-7762提供。在一个实施例中，CAR和NF-κB刺激分子由单个多核苷酸编码。在另一个实施例中，CAR由第一核酸分子编码，并且NF-κB刺激分子由第二核酸分子编码。在一些实施例中，取决于NF-κB刺激分子的数量，NF-κB刺激分子由多于一个核酸分子编码。在本公开的某些部分中，缩写“CAR/NFκB”用于表示，例如表达本公开的CAR和NF-κB刺激分子(例如，NF-κB特异性刺激分子)两者的细胞。例如，术语“表达CAR/NFκB的T细胞”是指具有许多可能的不同抗原结合结构域的CAR-T细胞，所述细胞还表达，例如选自由以下组成的群组的NF-κB特异性刺激分子：来自卡波济肉瘤相关疱疹病毒的vFLIP-K13、密码子优化的K13(K13-opt)、hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E，MyD88-L265P、TCL-1A、MTCP-1、IKK1/IKKα和IKK2/IKKβ或其任何组合。NF-κB刺激分子可以直接与CAR的胞质结构域连接，或者可以在细胞中独立表达。NF-κB刺激分子可以是阻断NF-κB信号传导途径抑制剂的表达和/或活性的分子。例如，阻断NF-κB信号传导途径抑制剂的表达和/或活性的NF-κB刺激分子是A20的遗传(例如，siRNA、shRNA、gRNA、TALON或Zn指核酸酶)、化学或生物学抑制剂。其他实施例包括作为NF-κB刺激分子的NEMO融合构建体(例如，hNEMO-FKBPx2、FKBPx2-hNEMO-L600等)。

如本文所用，“非天然存在的试剂”或“非天然的”或“外源的”是指非天然在细胞中表达的试剂。换句话说，非天然存在的试剂被“工程化”以在细胞中表达。非天然存在的试剂可以是天然存在的试剂的克隆形式。示例性非天然存在的试剂包括CAR、SIR、Ab-TCR、TFP、重组TCR、NEMO-K277A、vFLIP-K13和K13-opt。可以使用本领域已知的基因转移技术，如慢病毒或逆转录病毒介导的基因转移，将非天然存在的试剂表达到细胞中。可以使用外源启动子(例如，EF1α启动子)或内源启动子(例如，TCRα启动子)在免疫细胞中表达非天然存在的试剂。当内源基因(例如，IKK1、IKK2、IKKγ/NEMO)被克隆并在细胞中异位表达时，它代表了非天然存在的试剂的另一个实例。

如本文所用，“非天然存在的免疫受体”或“外源免疫受体”是指非天然在免疫细胞中表达的免疫受体。换句话说，非天然存在的免疫受体被“工程化”以在免疫细胞中表达。非天然存在的免疫受体可以是天然存在的免疫受体的克隆版本。可替代地，非天然存在的免疫受体可以是使用重组分子生物学技术产生的嵌合受体。示例性的非天然存在的免疫受体包括CAR、SIR、Ab-TCR、TFP和重组TCR。可以使用本领域已知的基因转移技术，如慢病毒或逆转录病毒介导的基因转移，将非天然存在的免疫受体引入免疫细胞。可以使用外源启动子(例如，EF1α启动子)或内源启动子(例如，TCRα启动子)在免疫细胞中表达非天然存在的免疫受体。

如本文所用，“非天然存在的TCR抗原结合结构域”或“外源TCR抗原结合结构域”是指可操作地连接至相对于天然存在的TCR是嵌合且非天然存在的TCR恒定区的结合结构域。换句话说，使用重组分子生物学技术对非天然存在的TCR抗原结合结构域进行“工程化”以使其可操作地连接至TCR，此外，抗原结合结构域是从不同于天然发现的TCR的分子获得或衍生的。与TCR在性质上不同的抗原结合结构域包括抗体vH和vL片段、人源化抗体片段、嵌合抗体片段、受体配体等。

如本文所用，“非病毒来源”是指不是全部或部分由病毒编码或具有大于10个氨基酸(例如，大于15个氨基酸、20个氨基酸，25个氨基酸或50个氨基酸)且与病毒编码的蛋白质具有大于80％(例如，大于85％、90％、95％或99％)的序列同源性的任何结构域或区域的试剂(例如，蛋白质)。在一个实施例中，非病毒来源的试剂是人来源的。在一个实施例中，非病毒来源的试剂是选择性NF-κB激活剂。作为选择性NF-κB激活剂的非病毒来源的示例性试剂是人NEMO-K277A(SEQ ID NO：4892)。

术语“可操作地连接”或“功能上连接”是指第一组分和第二组分之间的功能连接或关联，使得每个组分都可以起作用。例如，可操作地连接包括调节序列和异源核酸序列之间的关联，从而导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。在两个多肽可操作地连接的情况下，第一多肽以独立于任何连接的方式起作用，并且第二多肽以缺少两者之间的连接的方式起作用。

在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，“同一性百分比”是指相同的两个或更多个序列。当在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时，使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查进行测量，如果两个序列具有指定百分比的相同(例如，在指定区域上，或当未指定时，在整个序列上60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)氨基酸残基或核苷酸，则两个序列是“基本上同一的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其相比。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定替代的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，(1970)《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2：482c的局部同源性算法进行，通过Needleman和Wunsch，(1970)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443的同源性比对算法进行，通过Pearson和Lipman，(1988)《美国科学学院学报》85：2444的类似性方法检索进行，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过手工比对和目视检查(参见例如，Brent等人，(2003)《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》)。

可以用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法分别描述于Altschul等人，(1977)《核酸综述》25：3389-3402；和Altschul等人，(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215：403-410。可通过国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件。

两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller，(1988)《生物科学中的计算机应用(Comput.Appl.Biosci.)》4：11-17的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分为12和空位罚分为4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：444-453算法(可在www.gcg.com获得)，使用Blossom 62矩阵或P AM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。

术语“多核苷酸”、“核酸”或“重组核酸”是指核苷酸的聚合物，如脱氧核糖核酸(DNA)，以及适当时的核糖核酸(RNA)。

术语“蛋白质”或“多肽”在本文中可互换使用，包含一个或多个称为氨基酸的化学结构单元链，所述氨基酸通过称为肽键的化学键连接在一起。

术语“逆转录病毒载体”是指源自逆转录病毒基因组的至少一部分的载体。逆转录病毒载体的实例包括可从Addgene或Clontech获得的MSCVneo、MSCV-pac(或MSCV-puro)、MSCV-hygro。

术语“睡美人转座子”或“睡美人转座子载体”是指源自睡美人转座子基因组的至少一部分的载体。

术语“单链可变区”或“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头例如短柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了scFv所源自的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用的scFv可以具有任何顺序的vL和vH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含vL-接头-vH或可以包含vH-接头-vL。在本发明中，scFv也被描述为vL-Gly-Ser-接头-vH。可替代地，scFv也被描述为(vL+vH)或(vH+vL)。

术语“信号结构域”是指蛋白质的功能区域，其在细胞内传递信息以通过产生第二信使经由限定的信号传导途径或通过响应于这种信使而起效应子的作用来调节细胞活性。

术语“合成免疫受体”或可替代地“SIR”是指一组多肽，在一些实施例中典型地为两个，当在效应细胞子中表达时，其为细胞提供对靶细胞(典型地为癌症)的特异性和细胞内信号产生。SIR代表通过引用并入本文的WO 2018/102795 A1中描述的下一代CAR平台。在一个典型的实施例中，SIR包含一个或多个与本文所述的抗原结合并通过任选接头结合至一个或多个T细胞受体恒定链或区域的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、配体或受体)。在一些实施例中，此组多肽彼此邻接。在一些实施例中，SIR包含两组或更多组的两个或多个多肽。每组SIR的多肽彼此相邻(功能多肽单元1)，但与另一组多肽不相邻(功能多肽单元2)。在一些方面，SIR的T细胞受体恒定链(或区域)选自人T细胞受体α(TCR-α或TCRα或TCRa或hTCR-α或hTCRα或hTCRa或Cα)的恒定链、人T细胞受体-β1(TCR-β1或TCRβ1或TCRb1或hTCR-β1或hTCRβ1或hTCRb1或Cβ1)、人T细胞受体-β2(TCR-β2或TCRβ2或TCRb2或hTCR-β2或hTCRβ2或hTCRb2或Cβ2也称为TCR-β、TCRβ或TCRb或Cβ)、人前T细胞受体α(前TCR-α或前TCRα或前TCRa或前Cα)、人T细胞受体-γ(TCR-γ或TCRγ或TCRg或hTCR-γ或hTCRγ或hTCRg或hTCRγ1或hTCRγ1或Cγ)或人T细胞受体-δ(TCR-δ或TCRd或TCRδ或hTCR-δ或hTCRd或hTCRδ或Cδ)。在一些实施例中，SIR的TCR恒定链由它们的野生型核苷酸序列编码，而在其他方面，SIR的TCR恒定链由非野生型的核苷酸序列编码。在一些实施例中，SIR的TCR恒定链由它们的密码子优化序列编码。在一些实施例中，SIR的TCR恒定链编码野生型多肽序列，而在其他实施例中，SIR的TCR恒定链编码携带一种或多种突变的多肽。在一些实施例中，SIR的TCR恒定链由它们的携带一个或多个突变的密码子优化序列编码。包含靶向特定肿瘤标志物“X”的抗原结合结构域(例如，scFv或vHH)的SIR，例如本文所述的那些，也称为X-SIR或XSIR。例如，将包含靶向CD19的抗原结合结构域的SIR称为CD19-SIR或CD19SIR。SIR的TCR恒定链/结构域可以衍生自其中最终将使用SIR的相同物种。例如，对于人类使用，SIR的TCR恒定链衍生自人TCR恒定链或由人TCR恒定链构成可能是有益的。但是，在某些情况下，TCR恒定链衍生自最终将使用SIR的相同物种，但经过修饰以携带增强TCR恒定链表达的氨基酸替代是有益的。例如，对于人类使用，SIR的TCR恒定链衍生自人TCR恒定链或由人TCR恒定链构成，但是其中某些氨基酸被来自鼠TCR恒定链的相应氨基酸替代可能是有益的。这种鼠源化TCR恒定链提供了SIR的增加表达。SIR或其功能部分可以在氨基或羧基端或在两个末端都包括另外的氨基酸，在组成SIR的TCR或抗原结合结构域的氨基酸序列中没有发现所述另外的氨基酸。期望地，另外的氨基酸不干扰SIR或功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本SIR的生物活性相比，另外的氨基酸增强了生物学活性。示例性SIR的核酸和氨基酸序列以SEQ ID NO：3878-3879并在表10-11中提供。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体(或靶抗原)结合而诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于，经由TCR/CD3的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变。

术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以刺激方式调节免疫细胞激活的胞质信号传导序列，以进行免疫细胞信号传导途径的至少某些方面。一方面，所述信号是初级信号，其例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、普通FeRγ(FCERIG)、FeγRIIa、FeRβ(FeεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAPlO和DAP12的那些。

术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，任何驯化的哺乳动物或人)。

如本文所用，“转换结构域”或“二聚结构域”典型地是指在二聚分子存在下与另一转换结构域缔合的基于多肽的实体。缔合导致连接至例如融合至第一转换结构域的第一实体和连接至例如融合至第二转换结构域的第二实体的功能偶联。第一和第二转换结构域统称为二聚转换。在实施例中，第一和第二转换结构域彼此相同，例如，它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并且统称为均二聚转换。在实施例中，转换是细胞内的。在实施例中，转换结构域是基于多肽的实体，例如FKBP(FK506结合蛋白)，并且二聚分子是小分子，例如AP20187。

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且在本文同义地使用。实例包括但不限于原初T细胞(“淋巴细胞祖细胞”)、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、T记忆干细胞(T_scm)、iPSC衍生的T细胞、合成T细胞或其组合。

术语“TCR相关的信号传导模块”是指具有胞质免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的分子，其是TCR-CD3复合物的一部分。与TCR相关的信号传导模块包括CDγε、CDδε和CD3ζζ。

如本文所用，“治疗剂”是指用于例如治疗、抑制、预防、减轻疾病作用、降低疾病严重性、降低疾病发展的可能性、减缓疾病进展和/或治愈疾病的试剂。治疗剂靶向的疾病包括但不限于传染病、癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤、在各种免疫细胞上表达的抗原和在与各种血液学疾病相关细胞上表达的抗原、和/或炎性疾病。

如本文所用，“治疗对照”是指用于控制表达CAR的细胞的活性的元件。在一些实施例中，用于控制本发明的表达CAR的细胞的活性的治疗对照包括以下中的任何一种或多种：截短的表皮生长因子受体(tEGFR)、截短的表皮生长因子受体viii(tEGFRviii)、截短的CD30(tCD30)、截短的BCMA(tBCMA)、截短的CD19(tCD19)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、人胱天蛋白酶8、人胱天蛋白酶9、诱导型胱天蛋白酶9、嘌呤核苷磷酸化酶、亚麻苦苷酶/亚麻苦苷/葡糖氧化酶、脱氧核糖核酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚-3-乙酸(IAA)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、CD20/αCD20、CD34/胸苷激酶嵌合体、依赖dox的胱天蛋白酶-2、突变型胸苷激酶(HSV-TKSR39)、AP1903/Fas系统、嵌合细胞因子受体(CCR)、选择标志物以及其组合。

术语“治疗效果”是指可以通过各种方式表现出来的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减小，癌细胞数量的减少，转移数量的减少，预期寿命的增加，癌细胞增殖的减少，癌细胞存活的减少，传染剂效价的降低，传染剂菌落数量的减少，与疾病状况相关的各种生理症状的改善。“治疗效果”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防疾病发生或预防疾病复发的能力来体现。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指包含一种或多种如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物减少疾病或病症的至少一种或多种症状的量，并且涉及足以提供期望效果的药理组合物的量。如本文所用，短语“治疗有效量”是指足以以适用于任何药物处理的合理的受益/风险比治疗病症的组合物的量。

症状在治疗上或预防上的显著减轻是，例如与对照或未治疗的受试者或施用本文所述的寡肽之前的受试者的状态相比，测量参数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。所测量或可测量的参数包括疾病的临床可检测标志物，例如生物标志物的升高或降低水平，以及与糖尿病的症状或标志物的临床可接受规模有关的参数。然而，应当理解，如本文所公开的组合物和制剂的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切量将取决于多种因素，如所治疗的疾病类型，受试者的性别、年龄和体重。

术语“TCR受体融合蛋白或TFP”是指如通过引用并入本文的WO 2016/187349 A1中所描述的下一代CAR平台。在一个实施例中，TFP包含与融合至TCR链(如CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα或TCRβ)的靶抗原特异性结合的抗体部分。可以在TFP的构建中使用的示例性TCR链由SEQ ID NO：944-945、948、949-950和958表示，并且在通过引用并入本文的WO 2017/070608A1中提供。合并CD3ε链的TFP被称为CD3εTFP。合并CD3γ链的TFP被称为CD3γTFP。合并CD3δ链的TFP被称为CD3δTFP。合并CD3ε、CD3γ或CD3δ链的TFP统称为CD3ε/γ/δTFP。合并本公开中描述的不同抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、配体、受体等)并共表达编码NEMO-K277A的辅助模块的示例性TFP以SEQ ID NO：1900-3123提供(表13)。可以通过参考表12确定这些TFP的SEQ ID No、抗原结合结构域和靶抗原，因为这些TFP构建体与表12所示的共表达NEMO-K277A的第一代CAR构建体具有相同的抗原结合结构域，并且以相同顺序编号。但是，编码NEMO-K277A的辅助模块是任选的。可以在没有NEMO-K277A的情况下构建具有本公开中描述的抗原结合结构域(即，vL和vH片段、配体和受体等)的TFP。这样，这一辅助模块以及上游Furine-SGSG-F2A序列可以从SEQ ID NO：1900-3123表示的TFP中删除。可替代地，可以将编码NEMO-K277A的辅助模块替换为编码其他信号传导蛋白的辅助模块，例如hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E和MyD88-L265P、FKBPx2-NEMO、NEMO-L600-FKBPx2和CMV-141等。

术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

如本文所用，“跨膜结构域”(TMD)是指CAR的穿过质膜的区域。本发明的CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合的跨膜区。其他跨膜结构域对本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施例结合使用。在一些实施例中，包含本文描述的任何主链的TMD编码的CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域选自T细胞受体、CD3γ、CD3ε、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的α、β或ζ链的跨膜结构域。

如本文所用，“三功能T细胞抗原偶联剂或Tri-TAC”是指通过引用并入本文的WO2015/117229 A1中描述的下一代CAR平台。可以使用本领域中已知的技术，使用本公开中描述的抗原结合结构域(例如，vL和vH片段、scFv、vHH、配体和受体等)来构建靶向不同抗原的Tri-TAC。此外，可以在表达Tri-TAC的免疫细胞，例如T细胞如CAR-T细胞中表达本公开中描述的不同的辅助模块(例如，NEMO-K277A、mNEMO-K270A等)。

如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症有关的病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病况、疾病或病症如癌症的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括停止或至少减慢在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻，疾病程度的减弱，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病进展的延迟或减慢，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。术语“治疗”还包括减轻疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。在一些实施例中，癌症的治疗包括减小肿瘤体积，减少癌细胞数量，抑制癌症转移，增加预期寿命，减少癌细胞增殖，减少癌细胞存活或改善与癌性病况相关的各种生理症状。

如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。

如本文所用，“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可通过其将多核苷酸序列(例如，外源基因)引入宿主细胞，以便转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。

术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为提供为GenBank登录号BAG36664.1的蛋白质，或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基，以及“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞激活所必需的初始信号。在一方面，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或为其非功能直系同源物的来自非人类物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3-ζ刺激性结构域”是提供为SEQ ID NO：4853(表6D)的序列。

选择CAR的结合结构域以结合期望的表位。例如，也可以由包含CAR的scFv识别的表位来确定CAR识别的表位。例如，由于靶向MPL的CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC(SEQ ID NO：1509和SEQ ID NO：5422)的抗原特异性结构域由scFv MPL-161-(vL-vH)(SEQ ID NO：808和SEQ ID NO：4721)构成，所以预期CAR将靶向与scFv和衍生scFv的亲本抗体相同的表位。scFv MPL-161-(vL-vH)(SEQ ID NO：808和SEQ ID NO：4721)识别的表位以SEQ ID NO：15160提供。在本公开的CAR和主链的构建中使用的若干scFv和/或其亲本抗体识别的表位是本领域已知的。可替代地，可以通过产生其靶抗原的一系列突变体并测试所述突变体与表达CAR的细胞结合的能力来确定CAR靶向的表位(包括作为主链parat存在的CAR)。例如，可以通过产生一组MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5融合构建体(DNA SEQ ID NO：1015和PRT SEQ ID NO：4928)的突变体来确定靶向MPL的CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC识别的表位。将突变体构建体转染到合适的细胞系(例如，293FT细胞)中，并收集含有融合蛋白的上清液，并测定其NLuc活性，以确保在上清液中分泌出不同的突变的MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5融合蛋白。随后，将测试融合蛋白结合表达CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR构建体的细胞(例如，Jurkat细胞或T细胞)的能力。不能与表达CAR的细胞结合的突变体是含有MPL特异性CAR靶向的表位的候选者。确定特定CAR识别的表位的替代方法可以包括使用不同测试抗体的功能竞争测定。例如，在没有和存在增加浓度的不同测试MPL抗体的情况下，可以将表达CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PACCAR的T细胞与表达MPL的细胞系(例如，HEL细胞)共培养。如果测试MPL抗体识别的表位与CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR识别的表位重叠，则期望所述测试抗体以剂量依赖方式阻断表达CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR的T细胞诱导的靶细胞杀伤和细胞因子产生。将包括与测试抗体相同同种型的非特异性抗体作为对照，并且预期不会对表达CAR的T细胞诱导的靶细胞杀伤和细胞因子产生影响。类似地，可以在Jurkat-NFAT-EGFP细胞中表达特异性CAR，并且可以使用测试抗体通过与靶细胞系共培养后表达CAR的Jurkat-NFAT-GFP细胞阻断EGFP诱导的能力来确定测试抗体识别的表位是否与所述CAR识别的表位重叠。

本文还提供了包含非天然存在的免疫受体例如CAR和辅助模块(包括NF-κB刺激分子和选择性NF-κB激活剂)的组合物，以及使用所述组合物治疗疾病(包括癌症)的方法。如本文所述，提供了常规CAR(表1)和表2中所描述的辅助模块的特定组合。

表1：常规CAR架构。第一代常规CAR(常规CAR I)具有细胞内信号传导(ISD)结构域(例如，CD3z)，并且没有共刺激结构域。TCR融合蛋白(TFP)是常规CAR 1的另一个实例。第二代常规CAR(常规CAR 2或CAR II)具有一个共刺激结构域(例如，41BB或CD28)和细胞内信号传导(ISD)结构域(例如，CD3z)。第三代常规CAR(常规CAR 3或CAR III)具有两个共刺激结构域(例如，41BB和CD28)和细胞内信号传导(ISD)结构域(例如，CD3z)。Ab-TCR是双链受体，并且已经描述于PCT/US2016/058305中。cTCR是由源自vL和vH片段的抗原结合结构域组成的单链、一个半链或双链受体，所述受体与一个或多个TCR恒定链融合并导致T细胞信号传导激活。合成免疫受体是下一代CAR，并且描述于US 62/429,597和WO 2018/102795 A1：

表2：示例性主链

表6A：vL片段的靶抗原、名称和SEQ ID和CDR1-3的SEQ ID

表6B：vH片段的靶抗原、名称和SEQ ID和CDR1-3的SEQ ID

表6C：scFV片段

表6D：CAR组分

表7：示例性辅助模块

表8：用于产生CAR的MHC I(HLA-A2)限制性肽

表9：

表10：基于HIV1-N49P6 vL和vH结合结构域的靶向HIV-1包膜糖蛋白的示例性CAR

缩写；1^stGen CAR，第一代CAR；2^ndGen CAR，第2代CAR；DC SIR，双链SIR；OHC SIR，一个半链SIR.

表10中上述示例性构建体中的辅助模块是任选的，并且可以删除或替换为其他辅助模块。

表11：使用具有HIV1-N49P6的CAR的SEQ ID NO作为参考的含有不同抗原结合结构域的CAR的SEQ ID NO

表12.共表达hNEMO-K277A和PAC辅助模块的示例性的第一代CAR构建体。两个辅助模块都是任选的。

表13.使用针对zCAR-NEMO-K277A描述的抗原结合结构域(表12)作为模板进行CAR/BITE的SEQ ID鉴定

表14：具有不同抗原结合结构域的Ab-TCR构建体。

在一些实施例中，所述组合物包含编码常规CAR 1-6(表1)的核酸，其中所述CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种特异性抗原，如表6A-C或通过引用并入本文的PCT/US2017/064379中的表5至6所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1至72(表2)中的任何一个或多个的核酸，其中编码的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种特异性抗原，如表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链1中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链2中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链37中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链38中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链49中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。在一些实施例中，所述组合物包含编码主链1的核酸，其中主链50中的CAR的抗原特异性结构域靶向一种或多种癌症特异性抗原，如本文表6A-C或PCT/US2017/064379中的表5至6中所述。

在各种实施例中，编码非天然存在的免疫受体如CAR的本文所述的主链的组分的分离的核酸分子编码一个、两个、三个或更多个抗原特异性结构域。例如，可以使用一种或多种与本文所述的癌症相关抗原特异性结合的ASD。ASD的序列与编码CAR的一个或多个链的剩余部分的核酸序列邻接并在相同的阅读框中。

在一个实施例中，如果单独的V_H结构域足以赋予抗原特异性(“单结构域抗体”)，则每个抗原特异性区域包含具有V_H、CH1、铰链以及CH2和CH3(Fc)Ig结构域的全长IgG重链(对靶抗原具有特异性)。全长IgG重链可以通过适当的跨膜结构域连接至共刺激结构域和任选的细胞内信号传导结构域。如果V_H和V_L结构域两者都是产生完全活性的抗原特异性靶向区所必需的，则将含V_H的非天然存在的免疫受体(例如CAR)和全长λ轻链(IgL)两者引入细胞中以产生活性的抗原特异性靶向区。

在一些实施例中，编码的非天然存在的免疫受体(例如CAR)分子的抗原特异性结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab′)2、单结构域抗体(SDAB)、vH或vL结构域或骆驼科vHH结构域。在一些实施例中，非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原结合结构域是scFv抗体片段，与其来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。

在一些情况下，scFv可根据本领域已知的方法制备(例如，Bird等人，(1988)《科学(Science)》242：423-426和Huston等人，(1988)《美国科学学院学报》85：5879-5883)。ScFv分子可通过使用柔性多肽接头将V_H和V_L区连接在一起来产生。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成(例如，以优化折叠等)的接头(例如，Ser-Gly接头)。scFv可以在其V_L和V_H区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的接头。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复。接头长度的变化可保留或增强活性，在活性研究中产生优异的功效。在一些实施例中，抗原特异性scFv抗体片段的功能在于它们以与其来源的IgG抗体相同或相当的亲和力结合相同的抗原。在其他实施例中，与其来源的抗体相比，抗体片段对抗原具有较低的结合亲和力，但其功能在于提供本文所述的生物反应。在一个实施例中，CAR分子包含对靶抗原具有10^-4M至10^-8M、10^-5M至10^-7M、10^-6M或10^-8M的结合亲和力KD的抗体片段。

在一个实施例中，抗原特异性结构域包含本文列出的抗体或scFv的一个、两个或全部三个重链(hc)CDR、hcCDR1、hcCDR2和hcCDR3(表6B；SEQ ID NO：14122-15039)和/或本文列出的抗体或scFv的一个、两个或全部三个轻链(lc)CDR、lcCDR1、lcCDR2和lcCDR3(表6A；SEQ ID NO：13204-14121)(还参见PCT/US2017/064379的表5至6)。在一些实施例中，ASD包含V_L(或vL)片段，其包含属于特定scFv的所有三个轻链CDR(表6A；SEQ ID NO：13204-14121)或V_H(或vH)片段，其包含属于特定scFv的所有三个重链(表6B；SEQ ID NO：14122-15039)(还参见PCT/US2017/064379的表5至6)。表6C提供了不同的scFv的名称、靶抗原和SEQ ID No，其vL和vL片段和CDR列于表6A和6B中。vL和vH片段和相应的scFv可用于本公开的各种实施例中以构建本文所述的CAR。

在另一个实施例中，抗原特异性结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人天然产生的抗体或其片段的相似性。在一方面，抗原结合结构域是人源化的。人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括但不限于CDR移植、镶饰或表面重塑和链替换。

在进一步的实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)的每个抗原特异性结构域可以包含二价(divalent或bivalent)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)。例如，在包含di-scFV的CAR中，通过产生具有两个V_H和两个V_L区的单个肽链将对每种抗原具有特异性的两个scFv连接在一起，产生串联scFv。(Xiong，Cheng-Yi；Natarajan，A；Shi，XB；Denardo，GL；Denardo，SJ(2006).“肿瘤靶向抗MUC-1多聚体的开发：di-scFv不成对的半胱氨酸位置对聚乙二醇化和肿瘤结合的影响(Development of tumor targeting anti-MUC-1multimer：effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation andtumor binding)”。《蛋白质工程化设计和选择(Protein Engineering Design andSelection)》19(8)：359-367；Kufer，Peter；Lutterbüse，Ralf；Baeuerle，Patrick A.(2004).“双特异性抗体的复兴(Arevival of bispecific antibodies)”。《生物技术趋势(Trends in Biotechnology)》22(5)：238-244)。包含至少两个抗原特异性靶向区的CAR将表达对两种抗原中的每一种具有特异性的两种scFv。所得到的ASD通过铰链区和跨膜结构域与共刺激结构域和细胞内信号传导结构域连接。可替代地，包含两个抗原特异性靶向区的非天然存在的免疫受体(例如CAR)将表达对两种抗原或相同抗原的两种表位中的每一种具有特异性的两种vHH。靶向两种抗原的示例性CAR由SEQ ID NO：1307和1310表示。

在另一个实施例中，非天然存在的免疫受体(例如CAR)的每个ASD包含双体抗体。在双体抗体中，scFv用接头肽产生，所述接头肽对于两个可变区而言太短而不能折叠在一起，从而驱动scFv二聚化。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体的形成，即所谓的三体抗体或三抗体。也可以使用四体抗体。

