阅读说明：本技术 用于改善car-t细胞功能的组合物及其用途 (Compositions for improving CAR-T cell function and uses thereof ) 是由 沙德哈克·森古普塔 于 2018-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含CAR-T细胞和GSK3β抑制剂的组合物和试剂盒,包括此类组合物和/或试剂盒在治疗诸如癌症等的疾病中的使用。(The present invention relates to compositions and kits comprising CAR-T cells and GSK3 β inhibitors, including the use of such compositions and/or kits in the treatment of diseases such as cancer.)

用于改善CAR-T细胞功能的组合物及其用途

相关申请的交叉引用

本发明要求2017年11月20日提交的美国临时申请US62/588,519的优先权，出于所有目的，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本文公开的内容涉及用于改善表达受体蛋白的基因修饰的或嵌合的抗原受体T细胞(例如，CAR-T)的功能的组合物和方法，所述组合物和方法可用于多种治疗应用，例如肿瘤的治疗。

背景技术

利用表达嵌合抗原受体的工程化T细胞(CAR-T)作为针对恶性肿瘤的免疫治疗策略已成为成功治疗外周液体肿瘤的标志。但是，CAR-T疗法在实体肿瘤治疗中显示出混合反应。过继性T细胞疗法的成功取决于治疗性T细胞容易获得抗原源和协同刺激信号，这会产生强大的活化模式和强烈的细胞毒性作用，例如在血液肿瘤中或在治疗高度免疫原性肿瘤(例如黑色素瘤)的过程中，CAR-T细胞暴露于***中大量的恶性B细胞。相反，在实体肿瘤的CAR-T治疗期间，由于有限地暴露于肿瘤抗原而导致T细胞弱活化，进而导致免疫反应不稳定、克隆扩增贫血和克隆提早收缩。

本领域采用了各种方法来克服克隆收缩和弱T细胞活化这一问题，并在一定程度上取得了成功。例如，将CD28信号传导分子附加到CAR构建体的细胞内部分以设计所谓的第二代CAR-T细胞，以克服克隆收缩、促进快速增殖和克服细胞因子缺乏。随着时间的流逝，人们观察到这种修饰并没有克服将CAR-T用于实体肿瘤的所有障碍。人们已对CAR-T细胞进行了进一步修饰以创建添加有诸如41BB和/或OX40的协同刺激分子的“第三代”CAR。另外，患者通常接受IL2治疗，以保持转移的T细胞的存活和功能，这导致治疗性T细胞不受控制地产生细胞因子。

尽管这些方法在实体肿瘤的治疗中已经能够在一定程度上增强T细胞的活化，但是仍然需要进一步创新来完全克服克隆收缩并促进T细胞的快速增殖和活化。本文提供了这样的方法。

发明内容

本文公开的内容涉及用于改善CAR-T疗法的组合物和方法。本领域已认识到阻碍CAR-T细胞免疫疗法在实体肿瘤中成功的一个主要障碍是弱抗原暴露，导致CAR-T细胞活化不足，从而伴随产生弱的抗肿瘤免疫反应，本发明提供了克服CAR-T疗法中现有障碍的组合物和方法。具体而言，本文所述的组合物和方法克服了第二代CAR中CD28和其它协同刺激信号部分的许多限制，以及与补充IL2疗法相关的细胞毒性。

在各种实施方式中，本文提供一种用于体外扩增T细胞群的方法，包括使T细胞群与GSK3β抑制剂接触。在各种实施方式中，首先用编码嵌合抗原T细胞受体的核酸转导T细胞。在各种实施方式中，T细胞来源于哺乳动物。在各种实施方式中，哺乳动物是人。

在各种实施方式中，该方法进一步包括使转导的细胞与肿瘤抗原接触。

在各种实施方式中，本文提供一种用于体外扩增T细胞群的方法，包括：从受试者体内分离出包含所述T细胞的样品；使用编码嵌合抗原受体蛋白的核酸转导所述T细胞群，所述嵌合抗原受体蛋白包含与肿瘤抗原结合的分子；以及，使转导的T细胞与GSK3β抑制剂接触。

在各种实施方式中，该方法进一步包括使转导的T细胞与肿瘤抗原接触。在各种实施方式中，T细胞同时与GSK3β抑制剂和肿瘤抗原接触。

在各种实施方式中，用编码包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白的核酸转导T细胞(IL13 CAR-T)。在各种实施方式中，核酸编码白介素13变体IL13.E13K.R109K或其片段。

在各种实施方式中，核酸编码白介素13的包含如下结构域或融合蛋白的片段，所述结构域与白介素13受体或其胞外结构域结合，所述融合蛋白包含白介素13受体或其胞外域的融合蛋白。在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体(IL13R)或其变体。

在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体的阿尔法(α)链(IL13Rα)或其变体的阿尔法(α)链。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是(a)选自SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)的化学试剂；和/或(b)选自微小RNA(miRNA)，小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合的遗传试剂。

在各种实施方式中，T细胞是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞或γδT细胞。

在各种实施方式中，将扩增的T细胞随后施用回至患者以治疗疾病。在各种实施方式中，该疾病是癌症。在各种实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在各种实施方式中，所述肿瘤表达肿瘤抗原。

在各种实施方式中，本文提供一种组合物，其包含所述嵌合抗原受体蛋白(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂。在各种实施方式中，嵌合抗原受体与肿瘤抗原结合。

在各种实施方式中，T细胞表达包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体(IL13 CAR-T)。在各种实施方式中，T细胞表达包含白介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是小分子或遗传试剂。在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是如下小分子或遗传试剂，所述小分子是SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)；所述遗传试剂是siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合、和GSK3的显性负等位基因(GSK3DN)的遗传试剂。

在各种实施方式中，本文提供一种单独施用的制剂，其包含表达嵌合抗原受体蛋白的T细胞(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是如下小分子或如下遗传试剂，所述小分子是SB216763、TWS-119、1-Azakenpaullone或6-溴靛红-3’-肟(BIO)；所述遗传试剂是siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。

在各种实施方式中，本文提供一种试剂盒，其中，所述试剂盒在一个或多于一个包装中包含CAR核酸构建体，该CAR核酸构建体编码包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白(IL13 CAR-T)；GSK3β抑制剂；并且任选地包含用于通过所述CAR核酸构建体转导T细胞的第一试剂；以及进一步任选地包含用于活化T细胞的第二试剂。

在各种实施方式中，所述第二试剂是IL13Rα2-Fc。在各种实施方式中，核酸构建体编码包含白介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白。在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是如下小分子或如下遗传试剂，所述小分子是SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)；所述遗传试剂是siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是包含微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合、以及GSK3DN的遗传试剂。

在各种实施方式中，本文提供与天然或野生型T细胞相比抑制GSKβ表达或活性的T细胞。在各种实施方式中，T细胞是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞或γδT细胞。

在各种实施方式中，本文提供一种用于体外扩增T细胞的方法，其包括：从受试者体内分离出包含T细胞的样品；使T细胞与GSK3β抑制剂接触；使用编码包含与肿瘤抗原结合的分子的嵌合抗原受体蛋白的核酸转导T细胞；使转导的T细胞与肿瘤抗原接触以扩增转导的T细胞。

在各种实施方式中，本文提供一种用于体外扩增T细胞的方法，其包括：从受试者体内分离出包含T细胞的样品；使T细胞与GSK3β抑制剂接触；使用编码包含与肿瘤抗原结合的分子的嵌合抗原受体蛋白的核酸转导T细胞；使转导的T细胞与肿瘤抗原接触以活化和/或扩增转导的T细胞。

在各种实施方式中，T细胞通过编码包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白的核酸进行转导(IL13 CAR-T)。在各种实施方式中，核酸编码白介素13变体IL13.E13K.R109K或其片段。在各种实施方式中，核酸编码白介素13的包含如下结构域或融合蛋白的片段，所述结构域与白介素13受体或其胞外结构域结合，所述融合蛋白包含白介素13受体或其胞外结构域。在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体(IL13R)或其变体。在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体的阿尔法(α)链(IL13Rα)或其变体的阿尔法(α)链。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是(a)选自SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)的化学试剂；和/或(b)选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合的遗传试剂。

在各种实施方式中，T细胞是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞或γδT细胞。

在各种实施方式中，本文提供一种治疗有此需要的受试者中可由过继转移T细胞治疗的疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含多种活化和扩增的T细胞的组合物，其中，所述活化包括使CAR-T与抗原接触，并且所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与GSK3β抑制剂接触。

在各种实施方式中，本文提供一种治疗有此需要的受试者中可由过继转移T细胞治疗的疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含多种活化和扩增的T细胞的组合物，其中，所述活化包括使CAR-T与抗原接触，并且所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与GSK3β抑制剂接触。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是(a)选自SB216763、TWS-119、1-Azakenpaullone或6-溴靛红-3’-肟(BIO)的化学试剂；和/或(b)选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合的遗传试剂。