在一些实施例中，非天然存在的免疫受体(例如CAR)的ASD包括如本文所述的V_HH片段(纳米抗体)(参见，PCT/US2017/064379的表5至6)。在一些实施例中，非天然存在的免疫受体(例如CAR)的ASD包含如本文所述的亲和体(参见PCT/US2017/064379的表5至6)。

在另一个实施例中，抗原特异性结合结构域包含在靶细胞上表达的同源物的配体。

在一个实施例中，针对靶抗原的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原特异性结构域是靶向这一抗原的vHH片段的抗原结合部分，例如CDR(参见PCT/US2017/064379的表5至6)。

在一个实施例中，针对靶抗原的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原特异性结构域是靶向这一抗原的非免疫球蛋白支架的抗原结合部分(参见PCT/US2017/064379的表5至6)。

在一个实施例中，针对靶抗原的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原特异性结构域是已知结合这一靶抗原的受体的抗原结合部分(参见PCT/US2017/064379的表5至6)。

在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。制备这种TCR的方法是本领域已知的。参见例如Willemsen RA等人，《基因疗法(Gene Therapy)》7：1369-1377(2000)；Zhang T等人，《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther)》11：487-496(2004)；Aggen等人，《基因疗法(Gene Ther.)》19(4)：365-74(2012)(参考文献以其整体并入本文)。例如，可以对含有来自通过接头(例如，柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和vβ基因的scTCR进行工程化。这一方法对于本身是细胞内的癌症相关靶标非常有用，但是，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈现在癌细胞表面上。

在一些实施例中，抗原特异性结构域是对靶抗原具有特异性的T细胞受体或T细胞受体的片段，其中所述片段保留了对靶抗原的特异性。

在一些实施例中，本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原特异性结构域与MHC呈递的肽结合。通常，源自内源蛋白的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并由CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的一类独特的细胞表面靶标。已经在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情况中描述了靶向衍生自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如Sastry等人，《病毒学杂志(J Viral.)》2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，《血液(Blood)》，2011117(16)：4262-4272；Verma等人，《免疫学杂志(J Immunol)》2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，《基因疗法》20018(21)：1601-1608；Dao等人，《科学转化医学(Sci Transl Med)》20135(176)：176ra33；Tassev等人，《癌症基因疗法》2012 19(2)：84-100)。例如，可以通过筛选文库如人scFv噬菌体展示文库来鉴定TCR样抗体。基于靶向WT1的与HLA-A2结合的TCR样抗体的示例性CAR由SEQ ID NO：1266至SEQ ID NO：1268表示。在本发明中，使用衍生自针对若干HLA-A2限制性细胞内肽的TCR样抗体的抗原结合结构域产生CAR。表8显示了靶蛋白抗原、肽片段和肽序列。

在一些实施例中，当被单独或与本文所述的辅助模块一起表达时，可由非天然存在的免疫受体(例如，CAR)靶向的疾病特异性抗原包括但不限于以下中的任何一种或多种：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也称为CD2子集1、CRACC、MPL、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α(FRa或FR1)；叶酸受体β(FRb)；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGEl)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)；岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、***受体(CGHR或GR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HIA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、RasG12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、Liv1、粘连蛋白-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原或其组合。

在一些实施例中，当被单独或与本文所述的辅助模块一起表达时，可由非天然存在的免疫受体(例如CAR)靶向的疾病特异性抗原包括但不限于以下中的任何一种或多种：4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人离散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、***I受体、整联蛋白α5β1、整联蛋白αvβ3、LAMP1、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-R α、PDL192、磷脂酰丝氨酸、***癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白或其组合。对癌症具有特异性的其他抗原对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本公开的替代实施例结合使用。

当单独或与本文所述的辅助模块一起使用时，CAR可以包含与疾病支持抗原(例如，本文所述的疾病支持抗原)结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)。在一些实施例中，疾病支持抗原是存在于支持引起疾病的细胞的存活和增殖的细胞上的抗原。在一些实施例中，疾病支持抗原是存在于基质细胞或髓样来源抑制细胞(MDSC)上的抗原。基质细胞可以分泌生长因子和细胞因子，从而在微环境中促进细胞增殖。MDSC细胞可以阻止T细胞增殖和激活。不希望被理论所束缚，在一些实施例中，表达CAR的细胞破坏了疾病支持细胞，从而间接地阻止了引起疾病的细胞的生长或存活。

在某些实施例中，基质细胞抗原选自以下中的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)和腱生蛋白。在一个实施例中，FAP特异性抗体是西罗珠单抗(sibrotuzumab)、与西罗珠单抗竞争结合或与西罗珠单抗具有相同的CDR。在实施例中，MDSC抗原选自以下中的一种或多种：CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此，在一些实施例中，疾病支持抗原选自以下中的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)或腱生蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。

在另一个实施例中，本公开提供了与本公开的任何非天然存在的免疫受体结合表6A-C中所描述的不同靶标上的相同表位的非天然存在的免疫受体例如CAR(例如，具有与本公开的任何CAR交叉竞争结合不同靶标的能力的CAR)。在一些实施例中，这些非天然存在的免疫受体(例如CAR)的抗原特异性结构域可以衍生自抗体的vL片段、vH片段或scFv片段。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定本公开的非天然存在的免疫受体(例如CAR)识别的靶表位的参考抗体是本文表6C中描述的具有如SEQ ID NO：4555-4815、11165-11401、15070-15132(表6C)所示或如PCT/US2017/064379的表5至6所述的序列的scFv。在一个示例性实施例中，由SEQ ID NO：4555表示的参考scFv FMC63(vL-vH)可用于交叉竞争研究中，以确定基于FMC63的常规CAR和本公开的主链识别的靶表位。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定本文描述的本公开的非天然存在的免疫受体(例如CAR)识别的靶表位的参考vHH片段是具有如SEQ ID NO：4474-4514所示的序列的vHH片段。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定本文描述的本公开的非天然存在的免疫受体(例如CAR)识别的靶表位的参考非免疫球蛋白抗原结合支架是具有如SEQ ID NO：4515-4519所示的序列的非免疫球蛋白抗原结合支架。在一些实施例中，用于交叉竞争研究以确定本文描述的本公开的CAR识别的靶表位的参考配体是具有SEQ ID No：4544-4554序列的配体。在一些实施例中，针对不同靶标进行交叉竞争研究的参考CAR是其SEQ ID在表10至14中显示的CAR。

在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本公开的靶向MPL的CAR识别的靶表位的参考抗体是在专利申请US 2012/0269814 A1中描述的抗体mAb-1.6、mAb-1.111、mAb-1.75、mAb-1.78、mAb-1.169和mAb-1.36。

在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本公开的靶向MPL的CAR识别的靶表位的参考scFv是具有如表6C的SEQ ID NO：4720-4727所示或如PCT/US2017/064379的表5至6所描述的序列的scFv。

在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本公开的靶向MPL的CAR识别的靶表位的参考配体是具有如SEQ ID NO：4544-4545中所列的序列的TPO和mTPO配体。

在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本公开的靶向MPL的CAR识别的靶表位的参考CAR是具有如SEQ ID NO：5120-5126所示的序列的CAR。

在优选的实施例中，本公开的靶向MPL的CAR与对应于SEQ ID NO：15160所示序列的表位结合。

在一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向CD19的CAR识别的靶表位的参考scFv是具有如SEQ ID NO：4555-4568和表6C中所示或如PCT/US2017/064379的表5至6所描述的序列的scFv。在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向CD19的CAR识别的靶表位的参考CAR是具有如SEQ ID NO：4929-4943所示的序列的CAR。

在一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向CD20的CAR识别的靶表位的参考scFv是靶向CD20的scFv，并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6所描述的SEQ ID的scFvs。在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向CD20的CAR识别的靶表位的参考CAR是靶向CD20并具有表12中所列的SEQ ID的CAR。

在优选的实施例中，本公开的靶向CD20的CAR与对应于SEQ ID NO：15149-15154所示的一个或多个序列的表位结合。

在一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向BCMA的CAR识别的靶表位的参考scFv是靶向CD20并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6中所描述的SEQ ID的scFv。在另一个实施例中，用于交叉竞争研究以确定本发明的靶向BCMA的CAR识别的靶表位的参考CAR是靶向BCMA并且具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在优选的实施例中，本公开的靶向BCMA的CAR与对应于SEQ ID NO：15155-15159所示的一个或多个序列的表位结合。

在一个实施例中，用于针对本发明的靶向DLL3的CAR进行交叉竞争研究的参考scFv是靶向DLL3并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6所描述的SEQ ID的scFv。在另一个实施例中，用于针对本发明的靶向DLL3的CAR进行交叉竞争研究的参考CAR是靶向DLL3并且具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在一个实施例中，用于针对本发明的靶向LAMP1的CAR进行交叉竞争研究的参考scFv是靶向LAMP1并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6中所描述的SEQID的scFv。在另一个实施例中，用于针对本发明的靶向LAMP1的CAR进行交叉竞争研究的参考CAR是靶向LAMP1并且具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在一个实施例中，用于针对本发明的靶向TROP2的CAR进行交叉竞争研究的参考scFv是靶向TROP2并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6中所描述的SEQID的scFv。在另一个实施例中，用于针对本发明的靶向TROP2的CAR进行交叉竞争研究的参考CAR是靶向TROP2并且具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在一个实施例中，用于针对本发明的靶向PTK7的CAR进行交叉竞争研究的参考scFv是靶向PTK7并且具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6中所描述的SEQID的scFv。在另一个实施例中，用于针对本发明的靶向PTK7的CAR进行交叉竞争研究的参考CAR是靶向PTK7并且具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在一个实施例中，用于针对本发明的靶向CD22、CD123、CD33、CD37、CD70、CD138、CS1、IL13Ra2、叶酸受体α、叶酸受体β、TCRB1、TCRB2、TCRγδ、CD30、间皮素、Her2、EGFRviii和HIV1的CAR进行交叉竞争研究的参考scFv是靶向这些抗原并具有如表6C中所列或如PCT/US2017/064379的表5至6中所描述的SEQ ID的scFv。在另一个实施例中，用于针对本发明的靶向CD22、CD123、CD33、CD37、CD70、CD138、CS1、IL13Ra2、叶酸受体α、叶酸受体β、TCRB1、TCRB2、TCRγδ、CD30、间皮素、Her2、EGFRviii和HIV1的CAR进行交叉竞争研究的参考CAR是靶向这些抗原并具有如表12所列的SEQ ID的CAR。

在一些实施例中，本文描述的CAR在抗原特异性结构域和跨膜结构域之间包含铰链或接头区。在一些实施例中，铰链区包含以下中的任何一种或多种：人CD8α或抗体的Fc片段或其功能等效物、片段或衍生物，人CD8α或抗体的铰链区或其功能等效物、片段或衍生物，抗体的CH2区，抗体的CH3区，人工间隔序列以及其组合。在示例性实施例中，铰链区包含以下中的任何一种或多种：(i)IgG4的铰链、CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链和CH2区，(iv)CD8α的铰链区，(v)IgG1的铰链、CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区，(vi)IgG1的铰链和CH2区，或(vii)它们的组合。

在一些实施例中，如本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的两个或更多个功能结构域被一个或多个接头分开。接头是长度为约1至100个氨基酸的寡核苷酸或多肽区域，其将本公开的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施例中，接头可以是例如长度为5至12个氨基酸，长度为5至15个氨基酸或长度为5至20个氨基酸。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸构成，使得相邻的蛋白质结构域相对彼此自由移动。更长的接头，例如长于100个氨基酸的那些，可以与本公开的替代实施例结合使用，并且可以被选择以例如确保两个相邻的结构域在空间上不会彼此干扰。

如本文所述，本文所述的CAR包含跨膜结构域。跨膜结构域可以包含来自具有跨膜结构域的任何蛋白质(包括I型、II型或III型跨膜蛋白中的任何一种)的跨膜序列。本公开的CAR的跨膜结构域也可以包含人工疏水序列。可以选择本文描述的CAR的跨膜结构域，使得跨膜结构域不二聚。在一些实施例中，CAR包含本文所述的具有选自以下的跨膜结构域的任何主链：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。

跨膜结构域可以在跨膜区域的任一端包含一个或多个其他氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)(例如，在细胞外延伸到跨膜区的一个或多个氨基酸和/或在细胞内延伸到跨膜区的一个或多个氨基酸)。在一方面，跨膜结构域与CAR的其他结构域之一邻接。在一个实施例中，跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在另一方面，跨膜结构域不源自CAR的任何其他结构域所源自的相同蛋白质。

在各种实施例中，编码本文所述的主链的非天然存在的免疫受体(例如CAR)组分的分离的核酸分子编码零个、一个、两个、三个或更多个细胞内信号传导结构域。

如本文所述，本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)可任选地包含细胞内信号传导结构域。这一结构域可以是细胞质的，并且可以转导效应功能信号并定向细胞以执行其专门功能。细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体的ζ链或任何其同源物(例如，η链、CD3ε、CD3γ、CD3δ、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ链等)、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子如CD2、CD5和CD28。具体而言，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcγRIII、FcεR、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)或其组合。额外的细胞内信号传导结构域对本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施例结合使用。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ链、FcgRIII、FceRI、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)及其组合中的一个或多个的信号传导结构域。

在各种实施例中，编码本文所述的主链的非天然存在的免疫受体(例如CAR)组分的分离的核酸分子编码零个、一个、二个、三个或更多个共刺激结构域。在示例性实施例中，共刺激结构域包含以下中的任何一个或多个的信号传导结构域：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40以及其组合。本文的上面和其他地方提供了本公开的非天然存在的免疫受体(例如CAR)的各种组分。再次，应该认识到，本公开提供了例如包含胞外域的CAR，所述胞外域包含通过接头的“铰链”附接至跨膜结构域的抗原特异性结合结构域，所述抗原特异性结合域又连接至包含一个或多个刺激结构域和任选的一个或多个细胞内信号传导结构域的胞外域。

本文提供由一种或多种编码常规CAR 1至6(表1)或本文所述主链1至72中的任何一个或多个(表2)的核酸分子编码的一种或多种多肽。

本文还提供了由编码常规CAR 1至6的一种或多种核酸分子编码的一种或多种多肽。在一些实施例中，CAR的抗原特异性结构域对靶细胞如癌细胞上的一种、两种、三种或更多种抗原具有特异性。如本文所述，CAR的每个组分是连续的并且与CAR的每个其他组分在相同阅读框中。在一些实施例中，在包含主链的CAR中包含多于一个抗原特异性结构域，抗原特异性结构域中的每一个是连续的并且与相同CAR中的其他抗原特异性结构域在相同的阅读框中。

本文还提供了由一种或多种编码主链1至10的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含本文所述的常规CAR I和编码NF-κB刺激分子的辅助模块(例如，vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A或其变体)。主链1至10中的辅助模块可以用编码不同分子的其他辅助模块替代，包括不同的NF-κB激活剂(例如K13-opt、hNEMO-K277A-δ-V249-K255或hNEMO-K277L等)。本文还提供了由一种或多种编码主链11至12的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含常规CAR I和编码IgSP-[hTRAC-opt2]和IgSP-[hTRBC-opt2]的辅助模块。在一些实施例中，包含主链1至12的CAR的抗原特异性结构域对靶细胞如癌细胞上的一种、两种、三种或更多种抗原具有特异性。如本文所述，CAR的每个组分是连续的并且与包含主链1至12的CAR的每个其他组分在相同阅读框中。在一些实施例中，在包含主链1至12的CAR中包含多于一个抗原特异性结构域，抗原特异性结构域中的每一个是连续的并且与相同CAR中的其他抗原特异性结构域在相同的阅读框中。

本文还提供了由一种或多种编码主链13至22的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含本文所述的常规CAR II和编码NF-κB刺激分子的辅助模块(例如，vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A或其变体)。主链13至22中的辅助模块可以被编码不同分子的其他辅助模块替代，包括不同的NF-κB激活剂(例如，K13-opt、hNEMO-K277A-δ-V249-K255或hNEMO-K277L等)。在一些实施例中，包含主链13至22的CAR的抗原特异性结构域对靶细胞如癌细胞上的一种、两种、三种或更多种抗原具有特异性。如本文所述，CAR的每个组分是连续的并且与包含主链13至24的CAR的每个其他组分在相同的阅读框中。在一些实施例中，在包含主链13至24的CAR中包含多于一个抗原特异性结构域，抗原特异性结构域中的每一个是连续的并且与相同CAR中的其他抗原特异性结构域在相同的阅读框中。

本文还提供了由一种或多种编码主链37至46的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含本文所述的Ab-TCR和编码NF-κB刺激性分子的辅助模块(例如，vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A或其变体)。主链37至46中的辅助模块可以由编码不同分子的其他辅助模块替代，包括不同的NF-κB激活剂(例如，K13-opt、hNEMO-K277A-δ-V249-K255或hNEMO-K277L等)。

本文还提供了由一种或多种编码主链49至58的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含本文所述的双链cTCR/SIR和编码NF-κB刺激分子的辅助模块(例如，vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A或其变体)。主链49至58中的辅助模块可以被其他编码不同分子的辅助模块替代，包括不同的NF-κB激活剂(例如，K13-opt、hNEMO-K277A-δ-V249-K255或hNEMO-K277L等)。

本文还提供了由一种或多种编码主链61至70的核酸分子编码的一种或多种多肽，所述主链包含本文所述的一个半链(OHC)cTCR/SIR和编码NF-κB刺激分子的辅助模块(例如，vFLIP-K13、hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-K277A、FKBPx2-hNEMO-L753(251)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)、FKBPx2-RIP-ID、IKK2-S 177E-S 181E、IKK1-S176E-S180E、MyD88-L265P、TCL-1A或其变体)。主链61至70中的辅助模块可以被其他编码不同分子的辅助模块替代，包括不同的NF-κB激活剂(例如，K13-opt、hNEMO-K277A-δ-V249-K255或hNEMO-K277L等)。

在各种实施例中，由编码CAR的核酸分子编码的多肽包含一个、两个、三个或多个NF-κB刺激分子(例如，K13-vFLIP、K13opt、NEMO、NEMO K277A、人NEMO-K277L、人NEMO-K277A-δV249-K255或小鼠NEMO K270A或其变体)，所述CAR为本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)一部分。

在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对血小板生成素受体MPL具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD19具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61的一部分)，其中CAR的抗原特异性结构域对CD20具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD22具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)(，其中CAR的抗原特异性结构域对CD23具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD30具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD32具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD33具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD123具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD138具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD200R具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD276具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD324具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对BCMA具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CS1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对ALK1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对ROR1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CDH6具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CDH16具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CDH17具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CDH19具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对EGFRviii具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Her2具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Her3具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对间皮素具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对叶酸受体α具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对叶酸受体β具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CLL-1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CLEC5A具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对NY-ESO/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对WT1/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对WT1/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61，其中CAR的抗原特异性结构域对AFP/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对HPV16-E7/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对gp100/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对hTERT/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对MART1/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对HTLV1-Tax/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对PR1/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对HIV1-gag/MHC I类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对HIV1-包膜gp120具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对DLL3具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对PTK7具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对TROP2具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对LAMP1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Tim1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61，其中CAR的抗原特异性结构域对TCRγ-δ具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对TCRβ1恒定链具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对TCRβ2恒定链具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对GCC具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对B7H4具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对LHR具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对TSHR具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Tn-Muc1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对TSLPR具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对组织因子具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对SSEA-4具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链32或主链33)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对SLea具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Muc1/MHCI类复合物具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Muc16具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对NYBR-1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对IL13Ra2具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对IL11Ra具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对L1CAM具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对EpCAM1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对gpNMB具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对GRP78具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对GPC3具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对GRPC5D具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对GFRa4具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对FITC具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD79b具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Lym1具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对Lym2具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至4的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CLD18A2具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至4的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61，其中CAR的抗原特异性结构域对在白血病细胞上表达的CD43表位具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至4的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对CD179a具有特异性。在一些实施例中，本文提供了由编码CAR的核酸分子编码的多肽，所述CAR是常规CAR 1至6的一部分或本文所述主链(如主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分，其中CAR的抗原特异性结构域对抗体的Fc部分(即Ig Fc)具有特异性。具有对Ig Fc具有特异性的抗原特异性结构域的示例性CAR由SEQ ID NO：1629表示，并且含有CD16-V158的细胞外结构域作为抗原特异性结构域。在上述的任何一种中，编码CAR构建体的核酸分子还包含NF-κB激活剂编码序列，或者可替代地，NF-κB激活剂编码序列可以存在于第二个核酸分子上。

编码非天然存在的免疫受体(例如CAR)的期望组分的核酸序列和/或本文所述的选择性NF-κB激活剂编码序列可以使用本领域已知的重组方法获得，如例如通过从表达核酸分子的细胞筛选文库，通过从已知包含所述核酸分子的载体衍生核酸分子，或通过使用标准技术直接从含有所述核酸分子的细胞和组织分离来获得。可替代地，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。

在一些实施例中，以信使RNA(mRNA)转录物的形式提供编码本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)和/或辅助分子(例如NF-κB激活剂序列)的核酸分子。在另一个实施例中，以DNA构建体的形式提供编码本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)和/或辅助分子(例如，选择性NF-κB激活剂编码序列)的核酸分子。

克隆和表达方法对本领域技术人员是显而易见的，并且可以如WO 2015/142675；Sambrook等人，2012，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL)》，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；June等人2009《自然综述免疫学(Nature Reviews Immunology)》9.10：704-716；WO 01/96584；WO 01/29058；美国专利第6,326,193号中所述，其各自的内容通过引用整体并入本文，如同在本文中进行了阐述。将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法如磷酸钙转染等是本领域公知的，并且对本领域技术人员是显而易见的。在示例性实施例中，这种方法在Sambrook等人，2012，《分子克隆：实验室手册》，第1-4卷冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；美国专利第5,350,674和5,585,362中号进行了阐述，其各自的内容通过引用整体并入本文，如同在本文中进行了阐述。在另一个实施例中，使用微流体装置通过在细胞膜中引起瞬时扰动，将CAR载体转导入细胞，例如，T细胞或NK细胞，所述微流体装置如在专利申请WO 2013/059343A1(PCT/US2012/060646)和Ding X等人，《自然生物医学工程(Nat.Biomed.Eng.)》1，0039(2017)中所述，其各自的内容通过引用整体并入本文，如同在本文中进行了阐述。

本公开提供了重组核酸构建体，其包含编码非天然存在的免疫受体(例如CAR)的核酸分子，其中所述核酸分子包含编码一个或多个抗原结合结构域的核酸序列，其中编码抗原结合结构域中的每一个的核苷酸序列与编码以下各项的核酸序列邻接并在相同的阅读框中：(i)任选的铰链/接头，(ii)跨膜结构域以及(iii)任选的细胞内结构域，或(a)T细胞受体恒定链。可用于构建SIR的示例性T细胞受体恒定链包括但不限于TCRα的恒定链。TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδ、preTCRα以及其变体和突变体。在一些实施例中，NF-κB激活剂(例如，选择性NF-κB激活剂)编码序列在相同重组核酸构建体上，但在表达后，不连接至非天然存在的免疫受体(例如，CAR)，而是被切割掉(例如，通过肽可切割接头)或为多核苷酸中其自身表达盒的一部分。

本公开还提供了包含编码本文所述的非天然存在的免疫受体(例如CAR)和辅助模块的核酸序列的载体。在一些实施例中，辅助模块编码NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂。在一些实施例中，选择性NF-κB激活剂是非天然存在的NF-κB激活剂。在一个实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和辅助模块(例如编码NF-κB激活剂的辅助模块)由单个载体编码。在另一个实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和辅助模块(例如编码NF-κB激活剂的辅助模块)由多于一个载体编码。在又一个实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和辅助模块(例如编码NF-κB激活剂的辅助模块)各自由单独的载体或单独的核酸编码。在一个实施例中，两个功能性多肽单元(例如，CAR和辅助模块)由单个载体或单个核酸编码。在一个实施例中，载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、睡美人转座子载体或piggyback转座子。在一个实施例中，载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。在另一个实施例中，载体是睡美人转座子载体。示例性载体的核酸序列以SEQ ID NO：3840-3841提供。载体pLenti-EF1α(SEQ ID NO：3840)和pLenti-EF1α-DWPRE(SEQ ID NO：3841)是空的慢病毒载体，其区别在于pLenti-EF1α-DWPRE缺乏WPRE区域。pCCL3-MNDU3-WPRE载体的核酸序列以SEQ ID NO：7779给出。可以将本公开的非天然存在的免疫受体编码序列克隆在这些载体中的Nhe I和Sal I位点之间。

逆转录病毒载体也可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可包括，例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目标转基因，例如编码非天然存在的免疫受体(例如CAR)的基因。γ逆转录病毒载体可能缺乏病毒结构基因，如gag、pol和env。示例性的γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)以及从其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体例如描述于Tobias Maetzig等人，“γ逆转录病毒载体：生物学、技术和应用(Gammaretroviral Vectors：Biology，Technology and Application)”，《病毒(Viruses)》2011年6月，3(6)：677-713。在另一个实施例中，包含编码本公开的期望的非天然存在的免疫受体的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。

在一些实施例中，本公开的载体可以进一步包含启动子。启动子的非限制性实例包括，例如MNDU3启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子、核心启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施例中，启动子是EF-1启动子。在一些实施例中，载体包含多聚(A)尾。在一些实施例中，载体包含3′UTR。

本公开还包括可以直接转染到细胞中的RNA构建体。一种产生用于转染的mRNA的方法包括：用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，然后添加多聚A，以产生含有3′和5′非翻译序列(“UTR”)(例如，本文所述的3′和/或5′UTR)、5′帽(例如，本文所述的5′帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文所述的IRES)、待表达的核酸和典型地长度为50至2000个碱基的多聚A尾(SEQ ID NO：3855)的构建体。这样产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施例中，模板包括非天然存在的免疫受体(例如CAR)，和/或NF-κB刺激分子的序列。在一个实施例中，通过电穿孔将RNA CAR-NFκB载体转导入细胞，例如，T细胞或NK细胞。在另一个实施例中，通过使用微流体装置在细胞膜中引起瞬时扰动，将RNA CAR载体和/或NF-κB激活剂载体转导入细胞，例如，T细胞或NK细胞。也可以使用一种或多于一种载体、不同载体或技术的组合，将不同的链(或功能性多肽单元)引入细胞中。在另一个实施例中，可以使用逆转录病毒载体引入非天然存在的免疫受体(例如，CAR)，而使用慢病毒载体引入编码NF-κB激活剂的辅助模块。在另一方面，使用慢病毒载体引入非天然存在的免疫受体(例如，CAR)，而使用睡美人转座子引入辅助模块(例如，NF-κB激活剂)。在又一方面，使用慢病毒载体引入非天然存在的免疫受体例如CAR，而使用RNA转染引入辅助模块(例如，NF-κB激活剂)。在又一方面，使用本领域已知的基因靶向技术，在内源TCR链基因座处通过基因重组在细胞中产生非天然存在的免疫受体(例如CAR)，而使用慢病毒或逆转录病毒载体引入辅助模块。

可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，例如，商业上可获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，科隆，德国))、(ECM 830(BTX)(哈弗仪器(Harvard Instruments)，波士顿，马萨诸塞州)或Gene PulserII(伯乐(BioRad)，丹佛，科罗拉多州)、Multiporator(Eppendert，汉堡，德国)、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装、肽介导的转染或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人《人类基因疗法(Hum Gene Ther.)》，12(8)：861-70(2001))或通过使用微流体装置在细胞膜中引起瞬时扰动(参见，例如专利申请WO 2013/059343A1和PCT/2012/060646)。

在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座因子)。在一些实施例中，转座子是可将其自身***基因组中某个位置的DNA片段，例如，能够自我复制并将其拷贝***基因组的DNA片段，或者可从较长核酸中剪接出并***基因组中另一位置的DNA片段。例如，转座子包含由用于转座的反向重复序列侧翼基因组成的DNA序列。

使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见，例如，Aronovich等人《人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.20.R1(2011)：R14-20；Singh等人《癌症综述(Cancer Res.)》15(2008)：2961-2971；Huang等人《分子疗法》16(2008)：580-589；Grabundzija等人《分子疗法》18(2010)：1200-1209；Kebriaei等人《血液(Blood.)》122.21(2013)：166；Williams.《分子疗法(Molecular Therapy)》16.9(2008)：1515-16；Bell等人《自然实验手册(Nat.Protoc.)》2.12(2007)：3153-65；和Ding等人《细胞(Cell.)》122.3(2005)：473-83，其全部通过引用并入本文。

SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子，和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转座至靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，将转座子(包括转基因)从质粒中切除，并将其***宿主细胞的基因组中。参见，例如，Aronovich等人，如上所述。

示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人《核酸综述》41.3(2013)：1829-47；和Singh等人《癌症综述》68.8(2008)：2961-2971，其全部通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc 1/mariner型转座酶，例如SB 10转座酶或SB 11转座酶(可以从例如巨细胞病毒启动子表达的高活性转座酶)。参见，例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，其全部通过引用并入本文。

SBTS的使用允许有效整合和表达转基因，例如编码本文所述的CAR和/或NF-κB激活剂的核酸。本文提供了例如使用转座子系统如SBTS产生稳定表达本文所述的CAR和/或NF-κB激活剂的细胞，例如T细胞或NKT细胞或干细胞或iPSC或合成T细胞的方法。

根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸例如质粒递送至细胞(例如，T或NKT细胞或干细胞或iPSC或合成T细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法，例如本文所述的方法(例如，电穿孔、转染或脂质转染)来递送核酸。在一些实施例中，核酸含有转座子，其包含转基因，例如，编码本文所述的非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和/或NF-κB激活剂的核酸。在一些实施例中，核酸含有转座子，其包含转基因(例如，编码本文所述的非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和/或NF-κB激活剂的核酸)以及编码转座酶的核酸序列。在其他实施例中，提供了具有两个核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，且第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一和第二核酸共递送到宿主细胞中。

如本文上面和其他地方所述，本公开证实了本公开的免疫受体(例如，CAR、内源TCR或重组TCR)与NF-κB刺激分子(例如，选择性NF-κB激活剂，例如非天然存在的NF-κB激活试剂，例如hNEMO-K277A)的共表达改善了免疫细胞的功能，如存活、扩增、增殖、激活、持久性、细胞因子产生和体内活性。在一些实施例中，免疫受体是非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)。在一些实施例中，免疫受体是天然存在的免疫受体(例如，天然TCR)。在一个实施例中，NF-κB刺激分子与第一代、第二代、第三代CAR、TFP、AbTCR或SIR共表达。如上所述，NF-κB刺激分子可以但不优选与CAR、TCR或SIR主链连接。此外，在某些实施例中，本公开的CAR不包括CD28或41BB结构域，并且任选地包括CD3结构域。

在一个实施例中，本公开证明选择性NF-κB激活剂的表达改善了免疫细胞(例如，T细胞、树突状细胞、CAR-T细胞或TCR-T细胞等)的功能，如存活、扩增、增殖、激活、持久性、细胞因子产生和体内活性。本文所述的选择性NF-κB激活剂是指选择性激活NF-κB信号传导途径而不激活或最低限度地激活其他信号传导途径的试剂。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂激活NF-κB信号传导途径，而不激活或最低限度地激活一种或多种信号传导途径，所述一种或多种信号传导途径选自由以下组成的群组：AKT、PI3K、JNK、p38激酶、ERK、JAK/STAT和干扰素信号传导途径。测量NF-κB、AKT、PI3K、JNK、p38激酶、ERK、JAK/STAT和干扰素信号传导途径的激活的许多方法是本领域已知的。这些测定可以单独或组合用于本公开的方法中，以鉴定NF-κB途径的选择性激活剂。

在一个实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(CellSignaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但AKT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(CellSignaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但JNK途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗体(例如，克隆G9；Cell SignalingTechnology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κBp65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但p38激酶途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体(例如，克隆D3F9；Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat1(Tyr701)抗体(例如，克隆D4A7；Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat2(Tyr690)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat3(Tyr705)抗体(例如，克隆D3A7，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell SignalingTechnology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat5(Tyr694)抗体(例如，克隆D47E7，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-NF-κB p65(Ser536)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但ERK途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(例如，克隆D13.14.4E，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。

在一个实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，CellSignaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但AKT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，CellSignaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但JNK途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗体(例如，克隆G9；Cell SignalingTechnology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但p38激酶途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体(例如，克隆D3F9；Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell SignalingTechnology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat1(Tyr701)抗体(例如，克隆D4A7；Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat2(Tyr690)抗体(Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat3(Tyr705)抗体(例如，克隆D3A7，Cell SignalingTechnology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一些实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但STAT途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-Stat5(Tyr694)抗体(例如，克隆D47E7，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。在一个实施例中，与对照人T细胞相比，选择性NF-κB激活剂暴露于测试人T细胞或在测试人T细胞中表达时诱导NF-κB活性增加超过20％(例如，超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，所述增加是用Phospho-IκBα(Ser32)抗体(例如，克隆14D4，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的，但ERK途径活性增加低于20％，所述增加是用Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(例如，克隆D13.14.4E，Cell Signaling Technology；丹弗斯，马塞诸塞州)测量的。

测量NF-κB、AKT、JNK、p38、ERK、JAK/STAT和干扰素信号传导途径的激活的其他方法是本领域已知的，并且可用于鉴定NF-κB信号传导途径的选择性激活剂。例如，与c-Jun、c-Fos、JunD、ATF2、STAT3、NFAT1c、ELK-1、CREB、IRF3或IRF7DNA结合活性的增加相比，当暴露于靶细胞或在靶细胞(例如，T细胞或293FT细胞)中表达时，选择性NF-κB激活剂诱导NF-κB DNA结合活性的更大增加。测量属于不同信号传导途径的不同转录因子的DNA结合活性的试剂盒是商业上可获得的(例如，

转录因子测定；活性基序)，并可用于鉴定NF-κB信号传导途径的选择性激活剂。

在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达时，或者当在相当的条件下通过两者的信号传导在人T细胞中被激活时，与CD28相比，选择性NF-κB激活剂诱导IκBα磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中在相当的条件下表达时，或者当在相当的条件下通过两者的信号传导在人T细胞中被激活时，与41BB相比，选择性NF-κB激活剂诱导IκBα磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率增加更多倍。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞时，与含有CD28共刺激结构域的第2代CAR相比，当与缺乏共刺激结构域的第1代CAR共表达时，选择性NF-κB激活剂诱导IκBα磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞(例如，RAJI)时，与含有41BB共刺激结构域的第2代CAR(例如，由SEQ ID NO：1318表示的CAR)相比，选择性NF-κB激活剂在与缺乏共刺激结构域的第1代CAR(例如，由SEQ ID NO：1016表示的CAR)共表达时，诱导IκBα磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。例如，当两个CAR-T细胞都以1∶5的E∶T比暴露于RAJI细胞1至24小时时，与表达具有41BB共刺激结构域的CD19导向的第2代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC；SEQ ID NO：1318)的T细胞相比，共表达K13的表达CD19导向的第一代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC；SEQ ID NO：1016)的T细胞显示IκBα磷酸化与AKT磷酸化的比率的更大增加。通过使用本领域已知的方法(例如，免疫印迹或流式细胞术)，使用对它们的磷酸化形式具有特异性的抗体，计算IκBα和AKT的磷酸化。暴露于RAJI细胞后，通过从CAR-T细胞中的IκBα磷酸化中减去缺乏CAR表达的对照T细胞中的IκBα磷酸化来计算IκBα磷酸化的增加。暴露于RAJI细胞后，通过从CAR-T细胞中的AKT磷酸化中减去缺乏CAR表达的对照T细胞中的AKT磷酸化来计算AKT磷酸化的增加。通过将IκBα磷酸化的增加除以AKT磷酸化的增加来计算IκBα增加与AKT磷酸化增加的比率。

在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达时或者当在相当的条件下通过两者的信号传导在人T细胞中被激活时，与CD28相比，选择性NF-κB激活剂诱导p65/RelA磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中在相当的条件下表达时或者当在相当的条件下通过两者的信号传导在人T细胞中被激活时，与41BB相比，选择性NF-κB激活剂诱导p65/RelA磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率增加更多倍。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞时，与含有CD28共刺激结构域的第2代CAR相比，当与缺乏共刺激结构域的第1代CAR共表达时，选择性NF-κB激活剂诱导p65/RelA磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞(例如，RAJI)时，与含有41BB共刺激结构域的第2代CAR(例如，由SEQ ID NO：1318表示的CAR)相比，选择性NF-κB激活剂在与缺乏共刺激结构域的第1代CAR(例如，由SEQ ID NO：1016表示的CAR)共表达时，诱导p65/RelA磷酸化增加与AKT磷酸化增加的比率的更大增加。例如，当两个CAR-T细胞都以1∶5的效应子：靶标(E∶T)比暴露于RAJI细胞1至24小时(例如，1小时、2小时、4小时、12小时或24小时)时，与表达具有41BB共刺激结构域的CD19指导的第2代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC；SEQ ID NO：1318)的T细胞相比，共表达K13的表达CD19导向的第一代CAR(CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC；SEQ ID NO：1016)的T细胞显示p65/RelA磷酸化与AKT磷酸化的比率的更大增加。通过使用本领域已知的方法(例如，免疫印迹或流式细胞术)，使用对它们的磷酸化形式具有特异性的抗体，来计算p65/RelA和AKT的磷酸化。在两者都暴露于RAJI细胞后，通过从CAR-T细胞中的p65/RelA磷酸化中减去缺乏CAR表达的对照T细胞中的p65/RelA磷酸化来计算p65/RelA磷酸化的增加。在两者都暴露于RAJI细胞后，通过从CAR-T细胞中的AKT磷酸化中减去缺乏CAR表达的对照T细胞中的AKT磷酸化来计算AKT磷酸化的增加。通过将p65/RelA磷酸化的增加除以AKT磷酸化的增加来计算p65/RelA增加与AKT磷酸化增加的比率。

在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞(例如，RAJI)适当的时间间隔(例如，1至24小时)时，与含由41BB共刺激结构域的第2代CAR(例如，由SEQ ID NO：1318表示的CAR)相比，当与缺乏共刺激结构域的第1代CAR(例如，由SEQ ID NO：1016表示的CAR)共表达时，选择性NF-κB激活剂诱导IκBα磷酸化增加与JNK、ERK或p38激酶磷酸化增加的比率的更大增加。在一个实施例中，当两者都在人T细胞中表达并在相当的条件下暴露于含有靶抗原的细胞(例如，RAJI)适当的时间间隔(例如，1至24小时)时，与含有41BB共刺激结构域的第2代CAR(例如，由SEQ ID NO：1318表示的CAR)相比，当与缺乏共刺激结构域的第1代CAR(例如，由SEQ ID NO：1016表示的CAR)共表达时，选择性NF-κB激活剂诱导p65/RelA磷酸化增加与JNK、ERK或p38激酶磷酸化增加的比率的更大增加。

在一个实施例中，包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB激活剂是一种非天然存在的试剂并且在细胞中外源表达。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂是病毒来源的，即它由病毒编码或衍生自病毒编码的蛋白质或具有多于10个氨基酸残基(例如，多于15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、30个氨基酸残基或50个氨基酸残基)的结构域，与一种或多种病毒蛋白具有超过80％(例如，超过85％、90％、95％或99％)的同一性。一种示例性的病毒来源的选择性NF-κB激活剂是vFLIP K13(SEQ ID NO：)，其衍生自卡波西肉瘤相关疱疹病毒。在另一个实施例中，选择性NF-κB激活剂是哺乳动物或细胞来源的。哺乳动物来源的示例性选择性NF-κB激活剂是人NEMO-K277A突变体、人NEMO-K277-δV249-K255突变体、小鼠NEMO-K270A突变体、IKK2-S177E-S181E和IKK1-S176E-S180E。在另一个实施例中，选择性NF-κB激活剂是人来源的；即，其具有多于10个氨基酸残基(例如，多于15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、30个氨基酸残基或50个氨基酸残基)的结构域，与一种或多种人蛋白质具有超过80％(例如，超过85％、90％、95％或99％)的同一性。在一些实施例中，选择性NF-κB激活剂由两种或更多种融合蛋白(例如，FKBPx2-NEMO)构成。在一些实施例中，选择性NF-κB激活剂的两个或更多个融合伴侣各自衍生自人蛋白质或与人蛋白质具有超过80％的同一性。

在一些实施例中，选择性NF-κB激活剂由野生型核酸序列编码，而在其他实施例中，选择性NF-κB激活剂由密码子优化的核酸序列或突变体序列编码。在一个示例性实施例中，vFLIP K13由人密码子优化的核酸序列例如K13-opt(SEQ ID NO：7768)编码。

在一些实施例中，免疫细胞表达单一的选择性NF-κB激活剂，而在其他实施例中，免疫细胞表达多于一种的选择性NF-κB激活剂(例如，NEMO-K277A加K13-opt或IKK2-S177E-S181E加IKK1-S176E-S180E)。

在一些实施例中，选择性NF-κB激活剂以组成型方式在免疫细胞中表达。在其他实施例中，选择性NF-κB激活剂以诱导型方式在免疫细胞中表达。在一个示例性实施例中，可以通过使用诱导型启动子来实现选择性NF-κB激活剂的诱导型表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白诱导型启动子、糖皮质激素诱导型启动子、孕酮诱导型启动子和四环素诱导型启动子。

系统代表了另一个用于控制蛋白质表达的转录调节平台。

控制蛋白质活性的方法是本领域已知的，并且可以用于控制包括选择性NF-κB激活剂在内的NF-κB激活剂的活性。在一个示例性实施例中，这涉及与二聚结构域或转换结构域融合的NEMO或NEMO突变体在靶细胞如T细胞或NK细胞中的表达。在示例性实施例中，转换结构域包括FKBP12结构域或FKBP12v36结构域的一个或多个拷贝。在一些实施例中，转换结构域附接至NF-κB激活剂(例如，NEMO)的羧基端，而在其他实施例中，转换结构域附接至NF-κB激活剂(例如，NEMO)的氨基端。将表达这种融合蛋白的靶细胞暴露于合适的二聚体(例如，利米度塞)会导致NEMO寡聚，进而导致NF-κB激活。在一个替代实施例中，还可以通过将选择性NF-κB激活剂融合至突变的***受体的配体结合结构域来控制选择性NF-κB激活剂的活性，如已经描述过的(Matta H等人，《生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)》，282，34，2007)。突变的***受体不与生理配体***结合，但与合成配体4-OHT(4-羟基他莫昔芬)具有很高的亲和力，并以4-OHT依赖的方式调节融合伴侣(例如，NF-κB激活剂，例如vFLIP K13或NEMO)的活性。

在一些实施例中，使用本领域已知的基因编辑技术通过改变其基因组拷贝而在免疫细胞中表达选择性NF-κB激活剂。在一个示例性实施例中，基因编辑系统(例如，TALON、Zn指核酸酶或CRISP/Cas9)用于将人NEMO的一个或两个等位基因转化为人NEMO-K277A突变体形式。在另一个示例性实施例中，基因编辑系统用于将人NEMO的一个或两个等位基因转化为人NEMO-K277A-δ-V249-K255突变体形式。可以用于诱导K277A和K277A-δ-V249-K255突变的靶向人NEMO基因的构建体的序列分别以SEQ ID NO：7771和7772提供。可以将这些序列克隆到合适的载体(例如，整合缺陷型慢病毒载体、AAV载体或腺病毒载体)中。可产生包含互补靶序列的CRISP/Cas9 gRNA的人NEMO的基因组靶序列的实例以SEQ ID NO：7759-7762提供。将gRNA序列克隆到pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体(Addgene)中。可替代地，可以按照经销商提供的说明，将gRNA序列克隆到可从Addgene(Plasmid#52961)获得的pLenti-CRISPR-v2载体中。基本上如前所述，将靶向NEMO的构建体和编码gRNA的构建体引入T细胞中(Knipping F等人，《分子疗法：方法与临床开发(Molecular Therapy：Methods&Clinical Development)》，卷4，2017)。

在本文所述的任何前述实施例的另一个或进一步的实施例中，当在类似条件下进行比较时，与缺乏辅助模块的相应免疫效应细胞相比，表达编码选择性NF-κB激活剂(例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E或IKK1-S176E-S180E)的辅助模块的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞表现出改善的体外活性(例如，靶抗原诱导的IL2产生、增殖、扩增、和终末分化的延迟、衰老的延迟等)。免疫效应细胞中的NF-κB激活通过使用本领域已知的技术来测量，包括但不限于测量磷酸化的IκBα、磷酸化的p65、总IκBα、p65核易位、NF-κB应答基因的上调、电泳迁移率变动测定(EMSA)和基于NF-κB的报告基因测定等。在一些实施例中，选择性NF-κB激活是通过测量免疫效应细胞中NF-κB激活的增加倍数相对于AKT途径激活的增加倍数来确定的。在一些实施例中，当在类似实验条件下测试两者时，与缺乏编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt或hNEMO-K277A)的辅助模块表达的相应免疫效应细胞相比，表达编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt(人密码子优化的K13)或hNEMO-K277A)的辅助模块的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞显示出更高的体外活性(例如，靶抗原诱导的IL2产生、增殖、扩增、和终末分化的延迟以及衰老的延迟)。在一个示例性实施例中，当在类似实验条件下测试两者时，与不表达编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt或hNEMO-K277A)的辅助模块的相应CD19-CAR-表达效应细胞相比，表达编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt(人密码子优化的K13)或hNEMO-K277A)的辅助模块的CD19-CAR-表达免疫效应细胞对Nalm6细胞显示出更高的体外活性(例如，靶抗原诱导的IL2产生、增殖、扩增、和终末分化的延迟以及衰老的延迟)。在一些实施例中，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞(即靶细胞)的体外活性(例如，靶抗原诱导IL2的产生、增殖、扩增和终末分化的延迟和衰老的延迟)比不表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的相应免疫效应细胞的体外活性高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％。在一些实施例中，表达选择性NF-κB激活剂(例如，hNEMO-K277A)的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞(即靶细胞)的体外活性(例如，靶抗原诱导IL2的产生、增殖、扩增和终末分化的延迟和衰老的延迟)比缺乏选择性NF-κB激活剂表达的相应免疫效应细胞的体外活性高至少1.25倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍。在一个实施例中，与缺乏选择性NF-κB激活剂表达的对照免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)相比，当暴露于表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6细胞)时，表达选择性NF-κB激活剂的免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)产生高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％的IL2。在一个实施例中，与缺乏选择性NF-κB激活剂表达的对照免疫效应T细胞(例如，CAR-T细胞)相比，当暴露于表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6细胞)时，表达选择性NF-κB激活剂的免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)显示出高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％的增殖。在一个实施例中，与缺乏选择性NF-κB激活剂表达的对照免疫效应T细胞(例如，CAR-T细胞)相比，当暴露于表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6细胞)时，表达选择性NF-κB激活剂的免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)显示出少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％的耗竭标记物。在一个实施例中，与缺乏选择性NF-κB激活剂表达的对照免疫效应T细胞(例如，CAR-T细胞)相比，当暴露于表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6细胞)时，表达选择性NF-κB激活剂的免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)显示出少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％的终末分化标记物。在一个实施例中，与缺乏选择性NF-κB激活剂表达的对照免疫效应T细胞(例如，CAR-T细胞)相比，当连续暴露于表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6细胞)3至4周的时段时，表达选择性NF-κB激活剂的免疫效应T细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)显示出高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或100％的细胞毒性。在一些实施例中，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞是T细胞(例如，CD8T细胞、CD4T细胞、CAR-T细胞、TIL、TREG细胞、NKT细胞)、NK细胞(例如，CAR-NK细胞)、巨噬细胞(例如，表达CAR的巨噬细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)、干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或可以产生免疫效应细胞的干细胞。

在本文所述的任何前述实施例的另一个或进一步的实施例中，当在类似条件下测试两者时，与不表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的对照免疫效应细胞相比，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞显示出更高的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达萤光素酶的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)。免疫效应细胞中的NF-κB激活通过使用本领域已知的技术测量，包括但不限于测量磷酸化的IκBα、总IκBα、p65核易位、NF-κB应答基因的上调、电泳迁移率变动测定(EMSA)和基于NF-κB的报告基因测定等。在一些实施例中，选择性NF-κB激活是通过测量免疫效应细胞中NF-κB激活的增加倍数相对于AKT途径激活的增加倍数来确定的。例如，在一些实施例中，当在类似实验条件下测试时，与缺乏编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt(人密码子优化的K13)或hNEMO-K277A)的辅助模块的相应表达CD19-CAR的效应细胞相比，表达编码选择性NF-κB激活剂(例如，K13-opt(人密码子优化的K13)或hNEMO-K277A)的辅助模块的CD19-CAR-表达免疫效应细胞对NSG小鼠异种移植模型中的Nalm6-FLuc细胞显示出更高的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)。在一些实施例中，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)对NSG小鼠异种移植模型中的表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6)的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)比缺乏编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的相应免疫效应细胞的体内活性高至少5、10、20、30、40、50％或100％。在一些实施例中，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞(例如，CD19-CAR-T细胞)对NSG小鼠异种移植模型中的表达靶抗原的细胞(例如，Nalm-6)的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)比缺乏编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块表达的相应免疫效应细胞的体内活性高至少1.25倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍。在一些实施例中，表达编码选择性NF-κB激活剂的辅助模块的免疫效应细胞是T细胞(例如，CD8 T细胞、CD4 T细胞、CAR-T细胞、TIL、TREG细胞、NKT细胞)、NK细胞(例如，CAR-NK细胞)、巨噬细胞(例如，表达CAR的巨噬细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)、干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或可以产生免疫效应细胞的干细胞。

在本文所述的任何前述实施例的另一个或进一步的实施例中，当在类似条件下进行比较时，与缺乏辅助模块的相应免疫效应细胞相比，表达辅助模块(例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E或MYD88-L265P)的免疫效应细胞对表达靶抗原的细胞显示出更高的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)。例如，在一些实施例中，当在类似实验条件下测试时，与缺乏hNEMO-K277A表达的相应CD19-CAR-表达效应细胞相比，还共表达hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E或MYD88-L265P的CD19-CAR-表达免疫效应细胞对NSG小鼠异种移植模型中的Nalm6-FLuc细胞显示出更高的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)。在一些实施例中，表达本文所述的辅助模块(例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E或MYD88-L265P)的免疫效应细胞对NSG小鼠异种移植模型中的表达靶抗原的细胞(即，靶细胞)的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)比缺乏辅助模块表达的相应免疫效应细胞的体内活性高至少5、10、20、30、40、50％或100％。在一些实施例中，表达本文所述的辅助模块(例如，hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K555、mNEMO-K270A、K13-opt、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E或MYD88-L265P)的免疫效应细胞对NSG小鼠异种移植模型中的表达靶抗原的细胞(即，靶细胞)的体内活性(例如，体内扩增，体内持久性，肿瘤减少，从表达FLuc的肿瘤获得的生物发光值减小或动物存活减少)比缺乏辅助模块表达的相应免疫效应细胞的体内活性高至少1.25倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍。在一些实施例中，表达辅助模块的效应细胞是T细胞(例如，CD8T细胞、CD4T细胞、CAR-T细胞、TIL、TREG细胞、NKT细胞)、NK细胞(例如，CAR-NK细胞)、巨噬细胞(例如，表达CAR的巨噬细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)、干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或可以产生免疫效应细胞的干细胞。

本公开进一步提供了选择性NF-κB激活剂的表达可以用于改善由包括树突细胞在内的抗原呈递细胞产生的细胞因子分泌、抗原呈递和免疫应答。本公开进一步提供了通过在离体或在体内在抗原呈递细胞中表达选择性NF-κB激活剂来改善疫苗(包括癌症疫苗)的功效的方法。在一个实施例中，使用选择性NF-κB激活剂使抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)的细胞因子产生(例如，TNFα)增加超过至少15％。

本公开进一步提供了编码CMV-141(SEQ ID NO：7770)的辅助模块可以表达在免疫效应细胞中，例如T细胞，例如CAR-T细胞或TCR-T细胞，以延迟它们的耗竭和提高他们的长期持久性。CMV-141可以以诱导型或组成型方式在免疫效应细胞中表达。

在一些实施例中，通过使用利用SBTS的基因***和利用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化大范围核酸酶、再工程化的归巢内切核酸酶)的基因编辑的组合来产生表达本文所述的非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和/或NF-κB刺激分子的细胞，例如T或NKT或干细胞或iPSC或合成T细胞。

在另一个实施例中，本公开内容提供了一种制备细胞(例如，免疫效应细胞或其群)的方法，所述方法包含用包含编码非天然存在的免疫受体(例如CAR)和/或NF-κB刺激分子的核酸的载体引入(例如，转导)本文所述的细胞，例如T细胞、NKT细胞或干细胞或iPSC或合成T细胞。

在各种实施例中，可以从期望治疗的受试者获得用于用本文所述的非天然免疫受体和/或NF-κB刺激分子修饰的细胞，包括T细胞或NK细胞。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。T细胞可以是组织驻留的γ-δT细胞，其可以在表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR)和/或NF-κB刺激分子之前在体外培养和扩增。

在一个实施例中，本公开提供了许多嵌合抗原受体(CAR)，其包含经工程化以与疾病相关抗原例如本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)。在一个实施例中，本公开提供了一种免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其经工程化以表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子，其中经工程化的免疫效应细胞表现出治疗特性。在一个实施例中，本公开提供了一种免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其经工程化以表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子，其中经工程化的免疫效应细胞表现出抗癌或抗感染(例如，抗HIV-1)特性。在一些实施例中，NF-κB刺激分子可以与其内源TCR一起在T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)中表达，其中经工程化的免疫效应细胞表现出抗癌或抗感染(例如，抗HIV-1)特性。在一个实施例中，用非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和NF-κB刺激分子转化细胞，并且非天然存在的免疫受体在细胞表面表达。在一些实施例中，用编码非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子的病毒载体转导细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这样的实施例中，细胞可以稳定地表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子。在另一个实施例中，用编码非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子的核酸例如mRNA、cDNA、DNA转染细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一些这样的实施例中，细胞可以瞬时表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子。在一些实施例中，NF-κB刺激分子可以与其内源TCR一起在T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)中表达。

本公开提供了免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其被工程化以含有将免疫效应细胞定向至患病细胞或疾病相关细胞如癌细胞的一种或多种非天然存在的免疫受体(例如，CAR/TCR)和/或NF-κB刺激分子。这是通过免疫受体上对癌症相关抗原具有特异性的抗原结合结构域来实现的。本公开的CAR可以靶向两类癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面表达的癌症相关抗原；和(2)本身是细胞内的癌症相关抗原，但是，这种抗原(肽)的片段通过主要组织相容性复合物(MHC)呈现在癌细胞表面。本公开还提供了免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其含有内源TCR和/或经工程化以表达将免疫效应细胞定向至患病细胞或疾病相关细胞如癌细胞的一种或多种NF-κB刺激分子。

此外，本公开提供了也表达NF-κB刺激分子的CAR、TCR和CAR/TCR-表达细胞，和它们在治疗涉及表达本文所述的肿瘤抗原或疾病相关抗原的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫性疾病或传染性疾病或变性疾病或变应性疾病以及其他疾病的药物或方法中的用途。

在一个实施例中，本公开提供了经工程化以表达非天然存在的免疫受体(例如CAR和/或TCR)和NF-κB刺激性分子的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其中经工程化的免疫效应细胞表现出抗疾病特性，例如抗肿瘤特性。一种类型的抗原是本文描述的癌症相关抗原(即，肿瘤抗原)。在一方面，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)的抗原结合结构域包含部分人源化的抗体片段。在一个实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR)的抗原结合结构域包含部分人源化的scFv。因此，本公开提供了非天然存在的免疫受体(例如，CAR)，其包含人源化抗原结合结构域并且被工程化入细胞，例如T细胞或NK细胞，其中所述细胞也表达NF-κB刺激分子，和其用于过继性疗法的方法。

在一个实施例中，本公开提供了一种具有其内源免疫受体(例如，TCR)的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其被工程化以表达NF-κB刺激分子，其中经工程化的免疫效应细胞表现出抗疾病特性，例如抗肿瘤特性或抗HIV-1特性。