在各种实施方式中，疾病是肿瘤疾病，选自细菌性疾病、病毒性疾病和原生动物疾病的致病性疾病，或自身免疫性疾病。

在各种实施方式中，本文提供一种治疗有此需要的受试者体内的肿瘤的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，该组合物包含多个表达嵌合抗原受体蛋白的活化且扩增的T细胞(CAR-T)，所述嵌合抗原受体蛋白包含与肿瘤抗原结合的分子，其中，所述活化包括使CAR-T与肿瘤抗原接触，所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与GSK3β抑制剂接触，其中，所述活化的CAR-T细胞表达嵌合抗原受体蛋白，其中，所述嵌合抗原受体蛋白与肿瘤抗原结合。

在各种实施方式中，T细胞是自体T细胞。

在各种实施方式中，T细胞表达包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体(IL13 CAR-T)。在各种实施方式中，T细胞表达包含白介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是(a)选自SB216763、TWS-119、1-Azakenpaullone、或6-溴靛红-3’-肟(BIO)的化学试剂；和/或(b)选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合的遗传试剂。

在各种实施方式中，T细胞被同时或顺序地活化和扩增。在各种实施方式中，肿瘤是IL13R阳性的。在各种实施方式中，肿瘤是IL13R阳性神经胶质瘤。

在各种实施方式中，本文提供一种用于产生肿瘤特异性记忆T细胞的方法，该方法包括：使用编码嵌合抗原受体的核酸转导从受试者的生物样品中分离出的T细胞(CAR-T)，所述嵌合抗原受体包含与肿瘤抗原结合的分子；使CAR-T细胞与所述肿瘤抗原和GSK3β抑制剂接触；检测对记忆细胞具有特异性的第一标志物和对肿瘤抗原具有特异性的第二标志物，从而产生肿瘤特异性记忆T细胞。

在各种实施方式中，使用编码IL13或其片段或其变体的核酸转导CAR-T细胞。在各种实施方式中，使用编码IL13变体IL13.E13K.R109K的核酸转导CAR-T细胞。在各种实施方式中，肿瘤抗原是IL13受体或其配体结合结构域。

在各种实施方式中，GSK3β抑制剂是(a)选自SB216763、TWS-119、1-Azakenpaullone或6-溴靛红-3’-肟(BIO)的化学试剂；和/或(b)选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、反义寡核苷酸或其组合的遗传试剂。

在各种实施方式中，T细胞被同时或顺序地活化和扩增。在各种实施方式中，对记忆细胞具有特异性的标志物选自CD45RO+和CD45RA+，对肿瘤抗原具有特异性的标志物包括与肿瘤抗原结合的蛋白质的表达。在各种实施方式中，CAR-T细胞对IL13R阳性肿瘤细胞具有特异性，如通过功能试验所确定的，所述特异性包括与IL13R阳性细胞结合和任选地破坏IL13R阳性细胞。在各种实施方式中，记忆T细胞是CD8+T细胞。

在各种实施方式中，本文所述的方法进一步包括检测记忆CAR-T细胞稳态的第三标志物。在各种实施方式中，所述第三标志物是表达、T-bet表达和/或PD-1表达。在各种实施方式中，其中，T-bet表达的提高和/或PD-1表达的降低说明CAR-T细胞稳态得到改善。在各种实施方式中，T细胞稳态包括减少的T细胞衰竭、持续的细胞因子表达、T细胞克隆维持和/或促进CAR-T记忆发育。在各种实施方式中，通过所述肿瘤抗原活化并在GSK3β抑制剂存在的条件下扩增而产生的CAR-T细胞显示出对表达所述肿瘤抗原的肿瘤细胞的特异性和记忆性提高。

附图说明

本文公开的一个或多个实施方式的细节在所附的附图/表格以及下文的描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将根据附图/表格和详细描述以及权利要求而变得明显。

图1显示在体外缺乏IL2补充的情况下，GSK3β抑制保护活化的CAR-T细胞免于ATCD。图1A显示在缺乏SB21763的情况下，IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T的存活率稳定下降(空心正方形，实线；上图；p＝0.2)，在使用SB216763抑制GSK3β后，IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T的存活率被挽救至IL2补充的IL13CAR-T的存活水平(实心正方形，虚线)(下图；p<0.05)。结果表示了2个实验中的1个，每个时间点每个样品的n＝3孔。误差柱代表SD。图1B显示仅用IL13Rα2-Fc(上图)活化之后和GSK3β抑制(下图)活化后表达FasL的IL13CAR-T细胞频率的流式细胞计数的结果。结果是具有代表性的n＝3独立实验。图1C显示CFSE稀释液的代表性FACS特性，显示未经任何处理的IL13CAR-T细胞增殖(顶部曲线)，仅用SB216763处理的IL13CAR-T细胞增殖(第二曲线)，仅用IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞增殖(第三曲线)和用IL13Rα2-Fc+SB216763活化的IL13CAR-T细胞增殖(底部曲线)。