本文还提供了基因工程细胞，其包含本文所述的多核苷酸和/或非天然存在的免疫受体。在一些实施例中，细胞是T淋巴细胞(T细胞)。在一些实施例中，细胞是原初T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、调节性T细胞(Treg)或其组合。在一些实施例中，细胞是自然杀伤(NK)细胞、造血干细胞(HSC)、胚胎干细胞或多能干细胞。可以包含并表达本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)的与NF-κB刺激分子组合的基因工程细胞，包括但不限于T淋巴细胞(T-细胞)、原初T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞、能够产生与治疗相关后代的造血干细胞和/或多能胚胎/诱导干细胞。在一个实施例中，基因工程细胞是自体细胞。在一个实施例中，基因工程细胞是同种异体细胞。举例来说，本发明的单个T细胞可以是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4-/CD8-或CD4+/CD8+。T细胞可以是CD4+/CD8-和CD4-/CD8+细胞的混合群或单个克隆的群。当本发明的CD4+T-细胞与表达靶抗原的细胞(例如，CD20+和/或CD19+肿瘤细胞)在体外共培养时，可能会产生IL-2、IFNγ、TNFα和其他T细胞效应细胞因子。当本发明的CD8+T-细胞与靶细胞体外共培养时，可以裂解抗原特异性靶细胞。在一些实施例中，T细胞可以是CD45RA+CD62L+原初细胞、CD45RO+CD62L+中央记忆细胞、CD62L-效应记忆细胞或它们的组合中的任何一种或多种(Berger等人，病毒特异性和肿瘤特异性T细胞免疫的过继转移《免疫学现状(Curr Opin Immunol)》200921(2)224-232)。可以通过用编码本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的DNA稳定转染细胞来产生基因修饰的细胞。证明单个整合的未重排载体的存在和非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的表达的转染细胞可以离体扩增。在一个实施例中，被选择用于离体扩增的细胞是CD8+，并证明了特异性识别和裂解抗原特异性靶细胞的能力。

抗原在适当条件下刺激T细胞会导致细胞增殖(扩增)和/或产生IL-2。包含本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的细胞的数量将响应一种或多种抗原与非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)的抗原特异性靶向区域的结合而扩增。本公开还提供了一种制备和扩增表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)的细胞的方法。所述方法包括用表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的载体转染或转导细胞，和用表达靶抗原、重组靶抗原或引起细胞增殖的受体抗体的细胞刺激细胞，以便制备和扩增T细胞。在一个实施例中，细胞可以是能够产生治疗相关后代的T淋巴细胞(T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、造血干细胞(HSC)或多能胚胎/诱导干细胞中的任何一种或多种。在一个实施例中，NF-κB刺激分子可以在细胞(例如，T细胞、NK细胞或可以产生免疫细胞的干细胞)中表达，而不引入非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)。

包含如本文所述的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的免疫效应细胞，如T细胞和NK细胞，通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开第20060121005号所述的方法激活和扩增。

在一个实施例中，基因工程细胞包含编码常规CAR 1至6或为本文所述主链(例如，主链1、主链2、主链13、主链14、主链37、主链38、主链49、主链50、主链60或主链61)的一部分的常规CAR 1至6以及NF-κB刺激分子的核酸分子，其中CAR的抗原特异性结构域对MPL、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CLL1、TCR-β1恒定链、TCR-β2恒定链、TCRγ/δ、间皮素、IL13Ra2、ALK、PTK7、DLL3、TROP2、Tim1、LAMP1、CS1、Lym1、Lym2、TSHR、NY-ESO-1/MHC 1类复合、WT1/MHC I类复合物、Ras/MHC I类复合物、AFP/MHC I类复合物、HPV-E6/MHC I类复合物、HPV-E7/MHC I类复合物、CD179a、CLD18A2、CD43表位或HIV1 env蛋白gp120具有特异性。

在一个实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞缺少内源T细胞受体链中的一个或多个。可以使用多种方法，例如使用靶向内源T细胞受体链的Zn指核酸酶(ZFN)、CRISP/Cas9和shRNA来产生根据本公开的稳定缺乏功能性TCR表达的T细胞。关于shRNA的非限制性示例性方法在US 2012/0321667A1中描述，其通过引用并入本文。与使用靶向TCR的α和β链的恒定区的ZFN消除内源TCR表达有关的另一种非限制性的示例性方法描述于Torikai H等人(《血液》，119(24)，2012年6月14日)中。

例如，缺乏功能性内源TCR的T细胞可以被工程化，使其在表面上不表达任何功能性内源TCR，所述工程化使其不表达包含功能性内源TCR的一个或多个亚基(例如，内源TCRα、TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδ或pre-TCRα的恒定链)，或所述工程化使其在表面上产生的功能性内源TCR很少。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式来表达实质上受损的内源TCR。术语“实质上受损的TCR”是指所述TCR不会在宿主中引起不利的免疫反应。在又一个替代方案中，可以将非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子克隆到T细胞基因组处的TCR基因座中，并且因此，非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子将处于内源T细胞表达系统的控制下。

本公开证明与第1代或第2代CAR构建体的情况相反，当在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRα链多肽的αβT细胞中表达时，基于CD3ε、CD3γ和CD3δ链的TFP(称为CD3ε/γ/δTFP)具有差的表达和活性。例如，观察到CD3ε/γ/δTFP在αβT细胞中的表达和活性(例如，T细胞激活、增殖、细胞因子产生和细胞毒性等)受损，其中内源TRAC基因座位点已被TFP表达盒破坏。本公开提供了这一问题的解决方案，即通过在其中天然全长TCRα链多肽的表达已被减少或消除的T细胞中重新表达TCRα恒定链(TRAC链)多肽或其片段提供了该问题的解决方案。在一个实施例中，重新表达的TCRα恒定链多肽或TCRα恒定链片段允许在其中天然TCRα恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中重建功能性CD3ε/γ/δTFP-TCR-CD3信号传导复合物。在一个实施例中，重新表达的TCRα恒定链或TCRα恒定链片段将其中天然TCRα恒定链的表达受损、减少或消除的表达CD3ε/γ/δTFP的αβT细胞的靶抗原诱导的细胞因子(例如，IL2、TNFα、IFNγ)产生、增殖和/或细胞毒性活性提高超过15％(例如，超过20％、50％、75％或100％等)。在一个实施例中，重新表达的TCRα恒定链或TCRα恒定链片段允许CD3ε/γ/δTFP在其中天然TCRα恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中的表达增强。在一个实施例中，重新表达的TCRα恒定链或TCRα恒定链片段允许CD3ε/γ/δTFP在其中天然TCRα恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中的表达增加超过15％(例如，超过20％、50％、75％或100％等)。在一个示例性实施例中，CD3ε/γ/δTFP的表达和信号传导活性可以在其中通过将编码外源TCRα恒定链(TRAC链)(例如，SEQ ID NO：1010)的核酸构建体引入这种T细胞而减少或消除了天然TCRα链的表达的αβT细胞中恢复。在一个优选的实施例中，编码外源TRAC链的核苷酸序列是密码子优化的，并且在其核苷酸序列上不同于内源或天然TCRα恒定链。在一个替代实施例中，编码外源TRAC链的核苷酸序列是密码子优化的，并带有一个或多个已知增强人TCRα恒定链表达的氨基酸取代(参见表3)。在一个示例性实施例中，可用于允许TFP-TCR-CD3复合物在其中内源TCRα基因的表达已被下调或消除的αβT细胞中的重新表达和/或活性的外源TRAC链具有如SEQ ID NO：3886至3894所示的序列，或具有编码与SEQ ID NO：3886至3894所示的序列编码的多肽具有大于80％同源性的多肽的序列。为了使得能够进行其细胞表面表达，将编码外源TCRα恒定链(TRAC)的核苷酸序列与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接。在一个实施例中，可以将其他非天然存在的序列(例如，接头或抗原结合结构域)任选地添加至编码TRAC链的序列，只要它们不干扰其募集TCR-CD3信号传导复合物的其他组分和/或CD3ε/γ/δTFP的能力即可。在一个实施例中，外源TCRα恒定链多肽不与表达它的T细胞中存在的天然Vα序列(即抗原结合结构域)可操作地连接。在一个实施例中，外源TCRα恒定链多肽的表达不允许αβT细胞恢复其天然抗原识别特异性和/或亲和力，例如以识别T细胞识别的与其内源TCRα链的MHC-肽抗原复合物。在一个示例性实施例中，编码外源TCRα恒定链的辅助模块可以使用合适的方法(例如，慢病毒介导的基因转移)本身(SEQ ID NO：1010)在αβT细胞中表达，或者其可以使用单个载体(例如，慢病毒载体)与TFP表达盒共表达。递送和表达两个或更多个基因或RNA的替代方法在本领域中是已知的并且在本公开中描述，并且可以用于本发明的替代实施例中。SEQ ID NO：3538、3540和3542显示了与靶向MPL的TC3α/γ/δTFP构建体共表达TCRα恒定链的示例性构建体的核苷酸序列。在示例性构建体CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRAC-opt2](SEQ ID NO：3538)中，第一盒编码CD3ε-TFP，其包含CD8信号肽，接着是靶向人MPL蛋白的人源化scFV以及CD3ε的细胞外、跨膜和胞质结构域。这一TFP编码盒在框中后面是编码Furine-SGSG-P2A的接头和编码信号肽(IgSP)的盒以及编码TRAC的密码子优化的核苷酸序列。在一个示例性实施例中，可以使用慢病毒载体在缺乏内源TCRα链的αβT细胞中表达整个盒。

在一个替代实施例中，可以使用内源TCRα恒定链基因在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRα链多肽的αβT细胞中恢复TCRα恒定链多肽的表达。在一个示例性实施例中，可以使用本领域中已知的基因编辑技术，通过将编码信号肽的核酸序列与内源TCRα恒定链基因的至少一个拷贝框内功能性连接来在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRα链多肽的αβT细胞中恢复TCRα恒定链多肽的表达。在一个示例性实施例中，编码信号肽的核酸序列与内源TCRα恒定链基因中的至少一个的第一外显子可操作地框内连接，以便允许TCRα恒定链多肽在T细胞表面上表达。在一个实施例中，编码信号肽和TCRα恒定链基因的表达盒处于内源TCRα启动子的转录调节控制下。在一个实施例中，编码信号肽和TCRα恒定链基因的表达盒共享3′非翻译序列和内源TCRα基因的调节控制。在一个替代实施例中，编码信号肽和TCRα恒定链基因的表达盒在外源启动子(例如，EF1α或CMV启动子)下。

在一个示例性实施例中，通过设计靶向盒，使得TFP盒框内之后为2A可切割接头、信号肽(例如，CD8信号肽或IgH信号肽)和TCRα恒定链(TRAC)的第一外显子，TCRα恒定链多肽的表达可以在其中通过编码TFP的盒的靶向整合破坏内源或天然TCRα链基因的αβT细胞中恢复(图5C)。示例性的这种靶向构建体由SEQ ID NO：3860表示。在此实施例中，TCRα恒定链由内源TCRα恒定链(TRAC)基因表达，通过靶向盒中存在的信号肽促进所述基因的细胞表面表达。在此实施例中，TCRα恒定链在TCRα基因启动子和TCRα3′非翻译区的调节控制下表达。替代的示例性靶向构建体由SEQ ID NO：3859表示，并且可以在本公开的替代实施例中用于通过编码TFP的盒的靶向整合来破坏内源TCRα链，同时允许从编码信号肽随后是密码子优化的TCRα恒定链cDNA和多聚A序列的表达盒重新表达TCRα恒定链(图5B)。

本公开还证明，与第1代或第2代CAR构建体的情况相反，CD3ε/γ/δTFP当在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRβ1和TCRβ2链多肽的αβT细胞(即表达TCRα和TCRβ链的T细胞)中表达时丧失其活性。例如，本公开提供了CD3ε/γ/δTFP在其中内源TCRβ1和TCRβ2基因组位点已被破坏的αβT细胞中具有受损的表达和活性(例如，T细胞激活、增殖细胞因子产生和细胞毒性等)。本公开提供了解决这一问题的方案，即通过在其中天然全长TCRβ1和TCRβ2链多肽表达已被减少或消除的T细胞中重新表达TCRβ1或TCRβ2恒定链多肽或其片段。在一个实施例中，重新表达的TCRβ1/β2恒定链多肽或TCRβ1/β2恒定链片段允许在T细胞，例如其中天然TCRβ1和/或β2恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中，重建功能性TFP-TCR-CD3信号传导复合物。在一个实施例中，重新表达的TCRβ1/β2恒定链或TCRβ1/β2恒定链片段将其中天然TCRβ1和/或β2恒定链的表达受损、减少或消除的表达TFP的αβT细胞的靶抗原诱导的细胞因子(例如，IL2、TNFα、IFNγ)产生、增殖和/或细胞毒性活性提高超过15％(例如，超过20％、50％、75％或100％等)。在一个实施例中，重新表达的TCRβ1/β2恒定链或TCRβ1/β2恒定链片段允许CD3ε/γ/δTFP在其中天然TCRβ1和/或β2恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中的表达增强。在一个实施例中，重新表达的TCRβ1/β2恒定链或TCRβ1/β2恒定链片段允许CD3ε/γ/δTFP在其中天然TCRβ1和/或β2恒定链的表达受损、减少或消除的αβT细胞中的表达增加超过15％(例如，超过20％、50％、75％或100％等)。在一个示例性实施例中，CD3ε/γ/δTFP的表达和信号传导活性可以在其中通过将编码外源TCRβ1/β2恒定链(TRBC链)(例如，SEQ ID NO：1011)的核酸构建体引入这种T细胞而减少或消除了天然TCRβ1和/或β2链的表达的T细胞中恢复。在一个优选的实施例中，编码外源TCRβ1/β2恒定链的核苷酸序列是密码子优化的，并且在其核苷酸序列上不同于内源或天然TCRβ1和/或β2恒定链。在一个替代实施例中，编码外源TCRβ1/β2恒定链的核苷酸序列是密码子优化的，并带有一个或多个已知增强人TCRβ1/β2恒定链表达的氨基酸取代(参见表4a、4b)。在一个示例性实施例中，可用于允许TFP-TCR-CD3复合物在其中内源TCRβ1和/或β2链的表达已被下调或消除的T细胞中的重新表达和/或活性的外源TCRβ1/β2链具有如SEQ ID NO：3895至3900所示的序列，或具有编码与SEQ ID NO：3895至3900所示的序列编码的多肽具有大于80％同源性的多肽的序列。为了使得能够进行其细胞表面表达，将编码外源TCRβ1/β2恒定链(TRBC)的核苷酸序列与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接。在一个实施例中，可以将其他非天然存在的序列(例如，接头或抗原结合结构域)任选地添加至编码TCRβ1/β2恒定链(TRBC)的序列，只要它们不干扰其募集TCR-CD3信号传导复合物的其他组分和/或TFP的能力即可。在一个实施例中，外源TCRβ1/β2恒定链多肽不与表达它的T细胞中存在的天然Vβ序列(即抗原结合结构域)可操作地连接。在一个实施例中，外源TCRβ1/β2恒定链多肽的表达不允许T细胞恢复其天然抗原识别特异性和/或亲和力，例如以识别T细胞识别的与其内源TCRβ1/β2链的MHC-肽抗原复合物。在一个示例性实施例中，编码外源TCRβ1/β2恒定链的辅助模块可以使用合适的方法(例如，慢病毒介导的基因转移)本身(SEQ ID NO：1011)在T细胞中表达，或者其可以使用单个载体(例如，慢病毒载体)与CD3ε/γ/δTFP表达盒共表达。递送和表达两个或更多个基因或RNA的替代方法在本领域中是已知的并且在本公开中进行了描述，并且可以用于本发明的替代实施例中。以SEQ ID NO：3537、3539和3541显示了与靶向MPL的TFP构建体共表达TCRβ恒定链的示例性构建体的核苷酸序列。在示例性构建体CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRBC-opt2](SEQ ID NO：3537)中，第一盒编码TFP，其包含CD8信号肽，接着是靶向人MPL蛋白的人源化scFV以及CD3ε的细胞外、跨膜和胞质结构域。这一TFP编码盒框内之后是编码Furine-SGSG-P2A的接头和编码信号肽(IgSP)的盒以及编码TCRβ恒定链(TRBC)的密码子优化的核苷酸序列。在一个示例性实施例中，可以使用慢病毒载体在缺乏内源TCRβ链的T细胞中表达整个盒。

在一个替代实施例中，可以使用内源TCRβ1或β2恒定链基因在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRα链多肽的αβT细胞中恢复TCRβ1或β2恒定链多肽的表达。在一个示例性实施例中，可以使用本领域中已知的基因编辑技术，通过将编码信号肽的核酸序列与内源TCRβ1或TCRβ2恒定链基因的至少一个拷贝框内功能性连接来在表面上缺乏或具有受损的功能性内源或天然TCRβ链多肽的αβT细胞中恢复TCRβ1/β2恒定链多肽和共表达的TFP的表达。在一个示例性实施例中，编码信号肽的核酸序列与内源TCRβ1或TCRβ2恒定链基因中的至少一个的第一外显子可操作地框内连接，以便允许TCRβ1/β2恒定链多肽和共表达的TFP在T细胞表面上表达。在一个实施例中，编码信号肽和TCRβ1/β2恒定链的表达盒处于内源TCRβ1/β2启动子的转录调节控制下。在一个实施例中，编码信号肽和TCRβ1/β2恒定链的表达盒处于3′非翻译序列和内源TCRβ1/β2基因的调节控制下。在一个替代实施例中，编码信号肽和TCRβ1/β2恒定链的表达盒在外源启动子(例如，EF1α或CMV启动子)下。

在一个示例性实施例中，通过设计靶向盒，使得TFP盒框内之后为2A可切割接头、信号肽(例如，CD8信号肽或IgH信号肽)和TCRβ1/β2基恒定链(TRBC)的第一外显子，TCRβ1/β2恒定链多肽的表达可以在其中通过编码TFP的盒的靶向整合破坏内源或天然TCRβ1和TCRβ2链基因的αβT细胞中恢复。

已经观察到将CAR盒导向至TRAC基因座导致大约95％的T细胞变为TCR阴性。这种TCR-阴性T细胞可用于同种异体环境，因为它们不太可能引起移植物抗宿主病(GVHD)。然而，在TRAC基因座已被TFP盒靶向的T细胞中TRAC链的重新表达将潜在地导致包括Vβ区在内的全长TCRβ链的表达。这种T细胞即使缺乏Vα区提供的MHC识别，也将可能能够识别通过其TCRβ链由MHC复合物呈递的同种抗原，并且因此潜在地引起GVHD。在本公开的替代实施例中，TCRα和TCRβ1或β2链均在表达CD3ε/γ/δTFP的αβT细胞中重新表达，其中内源TCRα和TCRβ1和TCRβ2链的表达已被下调或消除。

在以上实例中，将外源TRAC或TRBC与表达TFP的构建体共表达以恢复CD3ε/γ/δTFP在其中内源TCRα和/或TCRβ链的表达已例如通过靶向其基因座位点而被下调或消除的α/βT细胞中的表达和/或活性。在本发明的替代实施例中，外源TCRα和/或TCRβ1/β2恒定链的表达用于恢复任何α/βT细胞(包括野生型α/βT细胞或表达嵌合抗原受体、嵌合T细胞受体(cTCR)、AbTCR或合成免疫受体的α/βT细胞)中的TCR/CD3复合物表达。最后，可以使用类似的方法恢复其中内源TCRγ和/或TCRδ链的表达已被下调或消除的γ/δT细胞中的CAR/TFP和/或TCR/CD3表达。可在其中内源TCRγ和/或TCRδ链的表达已被下调或消除的γ/δT细胞中表达的TCRγ(TRGC)和TCRδ(TRDC)的示例性恒定链由SEQ ID NO：3912和3913表示。

本公开还提供了CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过重新表达TCRα/β/γ或δ恒定链的片段或变体而在天然TCRα/β/γ或δ链表达受损或缺乏的T细胞中恢复。可用于在缺乏天然TCRα/β/γ或δ链的细胞中恢复CD3ε/γ/δTFP表达的TCRα/β/γ和δ恒定链的片段/变体以SEQ ID No：15141-15144提供(表6D)。以SEQ ID No：15145-15148(表7)列出了编码具有IgH信号肽的这些链的表达盒。

本公开进一步提供了CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过共表达包含缺失的TCRα/β/γ或δ恒定链的SIR或Ab-TCR而在天然TCRα/β/γ或δ链表达受损或缺乏的T细胞中恢复。因此，在天然TCRα链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过表达包含TCRα恒定链的SIR来挽救。在一个示例性实施例中，在天然TCRα链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含TCRα恒定链的SIR(例如，由SEQ ID NO：9668、9669或9684等表示的SIR)来挽救。在另一个示例性实施例中，在天然TCRα链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含一部分TCRα恒定链的Ab-TCR(例如，由SEQ ID NO：9677或9678等表示的Ab-TCR)来挽救。本公开提供了对于与涉及两个CAR的同种异体T细胞的组合疗法，CD3α/γ/δTFP优选与SIR和/或Ab-TCR组合，所述SIR和/或Ab-TCR合并有在同种异体T细胞中的表达降低或缺失的TCR恒定链或TCR恒定链片段。

本公开进一步提供了在天然TCRβ链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过表达包含TCRβ恒定链的SIR来挽救。在一个示例性实施例中，在天然TCRβ1/β2链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含TCRβ恒定链的SIR(例如，由SEQ ID NO：9668、9669或9684等表示的SIR)来挽救。在另一个示例性实施例中，在天然TCRα链的表达受损或缺乏的αβT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含一部分TCRβ恒定链的Ab-TCR(例如，由SEQ ID NO：9677或9678等表示的Ab-TCR)来挽救。

本公开进一步提供了在天然TCRγ链的表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过表达包含TCRγ恒定链的SIR来挽救。在一个示例性实施例中，在天然TCRγ链的表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含TCRγ恒定链的SIR(例如，由SEQ ID NO：9689表示的SIR)来挽救。在另一个示例性实施例中，在天然TCRγ链表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含一部分TCRγ恒定链的Ab-TCR(例如，由SEQ ID NO：9676表示的Ab-TCR)来挽救。

本公开进一步提供了在天然TCRδ链的表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP的表达和活性可以通过表达包含TCRδ恒定链的SIR来挽救。在一个示例性实施例中，在天然TCRδ链的表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含TCRδ恒定链的SIR(例如，由SEQ ID NO：9689表示的SIR)挽救。在另一个示例性实施例中，在天然TCRδ链的表达受损或缺乏的γδT细胞中，CD3ε/γ/δTFP(例如，由SEQ ID NO：8708-8714编码的TFP)的表达和活性可以通过表达包含一部分TCRδ恒定链的Ab-TCR(例如，由SEQ ID NO：9676表示的Ab-TCR)来挽救。

本公开还提供了允许在内源TCR基因提供的生理调节机制下表达下一代CAR(例如，SIR和AbTCR)、cTCR和TCR的方法和构建体。本公开还提供了允许在内源TCR基因提供的启动子和3′非翻译调节控制机制下表达下一代CAR(例如，SIR和AbTCR)、cTCR和TCR的方法和构建体。在一个实施例中，本公开提供了使编码SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的表达盒靶向内源TCRα、TCRβ1/β2、TCRγ或TCRδ基因座的方法。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRα基因座(TRAC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRα恒定链全部或部分地由内源天然TCRα恒定链基因表达。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRα基因座(TRAC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRα恒定链完全或部分地由内源TCRα恒定链基因的外显子中的至少一个编码。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRα基因座(TRAC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRα恒定链完全或部分共享天然/内源TCRα恒定链基因的3′非翻译区和聚腺苷酸化序列。

在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRβ基因座(TRBC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRβ恒定链全部或部分地由内源天然TCRβ1或TCRβ2恒定链基因表达。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRβ1/β2基因座(TRBC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRβ恒定链完全或部分地由内源TCRβ恒定链基因的外显子中的至少一个编码。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRβ1/β2基因座(TRAC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRβ恒定链完全或部分共享天然/内源TCRβ恒定链基因的3′非翻译区和聚腺苷酸化序列。

在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRγ基因座(TRGC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRγ恒定链全部或部分地由内源天然TCRγ恒定链基因表达。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRγ基因座(TRGC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRγ恒定链完全或部分地由内源TCRγ恒定链基因的外显子中的至少一个编码。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRγ基因座(TRGC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRγ恒定链完全或部分共享天然/内源TCRγ恒定链基因的3′非翻译区和聚腺苷酸化序列。

在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRδ基因座(TRDC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRδ恒定链全部或部分地由内源天然TCRδ恒定链基因表达。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRδ基因座(TRGC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRδ恒定链完全或部分地由内源TCRδ恒定链基因的外显子中的至少一个编码。在一个实施例中，使SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR靶向内源TCRδ基因座(TRDC)，使得SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR的TCRδ恒定链完全或部分共享天然/内源TCRδ恒定链基因的3′非翻译区和聚腺苷酸化序列。

T细胞或自然杀伤(NK)或干细胞可获自受试者。术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠以及其转基因物种。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。T细胞可以是组织驻留的γ-δT细胞，其可以在表达CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子之前在体外培养和扩增。

在本公开的某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术，例如Ficoll^TM分离，从从受试者收集的单位血液中获得免疫效应细胞，例如T细胞。在一个优选的方面，来自个体的循环血液的细胞是通过单采术获得的。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地，将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于随后的处理步骤。在一个实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个替代实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。

没有钙的初始激活步骤会导致激活作用增强。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如按照制造商的说明使用半自动“直流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，细胞可以重悬于各种生物相容性缓冲液中，如例如无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或其他含有或不含缓冲液的盐水溶液。可替代地，可以除去单采术样品中不期望的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。

应认识到本申请的方法可利用包含5％或更少，例如2％人AB血清的培养基条件，并采用已知的培养基条件和组合物，例如Smith等人，“使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继性免疫疗法的人T细胞的离体扩增(Exvivo expansion of human T cellsfor adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement)”《临床和转化免疫学(Clinical&Translational Immunology)》(2015)4，e31；doi：10.1038/cti.2014.31.描述的那些。

在一方面，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过逆流离心淘析或经由PERCOLL^TM梯度离心，从外周血淋巴细胞分离T细胞。

在一个实施例中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防疾病的方法，所述干细胞可以产生经工程化以表达X-CAR或X-TCR和NF-κB刺激分子的免疫效应细胞，其中X表示本文所述的疾病相关抗原，并且其中引起疾病或疾病相关细胞表达所述X抗原。表9提供了不同抗原的列表和可以使用表达靶向这些抗原的CAR的免疫效应细胞预防、抑制或治疗的示例性疾病。

在另一个实施例中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述干细胞可以产生经工程化以表达本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的免疫效应细胞。在一个实施例中，NF-κB刺激分子是选择性NF-κB激活剂。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂，是非病毒NF-κB激活剂。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂，不是跨膜蛋白，并且在胞质溶胶中表达或优先存在于胞质溶胶中。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂是组成型活性的。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂不是组成型活性的。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂通过施用诱导剂(例如，二聚体)激活。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂是vFLIP K 13、NEMO-K277A或其衍生物。向患者施用表达CAR/NF-κB刺激分子的免疫效应细胞。在一方面，疾病相关细胞是癌细胞、被感染的细胞(例如，HIV-1感染的细胞)，或浆细胞或B细胞或T细胞。

在另一个实施例中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述干细胞可以产生经工程化以表达天然存在的免疫受体(例如，天然TCR)和NF-κB刺激分子的免疫效应细胞。在一个实施例中，NF-κB刺激分子是选择性NF-κB激活剂。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂，是非病毒NF-κB激活剂。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂，不是跨膜蛋白，并且在胞质溶胶中表达或优先存在于胞质溶胶中。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂是组成型活性的。在一个实施例中，NF-κB激活剂，例如选择性NF-κB激活剂不是组成型活性的。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂通过施用诱导剂(例如，二聚体)激活。在一个实施例中，选择性NF-κB激活剂是vFLIP K13、NEMO-K277A或其衍生物。向患者施用表达天然TCR和NF-κB刺激分子的免疫效应细胞。在一方面，疾病相关细胞是癌细胞、被感染的细胞(例如，HIV-1感染的细胞)，或浆细胞或B细胞或T细胞。

在另一个实施例中，本公开提供了通过向有需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞)或干细胞来治疗或预防癌症、感染、自身免疫或过敏性疾病的方法，所述干细胞可以产生经工程化以表达本公开的天然存在的(例如，天然TCR)或非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或重组TCR)和/或NF-κB刺激分子的免疫效应细胞。在一些实施例中，CAR-T或TCR-T细胞的活性可使用达沙替尼(Dasatinib)的水溶性盐来控制。

在另一方面，提供了治疗受试者的方法，例如，减轻或改善受试者的过度增殖性病症或病况(例如，癌症)，例如实体瘤、软组织肿瘤、血癌或转移性病变。

在又一个实施例中，本公开涉及治疗受试者的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用表达本公开的天然存在的和/或非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或重组TCR)和/或本公开的NF-κB刺激分子的细胞，从而治疗受试者的疾病。在一方面，该方法包括向受试者施用表达其内源(或天然)TCR和本公开的NF-κB刺激分子的细胞，从而在受试者中治疗疾病。在一方面，如本文所述与疾病相关抗原的表达相关的疾病是感染性疾病。在一方面，感染性疾病是与以下感染相关的疾病：HIV1、HIV2、HTLV1、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒8、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感病毒、MERS和SARS冠状病毒、克里米亚刚果出血热病毒、鼻病毒、肠病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒、RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、水痘病毒、单纯疱疹病毒1和2、水痘带状疱疹病毒、HIV-1、HTLV1、肝炎病毒、肠病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、尼帕和裂谷热病毒、日本脑炎病毒、结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌属、耶氏肺孢子虫、弓形体病、立克次氏体、诺卡氏菌、曲霉菌、毛霉菌或念珠菌。

在一些实施例中，非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)特异性结合HIV抗原。在一些实施例中，HIV抗原是HIV-1抗原。在一些实施例中，HIV抗原是HIV包膜蛋白或其一部分。在一些实施例中，HIV抗原是gp120或其一部分。在一些实施例中，HIV抗原是gp120上的CD4结合位点。在一些实施例中，HIV抗原是gp120上CD4诱导的结合位点。在一些实施例中，HIV抗原是gp120上的N-聚糖。在一些实施例中，HIV抗原是gp120的V2。在一些实施例中，HIV抗原是gp41上的膜近端区域。

本公开包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或产生T细胞的干细胞)被基因修饰以表达本公开的CAR或TCR和/或NF-κB刺激分子并将表达CAR的T细胞或干细胞注入有需要的接受者。本公开还包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或产生T细胞的干细胞)被基因修饰以表达NF-κB刺激分子并将这种细胞注入有需要的接受者。注入的细胞能够杀死接受者中疾病相关细胞(例如，肿瘤细胞或病毒感染的细胞)。与抗体疗法不同，NF-κB激活剂修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，干细胞)能够在体内复制，导致长期持续存在，这可以导致持续的肿瘤控制。在各个方面，在将T细胞或干细胞施用于患者之后，施用于患者的NF-κB激活剂修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或可产生T细胞的干细胞)或它们的后代在患者体内持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

本公开还包括一种类型的细胞疗法，其中，对能够产生免疫效应细胞(例如，T细胞)的干细胞(例如，造血干细胞或淋巴样干细胞或胚胎干细胞或诱导多能干细胞)进行修饰，以表达本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子，并将其施用于有需要的接受者。所施用的干细胞在移植入接受者后产生免疫效应细胞(例如，T细胞)，其(即免疫效应细胞)能够杀死接受者中疾病相关细胞。因此，在各个方面，在将T细胞或干细胞施用于患者之后，在施用表达CAR/NFκB激活剂的干细胞后患者体内产生的免疫效应细胞(例如，T细胞)在患者体内持续至少一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、五年、十年或二十年。本公开还包括一种类型的细胞疗法，其中能够产生免疫效应细胞(例如，T细胞)的干细胞被修饰以表达本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子，并在体外分化产生免疫效应细胞，将其注入有需要的接受者。注入接受者后注入的免疫效应细胞(例如，T细胞)能够杀死接受者中疾病相关细胞。因此，在各个方面，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞)在患者体内持续至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、五年、十年或二十年。

本公开包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或产生T细胞的干细胞)被基因修饰以表达靶向相同细胞中的两种或更多种不同抗原的CAR，并将这种T细胞或干细胞注入有需要的接受者。在一个实施例中，CAR中的至少一个靶向在造血细胞上表达的抗原。在一个实施例中，CAR中的至少一个靶向于选自由以下组成的群组中的抗原：CD19、CD20、CD22、BCMA、CS1、CD138、Lym1、Lym2、CD33和CD123。在一个实施例中，CAR中的至少一个靶向在造血细胞上表达的抗原，并且至少一个其他CAR靶向在实体瘤上表达的抗原。在一个实施例中，CAR中的至少一个靶向选自由以下组成的群组中的抗原：CD19、CD20、CD22、BCMA、CS1、CD138、Lym1、Lym2、CD33和CD123，并且至少一个其他CAR靶向选自由以下组成的群组中的抗原：间皮素、Heκ2、叶酸受体1、ROR1、IL13Ra2、AFP、WT1、Ras、NY-ESO-1、DLL3、CD70和PTK7。在一个实施例中，CAR中的至少一个是SIR。在一个实施例中，CAR中的至少一个是Ab-TCR。在一个实施例中，CAR中的至少一个是SIR，并且另一个CAR是CD3ε/γ/δTFP。在一个实施例中，CAR中的至少一个是Ab-TCR，并且另一个CAR是CD3ε/γ/δTFP。在一个实施例中，细胞具有天然TCR链中的至少一个的受损的表达。本公开还包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或产生T细胞的干细胞)经基因修饰以表达靶向两种不同抗原的CAR和NF-κB刺激分子，并将这种细胞注入有需要的接受者。在一个实施例中，细胞是自体的，而在其他实施例中，细胞是同种异体的。注入的细胞能够杀死接受者中疾病相关细胞(例如，肿瘤细胞或病毒感染的细胞)。

关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前，以下的至少一种在体外发生：i)细胞扩增，ii)将编码本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的核酸引入细胞，或iii)细胞的冷冻保存。

离体程序在本领域中是众所周知的，并且在下面进行更全面的讨论。简而言之，从哺乳动物(例如，人)中分离细胞，并用一种或多种表达本公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或本文公开的NF-κB刺激分子的载体进行基因修饰(即体外转导或转染)。可以将非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和NF-κB激活剂修饰的细胞施用于哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和NF-κB激活剂修饰的细胞对于接受者可以是自体的。可替代地，相对于接受者，细胞可以是同种异体、同基因或异基因的。

离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于通过引用并入本文的美国专利第5,199,942号，可应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，免疫效应细胞(例如，T细胞)的离体培养和扩增包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体中收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这种细胞。除了美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可用于细胞的培养和扩增。

通常，如本文所述激活和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。在某些方面，本公开的细胞用于治疗处于发展与本文所述的疾病相关抗原的表达相关的疾病、病症和病况的风险中的患者。因此，本公开提供了用于治疗或预防与如本文所述的疾病相关抗原的表达相关的疾病、病症和病况的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的CAR/TCR/NF-κB刺激分子修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞)或能够产生本公开的免疫效应细胞的干细胞。

在一方面，本公开的表达CAR/TCR/NF-κB刺激分子的细胞可用于治疗增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤，或者癌前状态如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。进一步地，与如本文所述的癌症相关抗原表达相关的疾病包括但不限于，例如，表达如本文所述的癌症相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前状态或增殖性疾病。与如本文所述的疾病相关抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于，例如自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性病症(过敏和哮喘)、感染性病况(例如，HIV1、CMV、EBV、流感)和移植。

本公开的CAR/TCR/NF-κB刺激分子修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞)可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。

血液学癌症或血癌病况是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症类型，如白血病、淋巴瘤和恶性淋巴组织增生病况。

白血病可以分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分为急性粒细胞白血病(AML)和急性淋巴性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性粒细胞白血病(CML)和慢性淋巴性白血病(CLL)。其他相关病况包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，是由骨髓血细胞的无效生产(或发育异常)和转化为AML的风险联合的血液学病况的多种集合。

淋巴瘤是从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

本公开提供了用于治疗和预防癌症的组合物和方法。在一方面，癌症是血液学癌症或血癌，包括但不限于白血病或淋巴瘤。在一方面，本公开的表达CAR/TCR/NFκB的细胞可用于治疗癌症和恶性肿瘤，如但不限于，例如急性白血病，包括但不限于例如急性B细胞淋巴性白血病(“BALL”)、急性T细胞淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病况包括但不限于，例如B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)等联合的血液学病况的多种集合。进一步地，与如本文所述的癌症相关抗原表达相关的疾病包括但不限于，例如，表达如本文所述的癌症相关抗原的非典型的和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前状态或增殖性疾病。

本公开提供了一种向受试者施用有效量的细胞，例如免疫效应细胞或其群的方法，每个细胞包含非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子，任选地与提高免疫细胞功效和/或安全性的试剂组合。在各种实施例中，增加免疫细胞的功效和/或安全性的试剂选自由以下组成的群组：(i)蛋白磷酸酶抑制剂；(ii)激酶抑制剂；(iii)细胞因子；(iv)免疫抑制分子的抑制剂；(v)降低T_REG细胞水平或活性的试剂；(vi)增加CAR/NF-κB刺激分子修饰细胞的增殖和/或持久性的试剂；(vii)趋化因子；(viii)增加CAR/TCR表达的试剂；(ix)允许调节CAR表达或活性的试剂；(x)允许控制修饰细胞的存活和/或持久性的试剂；(xi)控制修饰细胞副作用的试剂；(xii)Brd4抑制剂；(xiii)将治疗剂(例如，sHVEM)或预防剂递送至疾病部位的试剂；(xiv)增加针对CAR的靶抗原的表达的试剂；(xv)腺苷A2a受体拮抗剂；以及(xvi)(i)至(xv)的任何组合。

在一些实施例中，要治疗或预防的疾病是血液学癌症。在进一步的实施例中，血液学癌症是白血病。急性白血病的非限制性实例包括急性B细胞淋巴性白血病(“BALL”)、急性T细胞淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病况，包括但不限于，B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是由骨髓血细胞的无效生产(或发育异常)联合的血液学病况的多种集合，并且与本文所述肿瘤抗原的表达相关的疾病包括但不限于，表达如本文所述的肿瘤抗原的非典型的和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前状态或增殖性疾病；以及其任何组合。在另一个实施例中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。

在一些实施例中，与疾病相关的肿瘤抗原选自：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；***特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但在造血祖细胞上不表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；***干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；***酶；***酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成(bcr-ab1)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；***蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；***特异素；生存素；端粒酶；***癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳凝素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前***结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白；人***瘤病毒E6(HPV E6)；人***瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酸化的路易斯抗原)岩藻糖基GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGL11、ALK TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、VEGFR2/KDR、LewsAg、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、促卵泡素受体(FSHR)、绒毛膜***受体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、胍基环化酶C(GCC)、KSHV-K8.1蛋白、KSHV-gH蛋白、抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体、抗桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、紧密连接蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、粘连蛋白-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低电导氯离子通道以及TNT抗体识别的抗原。

在一些实施例中，待治疗的疾病是感染性疾病，包括但不限于被HIV1、HIV2、HTLV1、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒8、流感病毒、副流感病毒、禽流感病毒、MERS和SARS冠状病毒、克里米亚刚果出血热病毒、鼻病毒、肠病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒、RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、水痘病毒、单纯疱疹病毒1和2、水痘带状疱疹病毒、HIV-1、HTLV1、肝炎病毒、肠病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、尼帕和裂谷热病毒、日本脑炎病毒、结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌属、耶氏肺孢子虫、弓形体病、立克次氏体、诺卡氏菌、曲霉菌、毛霉菌或念珠菌感染。在这种疾病中，与疾病相关的靶抗原选自：HIV1包膜糖蛋白、HIV1-gag、HTLV1-tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)和GAD。

通过本公开的方法和组合物治疗或预防的疾病可以是免疫疾病或变性疾病，例如糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、寻常型天疱疮、强直性脊柱炎、桥本氏甲状腺炎、SLE、结节病、硬皮病、混合性***病、移植物抗宿主病或阿尔茨海默氏病。在这种实施例中，与疾病相关的靶抗原是自身抗体。

与靶抗原表达相关的疾病的进一步的非限制性实例包括以下癌症或相关病况中的任何一种：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移性病变。

在本文所述方法或用途的某些实施例中，将包含非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子分子的表达CAR/TCR的细胞与增加免疫效应细胞功效的试剂组合施用，所述试剂例如，蛋白质磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、趋化因子、scFV片段、双特异性抗体、免疫抑制分子的抑制剂；细胞信号传导蛋白、病毒信号传导蛋白或降低TREG细胞的水平或活性的试剂中的一种或多种。蛋白磷酸酶抑制剂的非限制性实例包括SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。激酶抑制剂的非限制性实例包括CDK4抑制剂、CDK4/6抑制剂(例如，帕博西尼(palbociclib))、BTK抑制剂(例如，依鲁替尼(ibrutinib)或RN-486)、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或依维莫司(everolimus)(RAD001))、MNK抑制剂或双重P13K/mTOR抑制剂。在一个实施例中，BTK抑制剂不降低或抑制白介素2诱导的激酶(ITK)的激酶活性。A2a受体拮抗剂的非限制性实例包括Vipadenant。在一些实施例中，抑制免疫抑制分子的试剂可以是抗体或抗体片段、抑制性核酸、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)或抑制抑制分子表达的锌指内切核酸酶(ZFN)中的一种或多种。在本文所述方法或用途的其他实施例中，降低TREG细胞的水平或活性的试剂选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗竭或其组合。在本文所述方法或用途的某些实施例中，免疫抑制分子选自由以下组成的群组：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。在其他实施例中，细胞因子选自IL2、IL-7、IL-15或IL-21或其任何组合。在其他实施例中，基本上同时或顺序地施用包含CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子的免疫效应细胞和第二种，例如，本文公开的任何组合疗法(例如，增加免疫效应细胞功效的试剂)。在一个实施例中，在施用包含CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子的细胞或细胞群的同时(例如，在同一天施用)或之后不久(例如，施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)将细胞因子施用于受试者。在其他实施例中，在施用细胞或细胞群后或在评估受试者对细胞的反应后，在延长的时间段(例如，至少2周、3周、4周、6周、8周、10周或更长)后，将细胞因子施用于受试者。

在其他实施例中，将表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的细胞与试剂组合施用，所述试剂改善与施用表达CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子的细胞有关的一种或多种副作用。与表达CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子的细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)、噬血细胞性淋巴组织增生综合征(HLH)或神经系统并发症。这种试剂的实例包括类固醇(例如***(prednisone)、***(dexamethasone))、IL6R拮抗剂(例如，托珠单抗(tocilizumab))、IL1R拮抗剂(例如，阿那白滞素(anakinra))、src激酶抑制剂(例如，达沙替尼(anakinra)或达沙替尼的水溶性盐)、激酶抑制剂(例如，依鲁替尼(Ibrutinib))、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，他克莫司或环孢霉素A)或化学疗法药物(例如，环磷酰胺、甲氨蝶呤或长春新碱)。

在一个实施例中，将表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的细胞与低免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合施用。尽管不希望受到理论的束缚，但据信低免疫增强剂量(例如，剂量不能完全抑制免疫系统，但足以改善免疫功能)的治疗伴随着PD-1阳性T细胞减少或PD-1阴性细胞增加。通过与表达PD-1配体例如PD-L1或PD-L2的细胞接合，可以耗竭PD-1阳性T细胞，而不是PD-1阴性T细胞。

本公开的药物组合物可以包含表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的细胞，例如，如本文所述的多个表达CAR/TCR和/或NF-κB刺激分子的细胞，与一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。这种组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开的组合物可以配制用于静脉内施用。所述组合物可以进一步包含第二活性剂(例如，抗癌剂、抗病毒剂或抗生素剂)。

本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将由如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性的因素来确定。当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”或“抗感染性”时，待施用的本公开的组合物的量可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异来确定，视情况而定。通常可以说，包含本文所述免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量施用，在一些情况下为10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》319：1676，1988)。

在某些方面，可能期望向受试者施用激活的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，然后接下来再次抽血(或进行单采术)，由其激活根据本公开的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并向患者重新注入这些激活和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。这一过程可以每几周执行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc抽取的血液中激活免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽取的血液中激活免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。

在一些实施例中，受试者可以经历白细胞去除术，其中离体收集、富集或耗竭白细胞，以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如T细胞。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增，并进行处理和/或转化，使得可以引入本公开的一种或多种构建体，从而产生共表达编码NF-κB激活剂的辅助模块的本公开的CAR-T或TCR-T细胞。随后，有需要的受试者可经历标准治疗与高剂量化疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时，受试者接受任选地共表达编码NF-κB激活剂的辅助模块的本公开的扩增的CAR-T细胞或TCR-T细胞的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

还提供了实施本公开的试剂盒。例如，用于治疗受试者的癌症或制造表达本文公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的细胞的试剂盒。试剂盒可包含至少一种编码非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的核酸分子或载体，和将核酸引入免疫效应细胞的方法。试剂盒可以包括病毒，所述病毒包含编码非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的核酸，以及增强病毒转导的化学品如聚凝胺。试剂盒可含有用于分离T细胞的组分，以用于表达非天然存在的免疫受体(例如CAR和/或TCR)。可替代地，试剂盒可含有表达非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)或干细胞。试剂盒中可以包括多于一种公开的非天然存在的免疫受体(例如，CAR和/或TCR)和/或NF-κB刺激分子。试剂盒可包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。

合适的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器典型地容纳组合物，所述组合物包括核酸分子、病毒、载体、T细胞等中的一种或多种。在若干实施例中，所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书表明所述组合物用于治疗特定病况。标签或包装说明书典型地将进一步包括在例如治疗或预防肿瘤或制备CAR-T细胞的方法中使用所公开的组分的说明。包装说明书典型地包括通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，所述说明含有关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。说明材料可以电子形式(如计算机软盘或光盘)书写，或者可以是可视的(如视频文件)。试剂盒还可以包括其他组分，以方便针对试剂盒设计的特定应用。因此，例如，试剂盒可另外含有用于测量T细胞上或T细胞中的CAR和/或NF-κB刺激分子的表达或确定表达CAR和/或NF-κB刺激分子的T细胞数量或百分比或测定细胞功能的工具。试剂盒可另外包括常规用于实施特定方法的缓冲液和其他试剂。这种试剂盒和合适的内容物是本领域技术人员众所周知的。

通过参考以下实验实例进一步描述本公开。提供这些实例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们不意图构成限制。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实例，而应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。

实例

表A提供了经工程化为表达荧光素酶(例如，GLuc或NLuc)以测量靶向不同细胞表面和细胞内抗原的不同构建体的细胞毒性的细胞系。这一实验中使用的细胞系、细胞系上的靶抗原以及其生长培养基显示在下表A中。将细胞在37℃下于5％CO₂湿润的培养箱中培养。这些细胞系获自ATCC、NIH AIDS试剂计划或在实验室可得。

表A：

用NFAT依赖的EGFP(或GFP)报告基因工程化的Jurkat细胞系(克隆E6-1)是加利福尼亚大学旧金山分校Arthur Weiss博士的礼物，并已被描述为研究CAR信号传导(Wu，CY等人，《科学》350：293-302，2015)。Jurkat细胞维持在补充有10％FBS、青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中。

编码针对MPL的嵌合抗原受体的慢病毒载体的产生

pLENTI-blast载体通过除去LacZ基因衍生自pLenti6v5gw_LacZ载体(英杰公司(Invitrogen)；赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))。pLenti-MP2是PantlisTsoulafs的礼物(Addgene质粒#36097)，并用来使用标准分子生物学技术用人EF1α启动子替换CMV启动子来产生pLenti-EF1a或pLenti-EF1α[SEQ ID NO：3837]慢病毒载体。pLenti-EF1a-DWPRE[SEQ ID NO：3838]通过缺失WPRE序列衍生自pLENTI-EF1α载体。从EF1α启动子删除内部Sac II片段，以产生EF1α(EF1a)-D-SACII-启动子(SEQ ID NO：3842)。psPAX2载体是Didier Trono的礼物(Addgene质粒#12260)。pLP/VSVG包膜质粒和293FT细胞获自英杰公司(赛默飞世尔科技)。逆转录病毒转移载体MSCVneo、MSCVhygro和MSCVpac以及包装载体pKAT从Robert Illaria博士的实验室获得。phRGTK海肾荧光素酶质粒来自普洛麦格(Promega)。

已经描述了含有嵌合抗原受体的具有BBz、CD28z和z-K13主链的载体的产生，GGS-NLuc融合蛋白的产生和用途，以及萤光素酶(例如，GLuc)报告基因细胞系的产生和用于使用Matador测定法测量细胞毒性的用途(PCT/US2017/024843、PCT/US2017/025602和PCT/US2017/052344)。

慢病毒和逆转录病毒载体

通过在293FT细胞中的基于磷酸钙的转染来产生慢病毒，基本上如先前所述(Matta H等人，《癌症生物学与治疗(Cancer biology and therapy)》2(2)：206-10.2003)。293FT细胞在含有10％FCS、4mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸和1mM MEM丙酮酸钠的DMEM(特此称为DMEM-10)中生长。为了产生慢病毒，将293FT细胞铺在于10cm组织培养板中的10ml不含抗生素的DMEM-10培养基中，使得在转染当天它们的汇合度将为大约80。第二天，通过磷酸钙转染法使用10μg编码不同基因的慢病毒表达质粒、7.5μg PSPAX2质粒和2μgPLP/VSVG质粒转染细胞。转染后约15至16小时，除去9ml培养基，并用5ml新鲜培养基替换。转染后约48小时，收集5ml上清液(第一次收集)，并用5ml新鲜培养基替换。转染后约72小时，收集所有培养基(第二次收集，通常约6ml)。合并收集的上清液，并以1000rpm离心1分钟，以除去所有细胞碎片和非粘附细胞。无细胞的上清液通过0.45μm注射器过滤器过滤。在一些情况下，通过在4℃下以18500rpm超速离心2小时进一步浓缩上清液。将病毒沉淀重新悬浮在XVIVO培养基中，为初始体积的1/10。所述病毒可以新鲜使用以感染靶细胞，或者可以等分试样冷冻保存在-80℃下。

T细胞和PBMC的感染

血沉棕黄层细胞是从洛杉矶儿童医院血库的健康身份不明的成年供体中获得的，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。PBMC可以以其本身使用，或者用于使用CD3磁性微珠(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))并按照制造商的说明分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重悬于补充有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(龙沙(Lonza))中。在37℃下于5％CO2湿润的培养箱中培养细胞。在用慢病毒载体感染之前，将细胞在上述培养基中激活1天。通常，在早晨使用旋转感染(1800rpm，在37℃下，90分钟)用300μl浓缩病毒(已在8μg/ml

(西格玛(Sigma)，目录号H9268)存在下重悬于XVIVO培养基中)感染原代细胞(例如，T细胞)。晚上更换培养基，并将感染再重复两天，总共3次感染。在第3次感染后，沉淀细胞，并重悬于补充有各自的抗生素(如果指出)的新鲜的含有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基中，并置于细胞培养瓶中用于选择，除非另有说明。如果不使用药物选择，则将细胞在上述培养基中培养10至15天，如果使用药物选择，则将细胞在上述培养基中培养20至30天。在用表达EGFP的慢病毒感染细胞的情况下，在无药物选择的情况下对其进行扩增或流式分选以富集表达EGFP的细胞。为了感染癌细胞系，用总体积为3ml的含

(西格玛，目录号H9268)的2ml未浓缩的病毒上清液感染大约500,000个细胞。然后，在第二天早晨，将细胞沉淀并重悬于含有各自抗生素的培养基中，并置于细胞培养瓶中进行选择。

基本上使用如上文关于上述慢病毒载体生产所述类似的程序来产生逆转录病毒载体，不同之处在于通常在10cm组织培养板中的10ml DMEM-10培养基中，使用10μg逆转录病毒构建体、4μg pKAT和2μg VSVG质粒转染293FT细胞。基本上如上文关于慢病毒载体所述，进行靶细胞的病毒收集和感染。

抗体和药物

博纳吐单抗(Blinatumomab)获自安进(Amgen)。洋地黄皂苷购自西格玛(目录号D141)，并在DMSO中制备100mg/ml的储备溶液。在PBS中制备1mg/ml的稀释储备溶液。除非另有说明，否则用于细胞裂解的洋地黄皂苷的终浓度为30μg/ml。

ELISA

使用安迪生物(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)和屋宇署生物科学(BDBiosciences)的市售ELISA试剂盒并按照制造商的建议，在已经与特异性靶细胞系共培养24至96小时的表达CAR的Jurkat-NFAT-GFP效应细胞或T细胞的细胞培养上清液中测量人IL2、IFNγ、IL6和TNFα。

用于检测CAR表达的FACS分析

小鼠抗人c-Myc APC-缀合的单克隆抗体(目录号IC3696A)来自安迪生物(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。生物素化蛋白L购自金斯瑞(GeneScript)(皮斯卡塔韦，新泽西州)，以1mg/ml在磷酸盐缓冲液(PBS)中重构并保存在4℃下。链霉亲和素APC(SA1005)购自赛默飞世尔科技。

为了使用Myc染色检测CAR，收集1×10⁶个细胞，并用3ml含4％牛血清白蛋白(BSA)洗涤缓冲液的冰冷1×PBS洗涤三次。洗涤后，将细胞重悬于含有10μl APC-缀合的Myc抗体的0.1ml的冰冷洗涤缓冲液中，并在黑暗中孵育1小时，然后用冰冷洗涤缓冲液洗涤两次。

为了使用蛋白质L染色检测CAR，收集1×10⁶个细胞，并用3ml含4％牛血清白蛋白(BSA)洗涤缓冲液的冰冷1×PBS洗涤三次。洗涤后，将细胞在4℃下重悬于含有1μg蛋白质L的0.1ml冰冷洗涤缓冲液中1小时。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞三次，然后在0.1ml洗涤缓冲液中与10μl的APC-缀合的链霉亲和素孵育(在黑暗中)30分钟，随后用冰冷洗涤缓冲液洗涤两次。使用屋宇署生物科学的FACSVerse分析仪完成FACS。

细胞死亡测定

为了测量细胞死亡，如PCT/US2017/052344“非放射性细胞毒性测定(ANon-Radioactive Cytotoxicity Assay)”中所述，利用基于Gluc、NLuc和其他荧光素酶的异位胞质表达的新颖测定。所述方法涉及报告基因以某一方式在靶细胞中表达，使其优先保留在健康细胞内，但从死亡和垂死的细胞中释放出来，或者可以优先在死亡和垂死的细胞中测量其活性。这一测定的优选报告基因是1)来自桡脚类动物如Gaussia princeps的非分泌形式的萤光素酶；2)来自深海虾如NanoLuc的工程化萤光素酶报告基因。若干这种示例性报告基因载体的序列以SEQ ID NO：3845至SEQ ID NO：3851提供。上述载体用于产生逆转录病毒和慢病毒，其依次用于产生稳定表达GLuc、NLuc或TurboLuc的若干靶细胞系的多克隆群体，随后用适当的抗生素选择。除非另有说明，否则将稳定表达不同荧光素酶的靶细胞一式三份铺在384孔板中的用于生长靶细胞的培养基中。悬浮生长的靶细胞通常以每孔2-3×10⁴的浓度铺板，而以贴壁单层生长的靶细胞以每孔1-2×10⁴的浓度铺板。除非另有说明，否则将靶细胞与经基因修饰的T细胞(即表达CAR的那些)以1∶1至10∶1的效应子：靶标(E∶T)比例共培养4小时至96小时。在靶细胞以贴壁细胞(例如，HeLa细胞)生长的情况下，允许它们在添加T细胞之前贴于孔的底部过夜。如下所述，通过直接注入含有天然腔肠素(Nanaolight)的0.5×CTZ测定缓冲液，通过由BioTek协同读板仪测量的荧光素酶活性的增加来测定T细胞介导的靶细胞裂解的诱导。