图1-补充显示本发明的IL13CAR-T细胞的IL13Rα2特异性的结果。图1A-补充显示在以不同的效应物与靶细胞(E：T)的比率(左)与IL13Rα2⁺U251MG肿瘤细胞共培养，用1μg/ml和10μg/ml的IL13Rα2-Fc(中)和IL13Rα1-Fc(右)进行活化后的IL13CAR-T富集的流式细胞计数结果，未转导的T细胞用空心线表示，而IL13CAR-T用封闭线表示。图1B-补充显示CFSE稀释液的流式细胞计数结果，其显示了在U251MG细胞(上图)存在时在用0μg/ml(黑色)、1μg/ml(灰色)和10μg/ml(空心)的IL13Rα2-Fc(中图)和IL13Rα1-Fc(下图)活化后IL13CAR-T细胞的IL13Rα2特异性增殖(E：T比分别为1：0(黑色)、1：1(灰色)和1：2(空心))。

图2显示了GSK3β抑制导致活化的CAR-T细胞中T-bet上调和PD-1表达降低。图2A显示IL13CAR-T细胞(左图)中核内T-bet表达的流式细胞计数结果；以及在不存在或存在SB216763的情况下，用IL13Rα2-Fc活化之后PD-1+IL13CAR-T细胞的频率(右图)。结果是具有代表性的n＝3独立实验。图2B显示了在IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞中TBX21基因(T-bet；左图)和PDCD1基因(PD-1；右图)的相对表达(qPCR)。数据经GAPDH标准化后使用2^-ΔΔC _T方法进行分析。误差柱代表来自N＝3次独立实验的SEM。

图2-补充显示IL13CAR的转导效率。从三个盲供体的PBMC中提取OKT-3和IL2以富集T细胞，并用表达IL13CAR的逆转录病毒上清液转导3次，以最大化转导效率(TE)。最终转导48小时后，通过使用流式细胞仪观察人IL13在CD3+T细胞上的表达来测量TE。这项研究中的所有实验均标准化至IL13CAR的TE，以消除供体依赖性变化。

图3显示GSK3β抑制导致抗原特异性CAR-T细胞的细胞核中β-连环蛋白的表达增加。未刺激的IL13CAR-T细胞中核β-连环蛋白的表达的代表性直方图(上图)；IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞中核β-连环蛋白的表达的代表性直方图(中图)；和SB216763处理的IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞中核β-连环蛋白的表达的代表性直方图(下图)。用大鼠抗人IL13一抗/APC抗大鼠IgG1二抗，和兔抗β-连环蛋白MAb/FITC抗兔IgG的二抗对处理过的或未经处理的IL13CAR-T细胞进行染色。使用特异性抗体作为对照以消除背景染色。结果是具有代表性的n＝2个实验。

图3-补充显示IL13CAR-T细胞的CD8富集的实验结果。图3A-补充显示用IL13Rα2-Fc+SB216763活化的IL13CAR-T细胞中CD8:CD4比率的流式细胞计数结果。每张图代表来自3个供体中每一个的FACS特性。根据各自的抗体对照绘制门控。图3B-补充显示了在IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞中IFNG(干扰素-γ)基因的相对表达。数据经GAPDH标准化后使用2^-ΔΔC _T方法进行分析。图3C-补充显示通过ELISA测量的来自IL13CAR-T细胞培养物上清液的干扰素γ水平，该IL13CAR-T细胞单独用SB216763处理或用SB216763与IL13Rα2-Fc活化联合处理。误差柱代表来自N＝3次独立实验的SEM。

图4显示了GSK3β抑制后的抗原特异性CAR-T细胞记忆表型。图4A显示了在存在SB216763(右图)或不存在SB216763(左图)的情况下用IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞频率的代表性FACS特性。图4B显示了IL13CAR-T细胞记忆表型的线形图表示。误差柱代表来自N＝3次独立实验的SEM。

图5显示了用IL13CAR-T治疗的荷瘤小鼠体内CAR-T的组织分布和T效应子记忆表型的表达。图5A(左)显示了荷瘤动物的肿瘤引流的***(上图)、脾脏(中图)和肿瘤浸润的淋巴细胞(底部)中的组织特异性IL13CAR-T分布的局部表达。图5B(右)显示了荷瘤动物的肿瘤引流的***(上图)、脾脏(中图)和肿瘤浸润的淋巴细胞(下图)中的CD45RO⁺CD127⁺IL13CAR-T的分布。在用未活化的IL13CAR-T细胞治疗的所有存活的异种移植动物中均观察到肿瘤(100％复发；白色圆圈*)，用IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞治疗的存活动物中有67％检测到肿瘤(黑色圆圈**)。在用SB216763处理的IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞治疗的存活动物中未检测到肿瘤(0％复发；灰色圆圈)。