CTZ测定

通过将1mg冻干的CTZ粉末溶解在1.1ml的补充有30μl 6N HCl的100％甲醇中以避免CTZ随时间氧化，制备天然腔肠素的100X储备溶液(CTZ；Nanolight，目录号303)。为了制备CTZ测定缓冲液，将100X CTZ储备溶液在PBS中稀释至0.5X浓度。除非另有说明，否则将总体积15μl的CTZ测定缓冲液(如上制备)加入到含有表达非分泌形式的萤光素酶的细胞的384孔白板(葛莱娜(Greiner)，384孔白板，目录号781075)的每个孔中的约50至60μl体积的培养基中，并使用BioTek SynergyH4读板仪读取板的发光。对于96孔板，将细胞铺在200μl培养基中，并加入大约50μl 0.5X CTZ测定缓冲液。除非另有说明，否则将使用0.5X CTZ测定缓冲液来测定GLuc、TurboLuc16和MLuc7的活性。在一些实验中，CTZ测定缓冲液(稀释至0.125X浓度)也用于测量NLuc活性。通常，除非另有说明，否则加入的0.5X CTZ测定缓冲液的体积大约为含有细胞的孔中的液体体积的1/4，尽管当0.5X CTZ测定加入到含有1∶1体积细胞的培养基中时测定也起作用。在指示的情况下，使用仅含有培养基(Med)的孔中和其中靶细胞与未被任何CAR构建体(T-UI)感染的T细胞一起孵育的孔中的Gluc活性作为对照。

检测靶细胞上抗原表达和确定用于构建CAR和BiTes的各种抗原结合部分的抗原结合活性的测定

通过生物信息学方法结合使用抗原特异性抗体的免疫染色或如通过引用以其整体并入本文的PCT/US2017/025602中所述的高灵敏度抗原检测测定来确定靶细胞上抗原的表达。这一测定涉及将GLuc或NLuc报告基因片段融合至抗体、scFv、vHH或任何其他抗原结合片段或任何受体和配体的抗原结合结构域。将得到的融合蛋白与表达测试抗原的靶细胞一起孵育，并且通过添加腔肠素或荧光素酶报告基因的其他合适的底物来确定融合蛋白的结合。

CAR T细胞多样性池的产生

以上测定用于筛选在本发明的CAR的构建中使用的不同抗原结合模块(例如，scFv、vHH、受体、配体)，并且选择被发现显示出特异性结合活性的抗原结合模块来构建CAR。此外，还根据文献或我们实验室中的其已知活性选择了一些scFV片段。

取决于多种因素，不同的CAR或CAR的子集可能最适合于不同的疾病状况，所述因素包括但不限于引起疾病和疾病相关细胞上靶抗原表达的流行和水平、疾病负担和疾病进展速率。取决于它们的功效和毒性特征以及患者的状况，不同的CAR甚至可能最适合于不同患者的单一疾病状况。本公开提供了解决产生多种过继性免疫应答的重大技术和流程障碍的方案。

通过基因重排产生正常的TCR多样性。胸腺中严格的正向和负向选择过程确保只有表达αβTCR的T细胞(受限于在低亲和力范围内识别自身肽/MHC)才能分布在周围。因此，胸腺环境允许产生自限性但非自反应性的αβT细胞池。

从不同的抗原结合结构域产生CAR-T细胞的多样性池受到产生和测试多个抗原结合结构域的技术和财政障碍的限制。更重要的是，由于每个抗原结合结构域(例如，抗体的vL和vH片段)都有可能结合其他抗原并引起脱靶毒性，因此仅基于多个抗原结合结构域的CAR多样性池具有增加的中毒风险。因此，必须限制这种池的潜在多样性以减少脱靶毒性。本公开通过将单个或几个抗原结合结构域附接至TCR链、信号传导结构域和主链的不同变体而从单个或几个抗原结合结构域产生CAR多样性池，从而克服了这一问题。通过使用不同的接头，CAR池的多样性进一步增加。可以通过使用本公开中描述的不同的辅助模块来进一步增加表达池的T细胞的多样性。

这一CAR多样性池可用于提供针对表达所述抗原的引起疾病或疾病相关细胞的多样化免疫应答。可替代地，可以使用本领域已知的技术任选地对CAR多样性池进行DNA条形码编码，随后将其用于选择具有最佳生物学和临床特征的单个CAR或CAR亚组。这些特征可以包括但不限于体外生物学测定的性能(例如，细胞毒性、细胞因子分泌、结合亲和力、细胞表面表达、脱靶效应、T细胞增殖、耗竭标志物的表达和终末分化等)、体内测定的性能(例如，存活、肿瘤减少、T细胞持久性、T细胞扩增等)和临床经验(例如，疾病缓解、复发率、毒性等)。本公开的CAR可以单独使用或与本领域已知的其他CAR和其他天然和合成的免疫受体结合使用，以产生免疫效应细胞多样性池，从而预防和治疗由表达它们的靶抗原的细胞引起或与表达它们的靶抗原的细胞相关的各种疾病状况。

使用体外和体内选择来选择具有所需特性的CAR。使用TRAC gRNA和本领域已知的技术，将靶向CD19(SEQ ID NO：1594-1608、1016-1026、1900-1910)的CAR池靶向T细胞中的TRAC基因座。靶向载体还携带位于CAR***序列的终止密码子下游的DNA条形码。T细胞可以衍生自外周血。在可替代的实施例中，使用本领域已知的技术，使T细胞衍生自iPSC或造血干细胞的单个克隆。将表达CAR池的T细胞与RAJI细胞在体外共培养1至21天。在与靶细胞一起培养之前和在共培养之后的不同天收集CAR-T细胞池的等分试样。对样品进行下一代测序，以确定暴露于靶细胞后不同CAR的相对频率。使用生物信息学分析来确定与靶细胞共培养后与更好的增殖反应相关的CAR。基本上使用类似的方法来确定CAR，与死于肿瘤攻击的动物相比，所述CAR在体内赋予T细胞更高的增殖潜能和/或在体内长期持续和/或当针对它们在存活动物的起始T细胞群中的频率标准化时以更高的频率存在。在本公开的替代实施例中，基本上对人临床样品使用类似的方法以鉴定与不同特性和/或结果相关的CAR，所述特性和/或结果包括但不限于更好的长期存活、细胞因子释放综合征的更低发生率、更低的神经毒性和/或更高的长期持久性。随后可以单独或以各种组合使用这种CAR，以开发不同的CAR子池，其含有靶向相同或不同抗原结合结构域的CAR，具有用于治疗不同疾病状况和不同患者的不同特性。在其他实施方式中，CAR-T细胞暴露于它们的靶细胞系，然后基于如通过流式细胞术确定的细胞内IFNγ的程度分类成不同的组。通过下一代测序确定低对高IFNγ群中不同CAR的频率，并将其相对于在对照CAR-T细胞群，即未暴露于靶细胞系或暴露于不表达CAR靶的细胞系的CAR-T细胞中的频率标准化。通过这一分析，可以确定与不同水平的IFNγ产生相关的CAR。使用类似的方法筛选和选择具有任何或组合的期望性质或属性的CAR，所述性质或属性包括但不限于耗竭标志物的较低表达、终末分化标志物的较低表达和/或细胞毒性标志物的较高表达。

使用NEMO-突变体提供共刺激

已知小鼠NEMO-K270A(SEQ ID NO：992)组成型激活NF-κB。为了证明这一突变体向T细胞提供共刺激的能力，在补充有10ng/ml可溶性抗-CD3、10ng/ml可溶性抗-CD28和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(龙沙)中培养CD3+ve T细胞。将细胞在37℃下于5％CO₂湿润培养箱中培养，并在1天后感染表达EGFP的慢病毒载体(pLENTI-EGFP-杀稻瘟素)和表达小鼠NEMO-K270A突变体的慢病毒载体(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-杀稻瘟素和pLENTI-mNEMO-K270A-HA-杀稻瘟素)或小鼠NEMO-wt的慢病毒载体(pLENTI-mNEMO-FLAG-杀稻瘟素)。mNEMO-K270A和mNEMO-wt的序列分别以SEQ ID NO：992和991提供。感染后约1天，用杀稻瘟素选择细胞并定期计算细胞数。与用编码EGFP或小鼠NEMO-wt的慢病毒(pLENTI-mNMEO-FLAG-杀稻瘟素)感染的T细胞相比，用编码小鼠NEMO-K270A突变体的慢病毒(pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-杀稻瘟素和pLENTI-mNEMO-K270A-HA-杀稻瘟素)感染的T细胞显示增殖更剧烈。

人NEMO比小鼠NEMO长，并且人NEMO-K277A(hNEMO-K277A；SEQ ID NO：979)突变体对应于小鼠NEMO-K270A(mNEMO-K270A)突变体。为了测试hNEMO-K277A突变体是否也激活NF-κB，产生了编码这一突变体的表达载体(pCDNA3)。另外，产生了编码hNEMO的若干其他突变体的表达构建体，其中氨基酸残基277上的Lys(K)被不同的氨基酸残基替换(例如，K277Q、K277T、K277I、K277N、K277S、K277M、K277G、K277R)。将不同的构建体与NF-κB-荧光素酶报告基因构建体和RSV-LacZ(归一化对照)报告基因构建体一起转染在293FT细胞中，并使用前述测定测试其激活NF-κB的能力。图3显示了mNEMO-K270A、hNEMO-K277A对NF-κB的强激活和hNEMO-K277I和hNEMO-K277G突变体对NF-κB的弱激活。在类似的实验中，hNEMO-K277L和hNEMO-K277A-δV249-K255突变体在转染到293FT细胞时也显示出NF-κB激活。hNEMO-K277A-δV249-K255突变体缺少人NEMO的氨基酸残基V249-K255，并且还携带K277A突变。这些结果表明，通过突变小鼠NEMO K270残基和人NEMO K277残基，可以快速产生和鉴定NEMO的组成型活性突变体。可以使用类似的方法在其他NEMO残基处产生具有激活NF-κB能力的突变体。

产生了基于FMC63的CD19CAR CAR构建体，所述构建体与全长hNEMO-K277A或hNEMO-L753突变体(编码氨基酸1-251)共表达，并与N端FKBPx2二聚体结构域融合。将所述构建体与NF-κB-荧光素酶报告基因构建体和RSV-LacZ报告基因构建体一起转染到293FT细胞中。转染后大约8小时，不处理细胞或用AP20187(100nM)处理细胞。大约72小时后，如前所述制备细胞裂解物并分析NF-κB荧光素酶和LacZ活性。将NF-κB-Luc活性针对LacZ活性进行标准化，以控制转染效率的差异。结果表明，用AP20187处理导致在用共表达FKBPx2-hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1006)和FKBPx2-hNEMO-L753(SEQ ID NO：1007)的编码CAR的构建体转染的293FT细胞中NF-κB活性增加。这些结果证明了，通过与二聚合结构域融合的全长NEMO或其缺失突变体的共表达，接着添加二聚体，在CAR或TCR或嵌合TCR构建体中以诱导型方式激活NF-κB的能力。

用共表达FKBPx2-hNEMO-K277A或FKBPx2-hNEMO-L753的CD19导向的基于FMC63的第1代CAR感染J-N-G细胞。在没有和存在AP20187化合物的情况下，将细胞与RAJI靶细胞共培养，并显示诱导EGFP表达，证明了FKBPx2-hNEMO-K277A或FKBPx2-hNEMO-L753可以与CAR共表达而不干扰其活性。

除NEMO外，已知许多其他细胞蛋白组成型激活NF-κB，并可用于本发明的替代实施例中为过继性细胞疗法的目的向T细胞提供共刺激。示例性蛋白质包括TCL-1A(SEQ ID NO：1005)和IKKα/IKK1(IKK1-S176E-S180E；SEQ ID NO：1004)、IKKβ/IKK2(IKK2-S177E-S181E；SEQ ID NO：1002)和MYD88-L265P(SEQ ID NO：1000)的组成型活性突变体。在一个实施例中，在没有二聚体结构域的情况下，表达这些蛋白质，为过继性细胞疗法的目的向T细胞提供组成型共刺激。可以使用本领域已知的任何载体(例如，慢病毒、逆转录病毒、AAV或睡美人转座子载体)或非载体(DNA或RNA转染)方法在T细胞中表达这些蛋白质。可替代地，可以使用本领域已知的基因改变技术(例如，Cas9、Talons、Zn指核酸酶)通过改变其基因组拷贝来表达这些蛋白质。在一个示例性实施例中，使用本领域已知的技术，在T细胞中使用同源重组，将hNEMO的一个或多个基因组拷贝突变为hNEMO-K277A。

这些共刺激蛋白的表达可以通过使用本领域已知的诱导型启动子如Tet诱导型启动子或RheoGene系统表达它们来控制。在一个实施例中，将hNEMO-K277A突变体和hNEMO-K277A-δV249-K255克隆到pSLIK-Tet-On载体(Gopalakrinshnan等人，《临床癌症综述(Clinical Cancer Res)》；19(18)，2013)中，并将所得病毒用于感染T细胞。显示了用强力霉素处理T细胞可诱导hNEMO-K277A和hNEMO-K277A-δV249-K255表达以及NF-κB活性。NF-κB活性通过AlexaFlour缀合的Phospho-IκBα抗体和流式细胞术进行测量。

在本发明的替代实施例中，其他NF-κB激活蛋白或其信号传导结构域(例如，IKK1、IKK2、RIP等)被表达为与二聚体结构域融合，从而以诱导型方式向T细胞提供共刺激。本发明的这些组成型或诱导型NF-κB激活蛋白的用途不限于向T细胞提供共刺激，因为它们可用于向其他免疫细胞(例如，NK细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞等)提供共刺激，其中已知NF-κB激活增强其功能。由于已知NF-κB防止细胞凋亡并促进细胞存活，因此这些组成型和诱导型NF-κB激活蛋白也可以用于细胞工程中，以增强生物制品生产中所用细胞的存活率。在一个示例性实施例中，杂交瘤细胞被工程化为组成型表达hNEMO-K277A、hNEMO-K277A-δV249-K255(SEQ ID NO：7769)、K13、IKKα/IKK1(IKK1-SS/EE；SEQ ID NO：1004)、IKKβ/IKK2(IKK2-S177E-S181E；SEQ ID NO：1002)或MYD88-L265P(SEQ ID NO：1000)以增强它们的增殖和在高细胞密度下生长的能力。

用于T细胞过继性细胞疗法的NF-κB激活剂

血沉棕黄层细胞是从血库的健康身份不明的成人供体获得的，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。T细胞使用CD3微珠(美天旎(Miltenyi))分离，在补充有CD3/CD28 Dynabeads和50IU/ml重组IL2的XVIVO 15培养基中培养。可替代地，将T细胞重悬在补充有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(龙沙)中。

第二天，用pCCL3-MND3主链中CD19靶向的编码CAR(包括下一代CAR)的慢病毒载体感染T细胞。CAR的核酸序列以SEQ ID NO：1016-1029、1318-1331、1594-1604、1900-1913、2206-2219、2512-2525、2818-2831、3124-3127、3324-3327显示。另外，用对应于上述构建体但缺乏hNEMO-K277A模块的CAR构建体感染T细胞。对于每一次感染，通过在6孔板上以2800rpm，在32℃下进行旋转感染90分钟，用500μl编码不同CAR构建体的浓缩病毒和8μg/ml聚凝胺感染1800万个T细胞。将板在37℃下孵育6小时。收集细胞，离心除去病毒和聚凝胺，重悬在新鲜培养基中，并在37℃下培养过夜。

第二天，重复旋转感染，并将细胞转移至含有补充有CD3/CD28 Dynabeads、50IU/ml IL2和5％FBS的XVIVO 15培养基的T-75细胞培养瓶中。

扩增4天后，使用蛋白质L染色、CD19结合、细胞因子产生(IL2、IFNγ、TNFa)和细胞毒性(Matador测定)检查CAR-T细胞的CAR表达。

扩增10天后，将CAR/SIR-T细胞用于体内实验。为此，通过尾静脉注射向NSG小鼠注射10⁶个Nalm-6-Luc细胞。两天后，注入3×10⁶个CAR/SIR-T细胞。施用D-萤光素后，每周通过生物发光成像对小鼠进行成像，然后进行存活。

注意到，当暴露于RAJI细胞时，与具有BBz共刺激结构域的表达第2代CAR(SEQ IDNO：1594-1604)的T细胞相比，表达第一代CAR以及hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1594-1604)的T细胞显示通过ELISA测量的优异的IL2产生。此外，当与RAJI细胞共培养3周的时段时，与具有BBz共刺激结构域的表达第2代CAR(SEQ ID NO：1594-1604)的T细胞相比，表达第一代CAR以及hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1594-1604)的T细胞显示通过细胞增殖、细胞因子(IL2、IFNγ、TNFα)产生、耗竭标志物(例如，PD1)的表达和细胞毒性(Matador细胞毒性测定)测量的耗竭迹象减少。最终，当向异种移植有NALM-6-Luc细胞的NSG小鼠施用时，表达第一代CAR以及hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1594-1604)的T细胞显示由体内T细胞扩增和持久性、肿瘤生长减少和存活率改善确定的优异的体内活性。当暴露于RAJI细胞时，与表达第一代CAR并共表达vFLIP K13(即主链1；SEQ ID NO：1016-1029)的T细胞相比，表达第一代CAR以及hNEMO-K277A(主链2；SEQ ID NO：1594-1604)的T细胞通常显示较弱的细胞因子(例如，IL2、IFNγ和TNFα)产生。

与表达类似构建体但缺乏hNEMO-K277A模块的T细胞相比，表达hNEMO-K277A的表达对应于SEQ ID NO：1900-1913、2206-2219、2512-2525、2818-2831、3124-3127、3324-3327的CAR构建体的T细胞显示优异的体外和体内活性。hNEMO-K277A模块的共表达还显示了改善表达靶向CD20的SIR(SEQ ID NO：9683)的T细胞的体外和体内性能。这些结果表明证明了，hNEMO-K277A辅助模块的共表达不但增强了第一代CAR构建体的，还增强了TFP、Ab-TCR和SIR的体外活性(例如，增殖、细胞因子产生、耗竭的延迟)和体内活性(例如，改善的T细胞扩增和抗肿瘤活性)。

在含有相同主链但具有不同抗原结合结构域的不同构建体之间也注意到差异。因此，与基于FMC63(例如，SEQ ID NO：1594)、hu-FMC63-11(例如，SEQ ID NO：1595)、huFMC63-11-N203Q(例如，SEQ ID NO：1596)、Bu12(例如SEQ ID NO：1597)、CD19-MOR0028(例如，SEQID NO：1602)和CD19-hu-mROO5(例如，SEQ ID NO：1607)的含有衍生自scFv的抗原结合结构域的构建体相比，在含有衍生自4G7(例如，SEQ ID NO：1599)、huBly3(例如，SEQ ID NO：1604)和huSJ25C1(例如，SEQ ID NO：1605)的抗原结合结构域的共表达hNEMO-K277A(即主链2)构建体的第一代CAR构建体中，scFV通常较弱。基于它们的抗原结合结构域的性质，在CAR对其他主链的体外和体内活性中观察到类似的趋势。

在前面的实验中，使用单个载体在T细胞中将hNEMO-K277A模块与CAR模块共表达。重复所述实验，其中使用两个单独的慢病毒载体表达两个模块。以SEQ ID：9668表示编码缺乏hNEMO-K277A模块的示例性CD20 CAR的核酸构建体的SEQ ID。用两种慢病毒载体以5的感染复数感染T细胞，并且两种载体的比率(即CAR∶hNEMO-K277A)在1∶1至1∶10之间变化。扩增T细胞并在体外和体内测定中进行测试。hNEMO-K277A与CAR构建体的共表达显示改善了CAR-T细胞的体外和体内性能，如通过IL2产生、细胞增殖、缺乏衰竭、体内扩增和抗肿瘤活性的测定所确定。

在一个替代实施例中，使用本领域已知的基因编辑技术(例如，CRISP/Cas9、TALON、Zn指核酸酶等)的同源重组被用来在T细胞中的内源性人NEMO基因的一个或两个拷贝中诱导K277A突变。然后，将所得的携带hNEMO-K277A突变的T细胞用于过继性细胞疗法，包括表达靶向CD19的CAR构建体和靶向NY-ESO-1的TCR构建体。与缺乏hNEMO-K277A突变的对照T细胞相比，携带hNEMO-K277A突变的T细胞显示出增强的增殖、细胞因子产生、扩增、体内长期持久性和抗肿瘤活性。

通过使用CAR构建体重复前述段落所述的实验，其中hNEMO-K277A辅助模块被编码FKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(SEQ IDNO：1007)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(SEQ ID NO：1008)、IKK2-δ-SCD-FKBPv36x2(SEQ IDNO：7782)、IKK1-δ-SCD-FKBPv36x2(SEQ ID NO：7781)和FKBPx2-RIP-ID(SEQ ID NO：1009)的辅助模块替换。在没有和存在二聚体AP20187(100nM)的情况下，使用体外测定测试表达CAR和这些辅助模块的T细胞。暴露于表达靶抗原(即CD19)的RAJI细胞时，添加AP20187显示出诱导了表达FKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(SEQ ID NO：1007)、IKK2-δ-SCD-FKBPv36x2(SEQ ID NO：7782)、IKK1-δ-SCD-FKBPv36x2(SEQ ID NO：7781)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(SEQ ID NO：1008)和FKBPx2-RIP-ID(SEQ ID NO：1009)模块的CAR-T细胞的增殖和细胞因子产生。在体内实验中，NSG小鼠(每组n＝12)通过尾静脉注射异种移植200万个RAJI-Luc细胞，并且在3天后施用500万个表达CD19-CAR并共表达FKBPx2-hNEMO、FKBPx2-hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1006)、FKBPx2-hNEMO-L753(251)(SEQ ID NO：1007)、FKBPx2-hNEMO-L600(200)(SEQ ID NO：1008)和FKBPx2-RIP-ID(SEQ ID NO：1009)模块的T细胞。如前所述(Chinnery等人，《免疫学杂志(J Immunol)》2009；182：2738-2744)，每组一半的小鼠(n＝6)每天通过腹膜内注射施用40μg AP20187，共10天。施用AP20187显示出促进了CAR-T细胞的扩增。在一个替代实施例中，使用其中两个FKBP结构域都携带FKBP12V36突变的构建体重复所述实验，所述FKBP结构域以高亲和力与脂质可渗透的二聚配体利米度塞结合。融合蛋白的二聚通过施用利米度塞来实现。对于体外实验，利米度塞以10至100nM的终浓度使用。为了在NSG小鼠中进行体内研究，每周通过腹膜内(i.p)注射以5mg/kg施用利米度塞。

通过使用其中由编码hNEMO-K277A-δV249-K255、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MYD88-L265P、TCL-1A和MTCP-1的辅助模块替换hNEMO-K277A辅助模块的构建体，重复前述段落中描述的实验。与缺乏辅助模块的CAR-T细胞相比，表达hNEMO-K277A-δV249-K255、IKK2-S177E-S181E、IKK1-S176E-S180E、MYD88-L265P辅助模块的CAR-T细胞显示出增加了细胞因子产生、增殖、体内扩增和抗肿瘤活性。表达TCL-1A和MTCP-1辅助模块的CAR-T细胞显示出增加了增殖反应。

人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E在疫苗接种中的用途

产生表达人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV 249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E的慢病毒载体。还产生表达鸡卵清蛋白氨基酸残基242-353和主要组织相容性复合物(MHC)II类不变链(Ii-OVA)的C端的慢病毒载体，如Rowe HM等人，《分子疗法》13，2，2006所述。最后，产生共表达编码人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A或IKK2-S177E-S181E的盒与编码Ii-OVA的盒的慢病毒载体，其中两个盒由2A切割序列分开。

转导DC和流式细胞术。如先前所述制备鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。如(RoweHM等人，《分子疗法》，13，2，2006)所述的，用慢病毒载体在第4天以20的MOI转导未成熟的DC，并每4天给予含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(50ng/ml；来自派普泰克(Peprotech))的新鲜培养基。转导后第5天，收集DC，洗涤并封闭Fc受体，然后用以下生物素缀合的Abs对成熟标志物进行表面染色：抗CD11c、抗CD86和抗I-Ab(MHC II类)(全部来自BDPharmingen)；抗CD40(来自Serotec)；和抗CD80、抗ICAM-1和抗Kb(MHC I类)(全部来自eBioscience)。仓鼠同种型对照Ab(缀合生物素)购自BD Pharmingen。然后，在流式细胞术之前用链霉亲和素RPE Cy-5 2o试剂(DakoCytomation)标记抗体。将脂多糖(LPS)(50ng/ml)(西格玛)添加到未转导的DC中，放置过夜以作为成熟的阳性对照。酵母聚糖A(10μg/ml)处理(在37℃下持续30分钟)用作ERK激活的对照。

ELISA。从以5×10⁵个细胞/孔(在1.5ml中)铺板的DC收集培养上清液。根据制造商的指南，使用eBioscience的试剂盒，通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12p70和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

从***中纯化DC。在C57/BL6小鼠(Harlan)的尾巴底部皮下(s.c.)注射1×10⁸感染单位(i.u.)慢病毒载体。六天后，收获(合并每组小鼠的细胞)***(主动脉旁和腹股沟)，与胶原酶CLS-4(沃辛顿(Worthington))一起孵育，并捣碎以获得单细胞悬液。阻断Fc受体，然后使用MACS珠(美天旎生物技术)选择CD11c阳性细胞。

五聚体染色将每个样品一百万个脾细胞与10μl藻红蛋白缀合的SIINFEKL/Kb五聚体或四聚体(Proimmune)在室温下孵育12分钟。然后，洗涤细胞，并在冰上与生物素缀合的抗CD8(Serotec)一起孵育15分钟，然后洗涤并与链霉亲和素-别藻蓝蛋白(eBioscience)一起孵育15分钟。使用Cell-Quest软件(屋宇署生物科学)在BD LSR机器上洗涤并采集样品。

细胞内细胞因子染色。将脾细胞与或不与OVA257-264肽一起孵育过夜。加入莫能菌素溶液(eBiosciences；终浓度为2μM)，放置3小时，然后对CD8进行表面染色。然后使用屋宇署生物科学的Cytofix/Cytoperm试剂盒将细胞固定并透化。然后加入与别藻蓝蛋白缀合的抗γ干扰素(抗IFN-γ)抗体(BD Pharmingen)，放置30分钟，然后洗涤细胞，并在BD LSR机器上运行样品。

ELISPOT测定。将酶联免疫斑点(ELISPOT)板(密理博(Millipore))在4℃用纯化的抗IFN-γ(BD Pharmingen)包被过夜。使用含或不含I类OVA257-264肽(Proimmune)的总脾细胞的连续稀释液(一式三份)进行离体ELISPOT测定。根据制造商的指示，将板培养过夜并进行显影。使用AID ELISPOT计数器和软件对斑点进行计数。

肿瘤疗法。使EG7.OVA肿瘤细胞在RPMI加0.4mg/ml G418(英杰公司)中生长。用皮下注射到胁腹的2×10⁶个肿瘤细胞攻击C57BL/6小鼠，然后接种疫苗。一旦动物具有达到＞15mm直径的肿瘤，它们就被杀死。

用编码人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E的慢病毒载体单独或与Ii-OVA组合感染小鼠BM衍生的树突状细胞(DC)。人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E的表达显示导致了p65(RelA)在DC核中的核转运水平与LPS处理的DC相似，但与细胞质p65水平较高的未处理或对照载体DC不相似。在人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E-转导的DC中也检测到核NF-κB结合活性的增加，但对MAPK途径的激活没有影响，如通过核AP1结合活性所测定。

用人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E转导BM衍生的DC后，分析转导或未转导细胞上的成熟标志物。与对照载体组中的转导DC相比，CD86、CD40、ICAM-1和CD80在表达人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E的DC上被上调。此外，人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E{2-转导的DC显示出在培养物中保持它们的上调CD86若干周。发现，IL-12p70和TNF-α的分泌在用人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E转导的DC培养物中上调。

在皮下慢病毒载体注射后，在引流***中检测到转导的DC。在皮下注射后，用对照或人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E载体转导相似百分比的***DC(CD11c⁺/MHC II⁺类)。然而，与对照载体注射的动物相比，人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E注射的动物中DC上的CD86上调。

检测了编码人NEMO-K277A-2A-Ii-OVA、人NEMO-K277A-δV249-K255-2A-Ii-OVA、小鼠NEMO-K270A-2A-Ii-OVA、IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA和Ii-OVA的载体在皮下接种疫苗后在小鼠中诱导Ova特异性CD8⁺T-细胞应答的能力。使用5×10⁵i.u.的载体剂量。人NEMO-K277A-2A-Ii-OVA、人NEMO-K277A-δV249-K255-2A-Ii-OVA、小鼠NEMO-K270A-2A-Ii-OVA和IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA接种疫苗的小鼠显示出SIINFEKL/K^b五聚体阳性CD8⁺T细胞和IFN-γ-分泌性CD8⁺T细胞，如通过细胞内荧光激活细胞分选或ELISPOT测定所测量。

用致死剂量的EG7.OVA肿瘤细胞接种小鼠，然后用转导的DC或用人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E-载体直接为它们接种疫苗。所有小鼠显示发展肿瘤。在转导DC注射或直接慢病毒载体注射后，人NEMO-K277A-、人NEMO-K277A-δV249-K255-、小鼠NEMO-K270A-和IKK2-S177E-S181E-组中的无肿瘤小鼠数量高于对照组。在寄生虫保护模型中使用表达杜氏利什曼原虫(L.donovani)的卵白蛋白测试NEMO-K277A-2A-Ii-OVA、人NEMO-K277A-δV249-K255-2A-Ii-OVA、小鼠NEMO-K270A-2A-Ii-OVA、IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA载体的功效(Polley R等人，《感染免疫学(Infect.Immun.)》74：773-776，2016)。

人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E在疫苗接种中的用途

用编码人NEMO-K277A、人NEMO-K277A-δV249-K255、小鼠NEMO-K270A和IKK2-S177E-S181E的腺病毒载体转导在单个白细胞分离术中收集的抗原呈递细胞，然后与含有人***特异性膜抗原的细胞外结构域的蛋白PA001一起孵育。使在≤1先前化疗方案后具有进行性mCRPC的男性入组，以评估每2至4周皮内注射的三个剂量的产生的疫苗(4×10⁶、12.5×10⁶和25×10⁶个细胞)。没有剂量限制的毒性。随着PSA下降，观察到免疫上调以及抗肿瘤活性。

基于161抗体衍生的scFv片段的人源化MPL CAR的构建和测试

鼠单克隆抗体161靶向人MPL(血小板生成素受体或TPO-R)。为了产生靶向MPL但免疫原性降低的CAR，将包含鼠161抗体的抗原结合结构域的scFV片段的序列人源化。将命名为hu-161-2的人源化的161scFv片段(SEQ ID NO：891)克隆到含有41BB共刺激结构域和CD3z激活结构域(SEQ ID NO：1582)的第2代CAR主链中。用编码人源化MPL-hu-161-2 CAR构建体的慢病毒稳定转导Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)细胞。随后将亲本和表达CAR的Jurkats与HEL细胞共培养，并在4小时后通过FACS分析监测EGFP表达的诱导。与未暴露于HEL细胞的细胞相比，表达MPL-hu-161-2 CAR构建体的Jurkat细胞与HEL细胞的共培养导致EGFP表达增加，表明人源化MPL-hu-161-2 CAR构建体识别靶抗原并激活信号传导的能力。当使用合并hu-161-2 scFV并共表达vFLIP K13(SEQ ID NO：1286)或hNEMO-K277A突变体(SEQ IDNO：1878)的第一代CAR重复实验时，获得了基本相似的结果。

基于源自175和111抗体的scFv片段的人源化MPL CAR的构建和测试

鼠单克隆抗体175和111也结合人MPL。因此，包含这些抗体的抗原结合结构域的scFV片段的序列被人源化，并用于制备共表达vFLIP K13(SEQ ID NO：1287、1288)和hNEMO-K277A(SEQ ID NO：1896和1897)的相应的第2代CAR(CAR II)构建体(SEQ ID NO：1583和1584)以及主链1和2。如前面的实例一样重复所述实验。与未暴露于HEL细胞的细胞相比，表达MPL-hu-175-2和hu-111-2 CAR构建体的Jurkat细胞与HEL细胞的共培养导致EGFP表达增加，表明了人源化MPL-hu-175-2和hu-111-2 CAR构建体识别靶抗原并激活信号传导的能力。

靶向CD70的CAR的构建和测试

构建了许多靶向CD70的构建体(SEQ ID NO：9781-10086；和7783-7789)。所述构建体在J-N-G和T细胞中表达，并使用体外和体内测定测试对表达CD70的靶细胞系RAJI和THP-1的T细胞激活和细胞毒性。

靶向在白血病细胞上表达的CD70、PTK7、κ轻链、紧密连接蛋白18A2、Ras/HLA-A2复合物、NY-ESO/HLA-A2复合物、Streptag和CD43表位的CAR的构建和测试。

在共表达vFLIP K13或hNEMO-K277A的第2代主链(例如，常规CAR II)或主链1和2上产生靶向在白血病细胞上表达的PTK7、κ轻链、紧密连接蛋白18A2、Ras/HLA-A2复合物、NY-ESO/HLA-A2复合物、Streptag和CD43表位的CAR构建体。按照前面的实例重复所述实验。与未暴露于靶细胞的细胞相比，表达不同CAR构建体的Jurkat细胞与它们各自的靶细胞的共培养导致EGFP表达增加。类似地，表达不同的CAR构建体的T细胞与它们各自的表达GLuc的靶细胞的共培养导致细胞死亡增加，如通过GLuc活性的增加所测量。

靶向MPL的TFP

基于hu-161-2 scFV作为抗原结合结构域，构建了靶向MPL的若干基于TFP的CAR。这些TFP CAR构建体的序列以SEQ ID NO：3526至3533示出。用编码靶向MPL的TFP CAR的慢病毒转导Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)细胞，并用嘌呤霉素进行选择。表达靶向MPL的TFP CAR的J-N-G细胞在与HEL.92.1.7(HEL)细胞共培养4小时后显示出诱导EGFP表达。靶向MPL的TFP CAR也表达于原代T细胞中，并在共培养4小时后测试其诱导HEL-GLuc细胞裂解的能力。如上针对基于hu-161-2的TFP CAR所述，使用J-N-G和原代T细胞，类似地构建和测试基于175、111、hu-175-2和hu-111-2scFv(SEQ ID NO：10476-10483)的MPL TFP CAR构建体。J

靶向其他抗原的TFP

接下来，构建了靶向多种不同抗原的TFP CAR。为了提供共刺激，构建体还共表达hNEMO-K277A。构建体在J-N-G和原代T细胞中表达，并使用上述测定测试其识别表达其靶抗原的细胞的能力。表达TFP CAR的J-N-G细胞在与表达其同源抗原的靶细胞共培养时显示出诱导EGFP表达。使用上述基于GLuc的细胞毒性测定，表达这些靶向不同抗原的TFP CAR的T细胞显示出诱导表达相应抗原的靶细胞的细胞毒性。表A显示了在测定中使用的表达不同靶抗原的靶细胞系。表达不同靶抗原的其他细胞系是本领域已知的，或者可以通过本领域已知的技术进行基因工程化以表达期望抗原。在以上实例中，TFP构建体含有辅助模块，所述辅助模块共表达hNEMO-K277A突变体以提供共刺激。在替代实施例中，还构建了TFP构建体，其缺乏提供共刺激的辅助模块或含有通过共表达其他蛋白质(如vFLIP K13)提供共刺激的辅助模块。如上所述，通过在J-N-G和原代T细胞中表达TFP构建体来重复实验，结果相似。

靶向MPL的Ab-TCR

基于鼠161scFV作为抗原结合结构域，构建了若干靶向MPL的Ab-TCR。为了改善基于TCRα和TCRβ的Ab-TCR的表达，将特定的突变引入其TCR受体模块中。含有Ab-TCR构建体的TCRγ/TCRd，野生型TCRα/TCRβ(标记为wt-op2)和突变体TCRα/TCRβ(标记为SDVP-IAH)的序列以SEQ ID NO：959至964示出。用编码靶向MPL的Ab-TCR的慢病毒(SEQ ID NO：2091、2397、2703)转导Jurkat-NFAT-EGFP(J-N-G)细胞，并用嘌呤霉素进行选择。表达靶向MPL的Ab-TCR的J-N-G细胞在与HEL细胞共培养4小时后显示出诱导EGFP表达，证明了靶向MPL的Ab-TCR识别MPL和激活信号传导的能力。靶向MPL的Ab-TCR也在原代T细胞中表达，并在共培养4小时后测试其诱导HEL-GLuc细胞裂解的能力。表达MPL Ab-TCR的T细胞显示出诱导HEL-GLuc细胞裂解，如通过GLuc活性的增加所测量。如上针对基于161的Ab-TCR所述，使用J-N-G和原代T细胞类似地构建和测试基于鼠175和111scFv的MPLAb-TCR构建体(SEQ ID NO：10492-10493)。

靶向其他抗原的Ab-TCRs

接下来，构建了靶向多种不同抗原的Ab-TCR。为了提供共刺激，构建体还共表达hNEMO-K277A。所述构建体在J-N-G和原代T细胞中表达，并使用上述测定测试其识别表达其靶抗原的细胞的能力。与表达其同源抗原的靶细胞共培养后，表达Ab-TCR的J-N-G细胞显示出诱导EGFP表达。使用上述基于GLuc的细胞毒性测定，表达这些靶向不同抗原的Ab-TCR的T细胞显示出诱导表达相应抗原的靶细胞的细胞毒性。表A显示了在测定中使用的表达不同靶抗原的靶细胞系。表达不同靶抗原的其他细胞系是本领域已知的，或者可以通过本领域已知的技术进行基因工程化以表达期望抗原。在以上实例中，Ab-TCR构建体含有辅助模块，所述辅助模块共表达hNEMO-K277A突变体以提供共刺激。在替代实施例中，还构建了缺少辅助模块以提供共刺激或含有通过其他蛋白如vFLIP K13的共表达提供共刺激的辅助模块的Ab-TCR构建体。如上所述，通过在J-N-G和原代T细胞中表达Ab-TCR构建体来重复实验，结果相似。

流式细胞术用于转导的CD8+T淋巴细胞响应于HIV-1感染靶细胞的CAR介导的增殖

产生了许多靶向HIV1包膜糖蛋白的CAR，并由SEQ ID NO：8704-9349表示。用以下测定来体外测试其抗HIV1活性。活性构建体单独或组合用于治疗HIV1和AIDS患者。

HIV-1感染的T2细胞，由于加工相关转运体(TAP)缺失具有低MHC I类(Salter等人(1986)《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》5：943-949)，并且以前显示是合适的HIV-1特异性CAR的靶细胞(Severino等人(2003)《病毒学(Virology)》306：371-375)，用作靶细胞。这些被过量的在vpr基因座中含有鼠CD24(mCD24)的基因的基于HIV-1NL4-3的报告基因病毒感染(Ali等人(2003)《病毒方法杂志(J Virol Methods)》110：137-142)以在感染后3或4天产生＞90％的感染细胞，如先前所述(Bennett等人(2007)《病毒学杂志》81：4973-4980；Yang等人(1996)《病毒学杂志》70：5799-5806；以及Yang等人(1997)《病毒学杂志》71：3120-3128)在使用前即可在铯辐照器中以10,000rads辐照这些，并以3,000rads辐照来自健康供体的外周血单核细胞(饲养PBMC)。按照制造商的指导，用CellTrace Violet标记HIV1-CAR转导的原代CD8+T淋巴细胞，并进行洗涤(赛默飞世尔科技，格兰德岛，纽约)。在48孔板孔中，将5×10⁵个标记的转导的细胞添加到5×10⁵个辐照的感染的T2细胞和2×10⁶个辐照的饲养PBMC中，并在1ml R10-50中培养五天，三天后更换培养基。然后对人CD8(PerCP-抗人CD8，目录号30130，Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚)进行流式细胞术(LSR Fortessa II细胞计数器，屋宇署生物科学)和共染色，并使用FlowJo软件(FlowJo，阿什兰，俄勒冈州)分析增殖。当暴露于HIV-1感染的T2细胞时，HIV1-CAR转导的T细胞显示出增殖。

病毒抑制测定

测试了HIV1-CAR转导的CD8+T淋巴细胞以及其扩增和富集的克隆抑制HIV-1复制的能力，如先前所述(Yang等人(1997)《美国科学院院报(PNAS USA)》94：11478-11483；和Yang等人(1997)《病毒学杂志)》71：3120-3128)从NIH AIDS参考和试剂获得测试的HIV-1毒株，包括94US_3393 IN(目录号11250)、90JJS873(目录号11251)、96TH_NP1538(目录号11252)、00TZ_A246(目录号11256)。简而言之，以大量的0.1个组织培养感染剂量/细胞感染用人CCR5转导的T1细胞，并与HIV1 CAR转导的细胞在96孔板中以5×10⁴至1.25×10⁴个细胞的比例(分别在200μl Rl 0-50中，或作为对照的无效应细胞的培养基中)共培养。确认＞90％的效应细胞被转导。每种条件一式三份运行，并使用p24定量ELISA(XpressBio，弗雷德里克，马里兰州)监测病毒复制。暴露于HIV 1 CAR细胞显示出导致HIV 1抑制，如通过p24ELISA测量。

还测试了表达HIV1-CAR的效应细胞对感染的CD4+细胞的抗病毒活性。T2-CCR5细胞被一组包括主要R5嗜性分离株的HIV-1菌株感染，并在没有或存在HIV1-CAR转导的效应细胞的情况下进行培养。通过在培养的第7天至第10天之间测量p24抗原来评估病毒复制。复制抑制被计算为无效应细胞与有效应细胞的培养之间p24的log 10单位的差异，然后将其标准化为与无效应细胞的总复制的比率。

CAR-介导的HIV-1感染靶细胞杀伤的铬释放杀伤测定

在Matador测定中或使用标准的⁵¹Cr-释放测定，将如上所述感染有HIV-1菌株NL4-3的T2-GLuc细胞用作HIV1-CAR转导的原代CD8+T淋巴细胞的靶细胞，如前所述(Bennett等人(2007)《病毒学杂志》81：4973-4980；Yang等人(1996)《病毒学杂志》70：5799-5806；以及Bennett等人(2010)《艾滋病(Aids)》24：2619-2628)。简而言之，将感染的和对照未感染的T2细胞进行51Cr-标记1小时，并在96孔U型底板中以不同的细胞比例在有或没有效应CD8+T淋巴细胞的情况下孵育4小时。然后收获上清液，以在96孔板中通过micro204-闪烁计数来测量细胞外51Cr。在没有效应细胞的靶细胞上测量自发释放，并在用2.5％Triton X-100裂解的靶细胞上测量最大释放。特定裂解计算为：(实验释放的铬-自发释放)÷(最大释放-自发释放)。

靶向MPL的双特异性抗体

可以使用双特异性抗体(如双特异性T细胞衔接子(BiTE)和双亲性重靶向(DART))将T细胞重靶向表达特定抗原的靶细胞。

构建基于双特异性T细胞衔接子的靶向MPL的基于161的scFV作为抗原结合结构域。这一双特异性构建体的序列以SEQ ID NO：3736示出。双特异性构建体含有GGGSG-Streptagx2-Tag接头(SEQ ID NO：287)，但是可以使用替代接头(例如，SGGGS)。

将双特异性构建体转染到293FT细胞中，并在48至96小时后收集含有融合蛋白的上清液。与仅与双特异性融合蛋白或仅与T细胞一起培养的细胞相比，在MPL-161双特异性融合蛋白的存在下与T细胞一起培养的HEL-GLuc细胞显示出经历了细胞裂解，如通过GLuc测定所测定。

接下来构建编码基于175、111、hu-161-2、hu-175-2和hu-111 scFv的构建体的双特异性抗体，并发现它们在HEL-GLuc细胞毒性测定中具有活性。最后，类似地构建了靶向多种其他抗原的双特异性抗体，包括PTK7、DLL3、TROP2、CD179a、CD179b、CD23、LAMP1、CDH1、CDH17、CD32、CDH19、HIV1-gp120包膜糖蛋白等，并且发现与表达它们的同源抗原的靶细胞系共培养时具有活性。

图4靶向MPL和使用161-scFv靶向结构域的双特异性T细胞衔接子的活性。将HEL-pLenti-hGluc和T细胞分别与以下上清液在4℃预孵育2小时：单独的培养基和pLenti-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02(042517-P02-SC)。孵育后，将细胞在U型底96孔板中以1∶1或5∶1的E∶T比在37℃下共培养4小时。将50μl细胞+上清液/孔转移至384孔板，一式三份。使用15ul CTZ测定缓冲液(1∶100)进行hGLuc测定。

TFP在缺乏TCRα和TCRβ表达的Jurkat细胞中的表达和活性。

Jurkat-NFAT-GFP(J-N-G)细胞(T细胞淋巴瘤)被慢病毒载体感染，所述慢病毒载体表达靶向TCRα和TCRβ1/β2恒定链的gRNA，并共表达酿脓链球菌Cas9。TCRα链的示例性gRNA靶序列以SEQ ID NO：7754和7755给出。TCRβ1/β2链的示例性gRNA靶序列以SEQ ID NO：7756-7758给出。在一个替代实施例中，使用gRNA和TALON靶向TCRα和TCRβ1/β2恒定链基因座，如Knipping F等人，《分子疗法：方法与临床开发》卷4，2017所述。缺乏TCRα或TCRβ1/β2链表达的J-N-G细胞通过使用针对TCR/CD3复合物的抗体进行细胞分选来纯化。在EF1α启动子下表达针对人MPL的TFP的慢病毒载体(SEQ ID NO：2184、2490、2796)被用于感染亲本J-N-G细胞(对照)和缺乏TCRα或TCRβ1/β2表达的那些。通过用蛋白质L染色免疫染色并通过用MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5融合蛋白(SEQ ID NO：4923)染色来确定TFP在细胞中的表达。J-N-G亲本细胞在细胞表面上显示出强健的TFP表达，而缺乏TCRα或TCRβ1/β2链的J-N-G细胞显示出TFP表达差至缺失。将不同的J-N-G细胞群暴露于HEL.92.1.7靶细胞24小时，并检查NFAT启动子驱动的GFP表达和IL2产生的增加。与HEL.92.1.7细胞共培养后，表达MPL特异性TFP的J-N-G亲本细胞显示出GFP荧光和IL2分泌显著增加。相反，缺少TCRα或TCRβ1/β2链的表达MPL特异性TFP的J-N-G细胞显示出弱至无GFP诱导和IL2分泌。当在表达靶向CD19(SEQID NO：1913、2219、2525)、CD20(SEQ ID NO：1945、2251、2557)和CD22(SEQ ID NO：1950、2256、2562)的TFP后并与RAJI和Nalm6靶细胞共培养后，使用J-N-G亲本和TCRα-或TCRβ1/β2缺陷细胞重复实验时，可获得基本相似的结果。

接下来，使用在EF1α启动子下表达密码子优化的TCRα恒定链(IgSP-[hTRAC-opt2]；SEQ ID NO：1010)或TCRβ恒定链(IgSP-[hTRBC-opt2]；SEQ ID NO：1011)的慢病毒载体感染不同的J-N-G细胞群。在与HEL.92.1.7靶细胞共培养后，TCRα恒定链在其中TCRα链已被gRNA介导的基因敲除所破坏的表达MPL特异性TFP的J-N-G细胞中表达导致TFP在细胞表面的表达增加，并诱导GFP表达和IL2分泌。类似地，与HEL.92.1.7靶细胞共培养后，TCRβ恒定链在其中TCRβ1/β2链已被gRNA介导的基因敲除所破坏的表达MPL特异性TFP的J-N-G细胞中表达导致TFP在细胞表面的表达增加，并诱导GFP表达和IL2分泌。

Ab-TCR和cTCR/SIR在缺乏TCRα和TCRβ表达的Jurkat细胞中的表达和活性。

除了使用编码靶向人CD19的Ab-TCR和SIR的表达盒代替靶向CD19的TFP之外，重复上述实验。靶向CD19的Ab-TCR由SEQ ID NO：3124表示。靶向CD19的cTCR/SIR由SEQ ID NO：3878-3880表示。与在亲本J-N-G细胞中的表达相比，在缺乏TCRα或TCRβ1/β2表达的J-N-G细胞中的Ab-TCR、cTCR和SIR的表达显示出增加了表达和活性。

表达本公开的CAR、TFP和Ab-TCR的同种异体和非专门设计的T细胞

通过使用TALON、CRISP/Cas9或其他核酸酶减少或消除内源性TCRα和/或TCRβ链的表达，可以产生同种异体或非专门设计的CAR-T细胞。

将MPL特异性TFP盒(SEQ ID No：3527、3529、3531)克隆到靶向构建体中，所述构建体设计用于靶向TRAC基因组位点，并含有衍生自TRAC基因组序列的左右同源臂。在TFP的终止密码子的下游***聚腺苷酸化序列。靶向构建体和靶向策略的示意图显示在图5A中。靶向构建体的序列以SEQ ID NO：3858、7773和7776提供。将靶向构建体克隆到整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)和腺相关病毒(AAV)载体中。使用本领域已知技术中所述的CRISP/Cas9(图5A)，并使用TRAC gRNA序列(SEQ ID NO：7751)，将构建体导向至纯化的人T细胞中的TRAC基因座：5′C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U-3′。星号(*)代表2′-O-甲基3′硫代磷酸酯。使用IDLV和AAV将靶向构建体递送至TRAC基因座的示例性技术分别描述于Knipping F等人，《分子疗法：方法与临床开发》卷4，2017和Eyquem J等人《自然》，543(7643)：113-117，2017。平行地，还使用常规方法用慢病毒载体转导纯化的人T细胞，所述慢病毒载体在EF1α启动子下编码相应的TFP构建体(SEQ ID NO：2184、2490、2796)，以产生表达不同TFP的细胞。通过分别用TCR/CD3抗体免疫染色和蛋白质L染色来确定T细胞中TCRαβ和TFP的表达。还通过用MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5融合蛋白(SEQ ID NO：4923)染色来检查TFP在T细胞上的表达。将不同的T细胞群暴露于HEL.92.1.7-GLuc靶细胞，并使用细胞激活、增殖、细胞因子产生(例如，IL2)、靶细胞裂解、衰老、衰竭、体内扩增、体内持久性和体内抗肿瘤活性的体外和体内测定进行比较。与使用慢病毒载体表达TFP时相比，当将TFP表达导向至TRAC基因座时，TFP显示出受损的T细胞表面表达和减少或缺少T细胞活性(例如，T细胞激活、增殖、细胞因子产生和细胞毒性等)。接下来，测试TCRα恒定链(TRAC链)的表达是否可用于恢复TFP表达以及其中TFP表达盒破坏了内源TRAC基因组位点的T细胞中的信号传导和活性。为此目的，构建了靶向构建体，其与编码具有氨基端信号肽(IgSP)的TCRα恒定链的辅助模块共表达TFP(图5B)。辅助模块由Furine-SGSG-P2A接头与TFP编码序列分开。以SEQ ID NO：3859、7774和7777显示了与靶向MPL的TFP构建体共表达TCRα恒定链的示例性靶向构建体的核苷酸序列。这些构建体中TCRα恒定链的核苷酸序列经密码子优化，并且在其核苷酸序列上不同于内源性TCRα恒定链。在一个替代实施例中，TRAC链是密码子优化的，并带有已知增强人TCRα恒定链表达的氨基酸取代。以SEQ ID NO：3886至3894中显示了示例性外源TRAC链的核苷酸序列，其可用于允许在其中内源TCRα基因的表达已被靶向下调或消除的T细胞中重新表达TCR/CD3复合物。外源TRAC可以自身(SEQ ID NO：1010)在T细胞中表达，或者可以使用单个载体与TFP表达盒共表达。

将MPL特异性TFP构建体(SEQ ID NO：3858、7773和7776)和TFP-TRAC构建体(SEQID NO：3859、7774和7777)克隆到IDLV和AAV载体中，并基本上如前所述导向至TRAC基因座。

将表达构建体的细胞暴露于HEL.92.1.7-GLuc靶细胞，并如上所述在功能测定中测试。与其中将TFP构建体单独(即不共表达外源TRAC链)导向至TRAC基因座的T细胞相比，其中将TFP-TRAC构建体导向至TRAC基因座的T细胞显示出更好的TFP在细胞表面的表达。此外，与其中将TFP构建体单独(即，没有外源TRAC链的共表达)导向至TRAC基因座的T细胞相比，其中将TFP-TRAC构建体导向至TRAC基因座的T细胞显示出更高的增殖、激活、细胞因子(例如，IL2和TNFα)产生、细胞毒性、体内扩增、对靶细胞的体内抗肿瘤活性。

通过设计靶向盒，使得TFP盒框内之后为2A可切割接头、信号肽(例如，CD8信号肽或IgH信号肽)和TCRα链的第一外显子(TRAC)，TFP的表达和活性也在其中内源TRAC基因座被破坏的T细胞中恢复(图5C)。示例性靶向构建体的核苷酸序列以SEQ ID NO：3860、7775和7778示出。在此实施例中，TRAC蛋白由内源TRAC链产生，所述内源性TRAC链的细胞表面表达由靶向盒中提供的信号肽促进。

利用混合的淋巴细胞培养反应，使用经辐照的衍生自同种异体供体的T细胞，测试表达TFP-TRAC的T细胞的同种异体反应性，所述T细胞缺乏天然TCRα链的表达，但其中通过TCRα恒定链的表达挽救了TFP细胞表面表达和活性。与其中使用慢病毒载体表达TFP的T细胞相比，缺乏天然TCRα表达的表达TFP-TRAC的T细胞显示出显著降低至没有同种异体反应性，如通过增殖反应所测量。通过向免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室(Jackson Lab))施用每只动物500万个表达TFP-TRAC的TCRα缺陷型T细胞来检查缺乏天然TCRα表达的表达TFP-TRAC的人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。观察动物超过90天。当注入免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室)时，其中TFP-TRAC盒被导向至TRAC基因座的人T细胞显示出显著降低至没有移植物抗宿主病(GVHD)，而在接受其中使用慢病毒载体表达TFP的T细胞的动物中观察到GVHD。还通过向接受清除淋巴细胞的化疗的同种异体人接受者施用100万个细胞/kg来检查表达TFP-TRAC的TCRα缺陷型T人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。其中TFP-TRAC盒被导向至TRAC基因座的同种异体T细胞在给予同种异体接受者时显示出显著降低的移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和严重性。

当用其中TFP被导向至TRBC基因座的T细胞重复进行实验时，获得基本相似的结果。靶向TRBC的gRNA的靶序列以SEQ ID NO：7756-7758示出。使用本领域已知的方法，将这些gRNA与酿脓链球菌Cas9组合使用。将TFP表达盒导向至TRBC基因组位点显示出导致MPL特异性TFP的活性受损。然而，通过外源TCRβ恒定链(TRBC)的共表达恢复了TFP的活性。可以用于恢复TCR/CD3复合物信号传导功能的示例性外源TRBC链的核苷酸序列以SEQ ID NO：3899-3910示出。外源TRBC可以自身(SEQ ID NO：1011)在T细胞中表达，或者可以与来自单个载体的TFP表达盒共表达。以SEQ ID NO：3537、3539和3541显示了与靶向MRL的TFP构建体共表达TRBC链的示例性构建体的核苷酸序列。可以使用本领域已知的技术将这些TFP表达构建体克隆到合适的TRBC靶向载体中。在一个替代实施例中，通过设计靶向盒，使得TFP盒框内之后为2A可切割接头、信号肽(例如，CD8信号肽或IgH信号肽)和TCRβ链(TRBC)的第一外显子，TRBC的表达可以在其中内源TRBC基因座被破坏的T细胞中恢复。