具体实施方式

本说明书中描述了本发明的示例性实施方式和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施方式和应用，也不限于本文中操作或描述的示例性实施方式和应用的方式。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他实施例、特征、目的和优点将是显而易见的。此外，在引用元素列表(例如，元素a、b、c)的情况下，这种引用旨在包括所列元素中的任一元素，少于所有列出的元素的任何组合，和/或所有列出的元素的组合。本说明书中的章节划分仅是为了便于阅读，并不限制所讨论元素的任何组合。

如本文中所使用的，术语“包含(comprise，comprises，comprising)”，“含有(contain)，contains，containing)”，“具有(have，having)”，“包括(include，includes，including)”及其变体并非旨在限制性的，而是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未描述的添加剂、成分、整数、元素或方法步骤。例如，包含一系列特征的过程、方法、系统、组合物、试剂盒或设备并不仅限于这些特征，还可以包括未明确列出的或此类过程、方法、系统、组合物、试剂盒或设备所固有的其他特征。

除非另有定义，与本文所述的教导结合使用的科学技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

本发明涉及用于改善CAR-T治疗的组合物和方法。本领域已认识到阻碍CAR-T细胞免疫疗法在实体肿瘤中成功的一个主要障碍是弱抗原暴露导致的CAR-T细胞活化不足，从而伴随产生弱的抗肿瘤免疫反应，本发明提供了克服CAR-T疗法中的现有障碍的组合物和方法。具体而言，本文所述的组合物和方法克服了第二代CAR中CD28和其它协同刺激信号部分的许多限制，以及与补充IL2疗法相关的细胞毒性。

在各种实施方式中，本发明的组合物和方法涉及佐剂在改善CAR-T细胞的存活和/或效力中的应用。具体而言，本发明证明GSK3β抑制剂可用于增加抗原特异性CAR-T细胞的增殖，迅速扩增抗原特异性CAR-T细胞以及改善抗原特异性CAR-T细胞的存活。如在本发明的实施例部分所详细证明的，对GSK3β的药理学的抑制促进抗原特异性CAR-T细胞的增殖和这些T细胞的长期存活。通过减轻PD-1的表达，GSK3β的抑制保护活化的CAR-T细胞不受T细胞耗竭的影响，并进一步促进特异性效应CAR-T记忆表型的发育，该表型可随抗原暴露的变化而进行调整。GSK3β抑制的抗原特异性CAR-T细胞治疗荷瘤动物可100％消除肿瘤，并增加记忆CAR-T细胞在脾脏和引流***中的积累。在动物模型中进行肿瘤再激发实验，当采用GSK3β抑制的抗原处理过(antigen-experienced)的CAR-T细胞进行治疗时，可以100％消除肿瘤，并实现无进展生存。总之，这些结果证明，GSK3β对活化的CAR-T细胞的这种类佐剂抑制作用提供了针对实体肿瘤实施CAR-T免疫疗法的有效方法。

本发明的实施例中的数据进一步证明，GSK3β抑制在成功调控CAR-T细胞功能中起着重要作用。令人惊讶的是，人们发现活性受限于抗原特异性CAR-T细胞或那些被抗原或配体活化的CAR-T细胞。GSK3β抑制不仅在活化的CAR-T的增殖中起作用，而且还促进了CD8+CAR-T效应记忆(TEM)的产生。结果证明，GSK3β抑制利用了增加细胞***和增加抗原特异性CAR-T的存活的联合效果；然而，GSK3β抑制对未被活化的CAR-T细胞没有增殖效果；GSK3B抑制对缺乏IL13CAR表达的未转导的T细胞也没有任何影响。这些观察结果证实了GSK3β抑制的增殖效果对活化的CAR-T是特异性的。

在本发明的各种实施方式中，GSK3β抑制导致肿瘤保护增强持续较长时间。在本发明的各种实施方式中，GSK3β抑制导致免疫记忆提高并产生扩增和/或增殖的CAR-T细胞。此外，GSK3β抑制的抗原特异性CAR-T对实验性异种移植动物进行的研究表明，经GSK3B抑制剂处理的CAR-T细胞具有更长的肿瘤保护时间，这表明扩增和/或增殖的CAR-T细胞具有免疫记忆。这些研究指出了一种迄今尚未被发现的选择性扩增抗原特异性CAR-T细胞亚群的方法。