将Ab-TCR构建体导向至TRAC基因座

在由EF1α启动子驱动的慢病毒载体(SEQ ID NO：3837)中产生了两个基于FMC63scFv的靶向CD19的Ab-TCR构建体。这些构建体CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]和CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]的核苷酸序列由编码SEQ ID NO：3124和3324的Ab-TCR组分的核苷酸序列表示。用相应的慢病毒上清液感染原代人T细胞，并使用FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清液(SEQ ID NO：1014)测定Ab-TCR的细胞表面表达，以及针对RAJI-GLuc细胞的细胞毒性。表达Ab-TCR的T细胞显示出适度的表达和活性。基本上如Eyquem J等人(《自然》，543(7643)：113-117，2017)所述，使用基因靶向构建体(参见图6)将Ab-TCR的表达导向至TRAC基因座，并由SEQ ID NO：3861-3864表示。靶向构建体含有剪接受体(SA)，之后是F2A编码序列、Ab-TCR盒，其侧翼是与TRAC基因座同源的序列(LHA和RHA，左右同源臂)。在盒A和盒B(SEQ ID NO：3861-3862)中，编码Ab-TCR表达盒的核苷酸序列后面是终止密码子、polyA序列、TRAC外显子1和与TRAC基因座同源的序列(RHA：右同源臂)。在盒C中，编码Ab-TCR表达盒的核苷酸序列之后是终止密码子，TRAC的外显子1和与TRAC基因座同源的序列(RHA：右同源臂)，但没有多聚A序列，使得转录物在其3′端带有TRAC基因和其多腺苷酸化序列。在盒D中，Ab-TCR盒缺少其自身的TCRα模块，并且仅延伸至IgG1-CH1区，所述区框内融合至TRAC第一外显子的3′一半。因此，在所述构建体中，TCRα模块由含有部分外显子1以及整个外显子2和外显子3的基因组TRAC基因座编码。除靶向构建体中的RHA携带可增强TRAC表达的突变(SDVP)外，盒E与盒D类似。与使用慢病毒载体表达的Ab-TCR盒相比，其中将Ab-TCR盒导向至TRAC基因座的T细胞显示均匀和生理表达以及转基因的长期持久性和活性，如使用体内和体外测定所测定的。表达Ab-TCR的T细胞通过用PE-蛋白质L染色然后流式分选进行纯化。使用混合的淋巴细胞培养反应，使用衍生自同种异体供体的经辐照的T细胞，测试表达Ab-TCR的T细胞的同种异体反应性。与其中使用慢病毒载体表达Ab-TCR的T细胞相比，其中Ab-TCR被导向至TRAC基因座的T细胞显著减少至没有同种异体反应性，如通过增殖反应所测量。通过向免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室)施用每只动物500万个表达Ab-TCR的T细胞来检查表达Ab-TCR的人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。观察动物超过90天。当注入免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室)时，其中Ab-TCR盒被导向至TRAC基因座的人T细胞显示出显著降低至没有移植物抗宿主病(GVHD)，而在接受其中使用慢病毒载体表达Ab-TCR的T细胞的动物中观察到GVHD。还通过向同种异体人接受者施用表达Ab-TCR的T细胞(100万个细胞/kg)来检查表达Ab-TCR的人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。其中Ab-TCR盒被导向至TRAC基因座的同种异体T细胞在给予同种异体接受者时显示出显著降低的移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和严重性。使用其中通过将表达盒导向至TRBC基因座来表达Ab-TCR的T细胞获得了基本上相似的结果。

将嵌合TCR或合成免疫受体(SIR)构建体导向至TRAC基因座

在由EF1α启动子驱动的慢病毒载体(SEQ ID NO：3837)中产生基于FMC63scFv的靶向CD19的三种cTCR(或SIR)构建体。这些构建体的核苷酸序列分别由SEQ ID NO：3878、3879和3880表示。它们都具有相同的vL和vH区域。尽管SEQ ID NO：3880具有TCRα和TCRβ恒定链的野生型核苷酸序列，但是SEQ ID NO：3878和3879具有密码子优化的序列。SEQ ID NO：3878进一步带有若干氨基酸取代，以增强TCRα和TCRβ恒定链的表达和碱基配对。用相应的慢病毒上清液感染原代人T细胞，并使用FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5上清液(SEQ IDNO：1014)测定SIR的细胞表面表达，以及针对RAJI-GLuc细胞的细胞毒性。没有发现具有SEQID NO：3880的cTCR/SIR构建体表达良好或诱导靶细胞裂解。还基本上如Eyquem J等人(《自然》，543(7643)：113-117，2017)所述，使用由SEQ ID NO：3865至3868和3873表示的示例性基因靶向构建体(参见图7)，将cTCR/SIR导向至TRAC基因座。靶向构建体含有剪接受体(SA)，之后是F2A编码序列、Ab-TCR盒，其侧翼是与TRAC基因座同源的序列(LHA和RHA，左右同源臂)。在盒A和盒B(SEQ ID NO：3865、3866和3873)中，编码SIR表达盒的核苷酸序列后面是终止密码子、多聚A序列、TRAC外显子1和与TRAC基因座同源的序列(RHA：右同源臂)。在盒C中，编码SIR表达盒的核苷酸序列之后是终止密码子、TRAC的外显子1和与TRAC基因座同源的序列(RHA：右同源臂)，但没有介于中间的多聚A序列，使得转录物在其3′端带有TRAC基因和其多腺苷酸化序列。在盒D中，SIR盒缺少其自身的TCRα模块，并且仅延伸至FMC63-vH区，所述区框内融合至靶向构建体中存在的TRAC的第一外显子。因此，在这一构建体中，TCRα模块由含有部分外显子1以及整个外显子2和外显子3的基因组TRAC基因座编码。除靶向构建体中的RHA携带可增强TRAC表达的TRAC的外显子1和2的突变(CSDVP)外，盒F与盒E类似。与使用慢病毒载体表达的cTCR/SIR盒相比，其中cTCR/SIR盒被导向至TRAC基因座的T细胞(SEQ ID NO：3873)显示出均匀的生理表达以及转基因的长期持久性和活性，如使用体内和体外测定所测定。当导向至TRAC基因座时，其他cTCR(SEQ ID NO：3865-3868)也显示出均匀的表达和活性。表达cTCR和SIR的T细胞通过用FITC缀合的CD3抗体和PE-蛋白质L染色然后流式分选进行纯化。利用混合的淋巴细胞培养反应，使用衍生自同种异体供体的经辐照的T细胞，测试表达cTCR和SIR的T细胞的同种异体反应性。与其中使用慢病毒载体表达cTCR/SIR的T细胞相比，其中cTCR/SIR被导向至TRAC基因座的T细胞显著减少至没有同种异体反应性，如通过增殖反应所测量。通过向免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室)每个动物施用500万个表达cTCR/SIR的T细胞来检测表达cTCR/SIR的人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。观察动物超过90天。其中将cTCR/SIR盒导向至TRAC基因座的人T细胞，当注入免疫缺陷的NSG小鼠(杰克逊实验室)时，显示显著降低至没有移植物抗宿主病(GVHD)，而在接受其中使用慢病毒载体表达cTCR/SIR的T细胞的动物中观察到GVHD。还通过向接受清除淋巴细胞的化疗的同种异体人接受者施用表达cTCR/SIR的T细胞(100万个细胞/kg)来检查表达cTCR和SIR的人T细胞诱导移植物抗宿主病(GVHD)的能力。其中cTCR/SIR盒被导向至TRAC基因座的同种异体T细胞在给予同种异体接受者时显示出显著降低的移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和严重性。使用其中通过将表达盒导向至TRBC基因座来表达cTCR和SIR的T细胞获得了基本上相似的结果。

将TCR或cTCR/SIR构建体导向至TRAC位点

靶向NY-ESO-1/HLA-A2复合物的TCR构建体和cTCR(或SIR)构建体在慢病毒载体(SEQ ID NO：3837)中生成，并且基于TCR NYESO-1G4和TCR模拟抗体NYESO-35-15。这些构建体的核苷酸序列分别由SEQ ID NO：3883和3882表示。还使用由SEQ ID NO：3874-3877表示的靶向构建体，将两个构建体靶向TRAC基因座。靶向构建体的设计如图8所示。其中NY-ESO-1 TCR或cTCR被导向至TRAC基因座的T细胞显示出转基因的均匀表达，对表达NY-ESO-1/HLA-A2复合物的靶细胞的良好识别，并且与其中通过体内测定利用慢病毒介导的基因转移表达上述构建体的T细胞相比，表现地一样好或更好。与其中使用慢病毒介导的基因转移表达NY-ESO-1或cTCR的T细胞相比，其中NY-ESO-1 TCR或cTCR被导向至TRAC基因座的人T细胞显示出在混合淋巴细胞反应中降低的同种异体反应性和在NSG小鼠异种移植模型中降低的GVHD。

将单链cTCR/SIR构建体导向至TRAC基因座

其中FMC63-scFv附接至密码子优化的TCRα恒定链或密码子优化的加鼠源化的TCRα恒定链(SEQ ID NO：3881)的单链cTCR/SIR使用慢病毒载体在T细胞中表达，并显示出差的表达和活性。使用图9所示并由SEQ ID NO：3869-3872表示的靶向构建体，将相同的构建体导向至TRAC基因座。当使用先前描述的测定来测定时，其中单链cTCR/SIR被导向至TRAC基因座的T细胞显示出cTCR的均匀表达和活性。此外，与其中使用慢病毒介导的基因转移表达NY-ESO-1或cTCR的T细胞相比，其中单链cTCR/SIR被导向至TRAC基因座的T细胞显示出使用MLR的同种异体反应性的发生率降低和使用NSG小鼠异种移植物模型的GVHD的发生率降低。

在以上实例中，将CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCR导向至TRAC基因座。基本上可以使用本领域已知的技术将类似的程序用于将CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCR或辅助模块导向至TCBC、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ基因座。

较短的EF1α启动子在T细胞中保留强启动子活性并且适用于过继性细胞疗法

在过继性细胞疗法应用中使用强病毒启动子携带下游致癌基因激活和癌症发展的风险。因此，人延伸因子1α(EF1α)启动子经常用于过继性细胞疗法应用，因为它提供强表达并且是人源的。然而，EF1α启动子的局限性在于其相对大的尺寸。尽管已经描述了mini-EF1α启动子，但是与EF1α启动子相比，它弱得多。为了确定EF1α启动子的内部缺失是否允许缩短其长度，同时保持其启动子强度，从EF1α启动子中删除SacII片段。所得的EF1α-D-SacII启动子的核苷酸序列以SEQ ID NO：3842示出。在具有野生型EF1α启动子(SEQ ID NO：3840)或EF1α-D-SacII启动子(SEQ ID NO：3839)的载体中构建了编码CD19-导向的FMC63-BBz CAR的慢病毒载体。载体还通过2A接头共表达EGFP和杀稻瘟素抗性基因。慢病毒在293FT细胞中产生，并用于感染J-N-G细胞。用杀稻瘟菌素选择感染的细胞，然后在与CD19+ve RAJI细胞共培养后测试其诱导EGFP表达的能力。在用任一慢病毒构建体转导的J-N-G细胞中均观察到接近等效的EGFP表达诱导。另外，在用任一种构建体转导的J-N-G细胞的表面上观察到接近等效的FMC63-BBz CAR表达，如通过与CD19-ECD-GGS-NLuc融合蛋白结合所测定。这些结果表明，EF1α-D-SacII启动子可用于过继性细胞疗法应用。结果进一步证明，EF1α-D-SacII启动子不比野生型EF1α启动子更倾向于沉默，并且可以用于长期转基因表达。

水溶性达沙替尼盐用于控制过继性细胞疗法期间观察到的细胞因子释放综合征和神经系统并发症的用途

达沙替尼是一种水溶性差的药物，并且商业达沙替尼是一水合物，并且据报道在24℃下的溶解度为8μg/mL。由于CRS和神经系统并发症的患者难以服用达沙替尼的口服形式，因此期望达沙替尼的水溶性形式。达沙替尼的水溶性盐已在WO2015107545 A1中进行了描述。可以根据WO2015107545 A1的方法制备包含达沙替尼甲磺酸一水合物的可溶性盐的可注射组合物，并用于治疗患有CRS和与CAR-T细胞和博纳吐单抗施用相关的神经系统并发症的患者。达沙替尼甲磺酸盐一水合物的剂量可以滴定直到达到有效的血浆浓度。在一个示例性实施例中，达沙替尼的血浆浓度保持高于10nM、20nM、50nM、100nM、200nM或300nM。在另一个示例性实施例中，达沙替尼的血浆浓度保持高于5ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或75ng/ml。最后，溶解在生理盐水中的达沙替尼甲磺酸一水合物还可用于患有来自CAR-T细胞和博纳吐单抗的神经系统并发症的患者的鞘内施用。在一个示例性实施例中，达沙替尼甲磺酸盐的鞘内剂量被调节以达到高于10nM、20nM、50nM、100nM、200nM或300nM的CSF浓度。在一个示例性实施例中，调节达沙替尼甲磺酸盐的鞘内剂量以达到高于5ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或75ng/ml的CSF浓度。

表达常规CAR和靶向多种抗原的主链1-72的自体T细胞用于过继性细胞疗法的用途

患有许多不同疾病，包括感染性疾病(例如，HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)、过敏性疾病(例如，慢性特发性荨麻疹)和多种癌症的患者将被纳入IRB批准的利用共表达靶向引起不同疾病或疾病相关抗原的NEMO-K277A(主链2)的过继转移的自体CAR-T细胞的免疫疗法的I期临床试验。根据引起疾病或疾病相关细胞中其靶抗原的已知表达，选择不同疾病的CAR。在可能的情况下，将通过与抗原结合结构域-GGS-NLuc融合蛋白结合来确认CAR靶标在引起疾病或疾病相关细胞上的表达，其中CAR的抗原结合结构域通过柔性接头与NLuc蛋白的非分泌形式融合。可替代地，将使用利用可商购获得的抗体的免疫组织化学或流式细胞术来确认CAR靶抗原在引起疾病或疾病相关细胞上的表达。将使用白细胞去除术从受试者中收集T细胞，用适当的慢病毒载体转导T细胞，并在封闭系统中使用CD3/CD28珠离体扩增。在经历质量控制测试(包括无菌性和肿瘤特异性细胞毒性测试)后，所得细胞产物将被冷冻保存。如前面的实例所述，将CAR-T细胞产物施用于受试者。然后，可以根据医师的判断进行临床和实验室相关的随访研究。基本上将类似的方法用于测试本公开中描述的其他主链中的CAR。

表达常规CAR和靶向多种抗原的主链1-72的同种异体T细胞用于过继性细胞疗法的用途

患有许多不同疾病，包括感染性疾病(例如，HIV1、EBB、CMV、HTLV1等)、变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)、过敏性疾病(例如，慢性特发性荨麻疹)和多种癌症的患者将被纳入IRB批准的利用靶向引起不同疾病或疾病相关抗原的过继转移的同种异体CAR-T细胞的免疫疗法的I期临床试验。根据引起疾病或疾病相关细胞中其靶抗原的已知表达，选择不同疾病的CAR。在可能的情况下，将通过与抗原结合结构域-GGS-NLuc融合蛋白结合来确认CAR靶标在引起疾病或疾病相关细胞上的表达，其中CAR的抗原结合结构域通过柔性接头与NLuc蛋白的非分泌形式融合。可替代地，将使用利用可商购获得的抗体的免疫组织化学或流式细胞术来确认CAR靶抗原在引起疾病或疾病相关细胞上的表达。将使用白细胞去除术从健康供体中收集T细胞。将CAR表达盒(SEQ ID NO：1900至SEQ ID NO：2205)克隆到靶向载体中，并将CAR模块导向至T细胞中的TRAC基因座，基本上如(Eyquem J等人，《自然》，543(7643)：113-117)所述。通过免疫磁性纯化选择表面上缺乏CD3表达的T细胞，然后在封闭系统中使用CD3/CD28珠体外扩增。在经历质量控制测试(包括无菌性和肿瘤特异性细胞毒性测试)后，所得细胞产物将被冷冻保存。如前面的实例所述，将CAR-T细胞产物施用于受试者。然后，可以根据医师的判断进行临床和实验室相关的随访研究。基本上将类似的方法用于测试本公开中描述的其他主链中的CAR，包括共表达缺乏Vα结构域的TCRα恒定链(TRAC)的CAR。

CAR-T细胞肝动脉输注

除了静脉内输注，表达本发明中描述的常规CAR和主链1-72的T细胞可动脉内输注以在与疾病有关的局部区域或器官中提供高浓度的CAR-T细胞。在以下实例中，这一方法用于表达叶酸受体α(FR1)的胃肠道癌的肝转移的患者。基本上可将类似的方法用于动脉内输注表达常规CAR和靶向其他肿瘤抗原的主链1-72的T细胞。

基线时将通过右股总动脉入路进行血管造影作图。胃十二指肠和右胃动脉，除肝外灌注的其他潜在来源外，还将用微线圈栓塞。对于施用表达构建体CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(SEQ ID NO：1727)的T细胞，将进行相同的动脉进入程序。T细胞将在第0天从患者收集，并将用编码构建体CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC的慢病毒感染，并按照前面实例所述进行扩增。在第14天(10⁷个CAR-T细胞)、第28天(10⁸个CAR-T细胞)和第44天(10⁹个CAR-T细胞)以剂量递增的方式给予CAR-T细胞。CAR-T细胞将通过60cc注射器以＜2cc/秒的速率手动注入。输注的总体积大约为100cc。在第一次50cc输注后和CAR-T输注完成时，进行具有校准造影率(calibrated contrast rate)的血管造影术，以确认保留的动脉血流。可能的话，输注将被递送到适当的肝动脉中。某些患者可能有异常的肝动脉解剖结构，其中右肝动脉或左肝动脉都不来自正常肝动脉。在这种情况下，CAR-T细胞的剂量将根据叶体积计算进行分配。在这种情况下，分开的剂量将分别递送到左右肝动脉中，以确保将CAR-T按比例递送到两个肝叶。

CAR-T细胞的腹膜内施用

基本上如Koneru M等人所述(《转化医学杂志(Journal of TranslationalMedicine)》；2015；13：102)，也可以腹膜内施用CAR-T细胞。在以下实例中，这一方法用于表达叶酸受体α(FR1)的卵巢癌腹膜累及患者。基本上可将类似的方法用于腹膜内输注靶向本公开中描述的其他肿瘤抗原的CAR-T细胞。

筛查知情同意书将提供给复发性高级别浆液性卵巢癌患者，以测试其癌症中FR1的表达。在通过免疫组织化学证实FR1的表达后，患者将具有从外周血获得的白细胞分离术产物。将从白细胞分离术产物去除过多的血小板和红细胞污染，并将产物冷冻。在研究的治疗阶段，将解冻并洗涤白细胞分离术产物。随后，将通过使用CD3/CD28珠的磁分离从融化的白细胞分离术产物中分离CD3+T细胞。激活的T细胞将用CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC构建体进行慢病毒转导，并使用CD3/CD28珠扩增方案进一步扩增。

通过对库存(石蜡包埋)或新鲜活组织检查的肿瘤进行免疫组织化学(IHC)分析确认的显示出表达FR1抗原的复发性高级别浆液性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者将可能适合所述研究。

试验中将使用I期剂量递增给药。将向3至6名患者的组中注入递增剂量的修饰T细胞，以确立最大耐受剂量(MTD)。将有四个计划的剂量水平：3×10⁵、1×10⁶、3×10⁶和1×10⁷个CAR-T细胞/kg。第I和II组将用3×10⁵个CAR-T细胞/kg治疗，而第II组中的患者也将接受淋巴细胞耗竭环磷酰胺。在用环磷酰胺预处理后，第II-V组将接受递增剂量的修饰T细胞。初次T细胞输注前2至4天将施用以750mg/m²给予的淋巴细胞耗竭环磷酰胺。将按照标准的3+3剂量递增方案。

IP导管将在T细胞输注之前放置。患者将在第一次输注CAR T细胞之前被送入医院的住院部，并将继续住院直到第二次输注CAR T细胞之后至少3天。待治疗的第一组患者和随后的每组中治疗的第一名患者进入重症监护病房(ICU)；随后的患者可以进入肿瘤内科住院(取决于治疗医师的临床判断)。

在开始用CAR修饰的T细胞治疗前2至4天，患者将接受单剂量的淋巴细胞耗竭环磷酰胺(750mg/m²IV)化疗。在输注之前，将对转导的T细胞的数量、纯度、生存力和无菌性进行质量测试。所有患者将静脉内接受基因修饰T细胞剂量的50％。将密切监测对患者的毒性。一至三天后，剩余的T细胞剂量将以IP输注的方式施用。至少有3位患者将以剂量水平1接受治疗，每个剂量水平内每月不得增加多于2位患者。从最初的T细胞输注之日起，在升级到下一组之前，将观察在前一组中治疗的所有患者至少4周。在治疗之前和之后将从所有患者获得血液样品，以评估基因修饰的T细胞的毒性、治疗效果和存活。

CAR-T细胞用于肿瘤内注射的用途

CAR-T细胞也可以肿瘤内施用，基本上如Brown CE等人，《临床癌症研究(ClinCancer Res.)》2015年9月15日；21(18)：4062-4072所述。在以下实例中，这一方法将用于表达IL13Ra2的复发性胶质母细胞瘤(GBM)的患者。基本上可将类似的方法用于肿瘤内注射表达常规CAR或表达靶向其他肿瘤抗原的辅助模块(主链1-72)的常规CAR的T细胞。

将进行初步的安全性和可行性研究，以测试在复发性GBM中表达CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(SEQ ID NO：1769)的T细胞。所有参与的患者都必须获得书面知情同意书。所述临床方案将由南加州大学机构审查委员会批准，并根据研究性新药申请进行，并在ClinicalTrials.gov上登记。符合条件的患者将包括患有复发性或难治性单灶幕上III或IV级神经胶质瘤的成人(18至70岁)，其肿瘤显示与脑室/CSF途径无联系且可切除。参与这一试验将独立于IL13Rα2(或IL13Ra2)肿瘤抗原状态。最初诊断为高级别神经胶质瘤(WHO III或IV级)后，患者将被将招募，此时他们将接受白细胞分离术以收集外周血单核细胞(PBMC)。这些细胞将被用于工程化T细胞，以在用相应的慢病毒载体感染后表达含有嘌呤霉素抗性基因(PAC)的构建体CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC，如先前实例中所述。可替代地，可以在用逆转录病毒载体感染或使用睡美人转座子或通过IVT mRNA转染后产生CAR-T细胞。随后，将经释放测试的治疗性CAR-T细胞冷冻保存并储存以备后用。在肿瘤首次复发时，研究参与者将经历肿瘤切除和放置Rickham储液器/导管。同时，将治疗性CAR-T细胞解冻，并使用基于CD3/CD28珠的快速扩增方案在体外重新扩增。从手术中恢复并进行基线MR成像后，将通过留置导管将CAR-T细胞直接施用到切除腔中，基本上如(Brown CE等人，《临床癌症研究》2015 21(18)：4062-4072)所述。将使用21号蝶形针将细胞手动注入Rickham储液器中，以在5至10分钟内递送2mL的体积，然后在5分钟内用不含防腐剂的生理盐水冲洗2mL。协议治疗计划将详细说明患者内的剂量递增方案，目标是在由每周治疗周期构成的5周时段内颅内施用12个CAR T细胞剂量。在第1、2、4和5周期中，将在所述周期周的第1、3和5天进行T细胞输注，而第3周将是一个休息周期。为了安全，在第1周期，将使用患者内剂量递增策略，其中分别在第1、3和5天施用的CAR T细胞剂量为10⁷、5×10⁷和10⁸个细胞/输注，并且这之后将进行9次额外的10⁸个细胞的CAR T细胞输注4周。在第3周的休息周期和第5周后进行成像以评估反应。将按照NCI通用毒性标准2.0版(https：//ctep.ifo.nih.gov/l)中提供的准则来监测毒性和不良事件报告。

CAR-T细胞在移植前用于离体净化骨髓或外周血干细胞的用途

在干细胞移植之前，CAR T细胞可用于净化癌细胞的骨髓或外周血干细胞制剂。在以下实例中，在自体干细胞(或骨髓)移植之前，将使用表达CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC(SEQ ID NO：1699)的T细胞来净化从多发性骨髓瘤患者获得的骨髓或外周血干细胞。

患者将接受白细胞去除术以收集外周血单核细胞(PBMC)。将使用CD3珠纯化T细胞。这些细胞将被用于工程化T细胞，以在用相应的慢病毒载体感染后表达CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC CAR，如前面实例中所述。随后，将经释放测试的治疗性CAR-T细胞冷冻保存并储存以备后用或新鲜使用。按照标准程序，将从多发性骨髓瘤的患者中收集骨髓细胞和外周血祖细胞产物。为了动员外周血干细胞，患者将接受3gm/m²环磷酰胺，之后在环磷酰胺后24小时开始每天皮下接受10μg/kg的G-CSF，直至分离完全。一旦外周血CD34+细胞计数为15细胞/μl，就会收集外周血干细胞。收集目标是每天处理三个血量，直到处理后达到最低10⁶个CD34+细胞/kg的2.0倍。可以使用MiltenyiBiotec的CliniMACS System并按照制造商的建议，任选去除骨髓和外周血干细胞产物中的红细胞和/或富集表达CD34的细胞。所述产物将用于离体净化新鲜或冷冻保存的产品。为了进行净化，将骨髓或外周血干细胞产物与融化的CAR-T细胞以5∶1至30∶1的效应物与靶标比例在补充有100IU重组人IL2的XVIVO培养基(龙沙)中共培养4至24小时。细胞将在37℃下于5％CO2湿润培养箱中培养。在共培养期结束时，将等分细胞用于无菌和质量测试(包括测量CFU-GM以及CD34和CD138阳性细胞的流式细胞术)。剩余的样品将静脉施用于先前接受过清髓性化疗的患者(例如，高剂量美法仑，70mg/m²的两个分剂量，总剂量为140mg/m²)。

双特异性T细胞衔接子的用途

使用具有表13中列出的SEQ ID No的构建体在Hela细胞中表达由双特异性T细胞衔接子编码的蛋白质。利用标准蛋白纯化技术，使用Metal亲和标签或StrepTag II柱纯化蛋白。在I期临床试验中测试纯化的蛋白质。使用本领域已知的不同测定，基于双特异性抗体的靶抗原的表达选择患者。双特异性抗体通过24小时输注施用。将按照NCI通用毒性标准2.0版(http[s：//]ctep.ifo.nih.gov/l)中提供的准则来监测毒性和不良事件报告。

CAR组合的用途

向间皮瘤和成胶质细胞瘤患者施用感染慢病毒的T细胞，慢病毒编码靶向靶向间皮素(在间皮瘤上表达)、IL13Ra2(在成胶质细胞瘤上表达)和造血标志物(CD19、CD20、CD22、BCMA)的CAR的组合。T细胞或者是野生型TCR链，或者具有通过CRISP/Cas9方法敲除的TCRα链。观察到，与单独的间皮素的表达相比，在相同的T细胞中与靶向间皮素的CAR和靶向CD19、CD20、CD22或BCMA的CAR的野生型TCR链共表达导致体内T细胞扩增增加。用靶向胶质母细胞瘤的CAR获得了基本相似的结果。然而，在TCR链缺陷的T细胞中，基于靶向CD20(SEQID NO：9660)的CAR的TFP的共表达不能诱导体内扩增，而基于SIR(SEQ ID NO：9668)或Ab-TCR(SEQ ID NO：9676)的CAR的共表达成功诱导T细胞扩增。

表15CAR组合对体内T细胞扩增的作用

上面描述的各种方法和技术提供了多种执行本申请的方式。当然，应当理解，根据本文所述的任何特定实施例，不一定可以实现所描述的所有目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行方法，而不必实现本文所教导或建议的其他目的或优点。本文提到了多种替代方案。应理解的是，一些优选实施例具体包括一个、另一个或若干特征，而另一些具体地排除一个、另一个或若干特征，而仍另一些通过包括一个、另一个或若干有利特征来减轻特定特征。

此外，技术人员将认识到来自不同实施例的各种特征的适用性。类似地，本领域普通技术人员可以以各种组合采用上述的各种元件、特征和步骤以及每个这种元件、特征或步骤的其他已知等效物，以根据本文所描述的原理执行方法。在各种实施例中，各种元件、特征和步骤中的一些将被特别地包括，而其他一些将被特别地排除。

上面已经阐述了多个实施例以说明本公开。所附权利要求进一步阐述了申请人认为是其发明的内容。