因此，本发明涉及以下非限制性实施方式：

在各种实施方式中，本发明涉及一种用于调控T细胞的方法，其包括使T细胞与GSK3β抑制剂接触。在一些实施方式中，GSK3β抑制剂是小分子化学试剂，例如SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、1-azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)和TWS-119。在一些实施方式中，GSK3β抑制剂是遗传试剂，例如通过使用例如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA分子(siRNA)、DNA定向的RNA干扰(ddRNAi)寡核苷酸、或对GSK3β具有特异性的反义寡核苷酸、以及GSK3β的显性负等位基因(GSK3DN)来进行的RNA干扰(RNAi)。优选地，抑制剂抑制人GSK3β，例如人GSK3β变体1(GENBANK中的mRNA序列：NM_002093；蛋白质序列：NP_002084)，人GSK3β变体2(GENBANK中的mRNA序列：NM_001146156；蛋白质序列：NP_001139628)或人GSK3β变体3(GENBANK中的mRNA序列：NM_001354596；蛋白质序列：NP_001341525)。在一些实施方式中，GSK3β抑制包括例如通过靶向敲除来删除或破坏GSK3β。在一些实施方式中，调控增加了T细胞的扩增、增殖、存活和/或减少了活化的T细胞的衰竭。

可以通过前述方法来调控任何类型的T细胞，包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞(stem-likememory T cells))或效应记忆T细胞(例如TEM细胞和TEMRA细胞))、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、天然杀伤性T细胞、黏膜相关恒定T细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞(TIL)和CAR-T细胞。优选地，T细胞是辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞或γδT细胞。特别地，T细胞是CAR-T细胞。在特别优选的实施方式中，T细胞是活化的CAR-T细胞。如本领域已知的，通常使用抗原刺激来活化CAR-T细胞，并且从这种过程获得的CAR-T细胞是抗原特异性的，例如，对肿瘤抗原(例如白介素13受体(IL13R)或其变体)具有特异性。

在各种实施方式中，T细胞不是记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞(stem-like memory T cells))或效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞))。

本发明进一步涉及已经通过前述方法调控的T细胞，其中，例如通过使用如上所述的化学试剂或遗传抑制剂来抑制GSK3β的表达或活性。优选地，与野生型或正常T细胞相比，T细胞具有抑制的GSK3β表达或活性。特别优选地，与野生型或正常T细胞相比，T细胞显示出降低的GSK3β活性。特别地，由于通过使用siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3显性负抑制剂(GSK3DN)进行的RNA干扰，与野生型或正常T细胞相比，该T细胞展示出降低的GSK3β活性。

在一些实施方式中，本发明涉及已经根据本发明的方法调控或修饰的T细胞的使用。在本文中，调控的T细胞可用于治疗任何疾病或认为过继转移T细胞有益的疾病，包括例如癌症的治疗，病原性感染(例如，诸如HIV的病毒性疾病，细菌感染，原生动物感染)的治疗，炎性疾病(例如类风湿性关节炎或克罗恩氏病)的治疗，并且还可用于增强免疫系统。

在各种实施方式中，本文公开的方法可以用于治疗癌症。本文所使用的术语“癌症”涵盖任何癌症，包括但不限于：黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤，诸如脑癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和结肠癌之类的癌，以及白血病。在各种实施方式中，本文公开的方法可以用于***。在各种实施方式中，肿瘤是实体肿瘤。在各种实施方式中，实体是胶质母细胞瘤。

在各种实施方式中，肿瘤表达肿瘤相关抗原。此类抗原的实施例包括癌胚胎抗原(例如甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA))，表面糖蛋白(例如CA-125和间皮素)，癌基因(例如Her2)，黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT)，GP100和MART1)，癌症测试抗原(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)，病毒癌基因(例如HPV E6和E7)，在肿瘤中异位表达的蛋白(其通常局限于胚胎或胚外组织，例如PLAC1、由GBM肿瘤细胞表达但在大脑和表皮生长因子受体(EGFR)中不存在的ECM蛋白纤维蛋白3)。如本领域技术人员所理解的，由于一种或多种抗原可以特别适合用于治疗某些癌症，因此可以基于待使用本发明的方法治疗的癌症的类型来选择抗原。例如，对于黑素瘤的治疗，可以使用与黑素瘤相关的抗原，例如DCT。

在各种实施方式中，嵌合抗原受体蛋白包含白介素13或其变体或其片段(IL13CAR-T)。在各种实施方式中，核酸编码白介素13变体IL13.E13K.R109K或其片段。在各种实施方式中，核酸编码白介素13的片段，该片段包含与白介素13受体或其胞外结构域结合的结构域、或包含白介素13受体或其胞外结构域的融合蛋白。在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体(IL13R)或其变体。在各种实施方式中，肿瘤抗原包含白介素13受体(IL13Rα)或其变体的阿尔法(α)链。在各种实施方式中，嵌合抗原受体蛋白包含能够靶向纤维蛋白3的细胞外结构域。

在本文公开的各种实施方式中，嵌合抗原受体(CAR)针对肿瘤相关抗原。在各种实施方式中，基于待通过本文公开的方法治疗的患者所表达的肿瘤抗原的类型来选择所设计的被CAR靶向的肿瘤相关抗原。

在优选的实施方式中，本发明涉及用于调控已被肿瘤(例如，肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)激发的T细胞的方法和组合物，所述T细胞在被调控后可有利地应用于杀死肿瘤细胞。优选地，将被调控的T细胞自体转移至宿主以促进破坏肿瘤细胞。

在特别优选的实施方式中，本发明涉及用于产生记忆T细胞的方法和组合物，其可用于进行上述治疗应用中的一种或多种。

在相关的实施方式中，本发明涉及一种用于体外扩增T细胞的方法，其包括：从受试者体内分离出包含T细胞的样品；使用编码包含与肿瘤抗原结合的分子的嵌合抗原受体蛋白的核酸转导T细胞；使转导的T细胞与GSK3β抑制剂和肿瘤抗原接触以扩增转导的T细胞。优选地，使用编码包含白介素13(IL13 CAR-T)或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白的核酸转导T细胞。特别地，核酸编码包含白介素13变体IL13.E13K.R109K或其片段的CAR。

在相关的实施方式中，本发明涉及一种用于体外扩增T细胞的方法，其包括：从受试者体内分离出包含T细胞的样品；使用编码白介素13片段的核酸转导T细胞，该片段包含与白介素13受体或其胞外结构域结合的结构域、或包含白介素13受体或其胞外结构域的融合蛋白；使转导的T细胞与GSK3β抑制剂和肿瘤抗原接触以扩增转导的T细胞。优选地，肿瘤抗原包含白介素13受体(IL13R)或其变体。特别地，肿瘤抗原包含白介素13受体的阿尔法(α)链(IL13Rα)或其变体的阿尔法(α)链。GSK3β抑制剂可以是GSK3β的小分子抑制剂或遗传抑制剂，包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi、或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。优选地，GSK3β抑制剂是小分子GSK3β抑制剂，例如SB216763、TWS-119、1-Azakenpaullone或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。在各种实施方式中，可以同时或顺序地活化和扩增T细胞，例如，活化后扩增或扩增后活化。

在各种实施方式中，本发明涉及一种用于在有此需要的受试者中***的方法，其包括：向受试者施用有效量的组合物，该组合物包括多个表达嵌合抗原受体蛋白的活化和/或扩增的T细胞(CAR-T)，该嵌合抗原受体蛋白包含与肿瘤抗原结合的分子，其中，所述活化包括使CAR-T细胞与肿瘤抗原接触，所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与GSK3β抑制剂接触。例如，在一些实施方式中，活化的CAR-T细胞优选表达嵌合抗原受体蛋白，并且嵌合抗原受体蛋白与肿瘤抗原结合。在各种实施方式中，T细胞是自体T细胞。特别地，肿瘤抗原是白介素13受体(IL13R)或其配体结合结构域，并且嵌合抗原受体蛋白包含例如与肿瘤抗原IL13R(α1或α2)结合的Il13或其变体或其片段。在各种实施方式中，GSK3β抑制剂可以是GSK3β的小分子抑制剂或遗传抑制剂，包括siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi、或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。优选地，GSK3β抑制剂是小分子GSK3β抑制剂，例如SB216763、1-Azakenpaullone、6-溴靛红-3’-肟(BIO)或TWS-119。在各种实施方式中，可以同时或顺序地活化和扩增T细胞，例如，活化后扩增或扩增后活化。

在各种实施方式中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者体内的肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的组合物，该组合物包含多个表达嵌合抗原受体蛋白的活化和/或扩增的自体T细胞(CAR-T细胞)，该嵌合抗原受体蛋白包含IL13变体IL13.E13K.R109K，其中，所述活化包括使CAR-T细胞与肿瘤抗原接触，所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与小分子GSK3β抑制剂接触，例如，SB216763、1-Azakenpaullone、6-溴靛红-3’-肟(BIO)或TWS-119，其中，所述活化的CAR-T细胞表达嵌合抗原受体蛋白，并且其中，所述嵌合抗原受体蛋白与肿瘤抗原结合。在各种实施方式中，可以同时或顺序地活化和扩增T细胞，例如，活化后扩增或扩增后活化。

在各种实施方式中，本发明提供一种治疗有此需要的受试者体内的神经胶质瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的组合物，该组合物包含多个表达嵌合抗原受体蛋白的活化和/或扩增的T细胞(CAR-T细胞)，所述嵌合抗原受体蛋白包含与肿瘤抗原结合的分子，其中，所述活化包括使CAR-T细胞与肿瘤抗原接触，所述扩增包括使活化的CAR-T细胞与GSK3β抑制剂接触。在该实施方式中，活化的CAR-T细胞优选表达嵌合抗原受体蛋白，并且该嵌合抗原受体蛋白结合在神经胶质瘤中表达的肿瘤抗原，例如IL13R或其变体。在各种实施方式中，神经胶质瘤是多形胶质母细胞瘤(GBM)、间变性星形细胞瘤或小儿神经胶质瘤。在一些实施方式中，活化包括使CAR-T细胞与神经胶质瘤肿瘤抗原接触，并且扩增包括使活化的CAR-T细胞与小分子GSK3β抑制剂接触，其中活化的CAR-T细胞表达与胶质瘤肿瘤抗原结合的嵌合抗原受体蛋白。GSK3β抑制剂可以是小分子抑制剂或遗传抑制剂。在一些实施方式中，GSK3β抑制剂是小分子，例如SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。可选地或另外地，GSK3β抑制剂是遗传试剂，其包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。

在各种实施方式中，本发明涉及一种用于产生肿瘤特异性记忆T细胞的方法，其包括：使用编码嵌合抗原受体(CAR-T)的核酸转导从受试者的生物样品中分离的T细胞，所述嵌合抗原受体包含与肿瘤抗原结合的分子；使CAR-T细胞与所述肿瘤抗原和GSK3β抑制剂接触；检测记忆细胞特异性的第一标志物和肿瘤抗原特异性的第二标志物，从而产生肿瘤特异性记忆T细胞。优选地，使用编码IL13或其片段或其变体(例如IL13.E13K.R109K)的核酸转导CAR-T细胞，其中，CAR蛋白与包含IL13受体或配体结合结构域的肿瘤抗原结合。在各种实施方式中，活化包括使CAR-T细胞与肿瘤抗原接触，并且扩增包括使活化的CAR-T细胞与小分子GSK3β抑制剂接触，所述小分子GSK3β抑制剂例如SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。在一些实施方式中，所述记忆细胞特异性的标志物选自CD45RO+和CD45RA+，并且所述肿瘤抗原特异性的标志物包含与所述肿瘤抗原结合的蛋白质的表达(例如细胞表面表达)。在各种实施方式中，肿瘤特异性CAR-T细胞对IL13R阳性肿瘤细胞具有特异性，如通过功能试验所确定的，所述特异性包括与IL13R阳性细胞结合和任选地破坏IL13R阳性细胞。在各种实施方式中，肿瘤特异性记忆细胞是CD8+T细胞。在一些实施方式中，通过肿瘤抗原活化CAR-T细胞并在GSK3β抑制剂存在的条件下扩增CAR-T细胞，进一步选择该CAR-T细胞中的记忆T细胞，其显示出对表达肿瘤抗原的肿瘤细胞的特异性和记忆性增加。

在各种实施方式中，本发明提供一种用于产生肿瘤特异性记忆T细胞的方法，该方法包括：使用编码嵌合抗原受体的核酸转导从受试者的生物样品中分离的T细胞(CAR-T)，所述嵌合抗原受体包含与肿瘤抗原结合的分子；使CAR-T细胞与肿瘤抗原和GSK3β抑制剂接触；检测记忆细胞特异性的第一标志物、肿瘤抗原特异性的第二标志物和记忆CAR-T细胞稳态的第三标志物；从而产生肿瘤特异性记忆T细胞。在一种实施方式中，第三标志物是CAR T细胞中的IL13R表达、T-bet表达和/或PD-1表达，其中，增加的T-bet表达和/或减少的PD-1表达表明CAR-T细胞稳态得到改善。特别地，该方法提供了改善的T细胞稳态，其包括T细胞衰竭减少、持续的细胞因子表达、T细胞克隆维持和/或促进CAR-T记忆发育。

在各种实施方式中，本发明涉及一种使用前述转导、活化、扩增和任选的选择步骤来调控T细胞的方法，其中所述CAR-T细胞被肿瘤抗原活化并在GSK3β抑制剂存在下进行扩增，进一步从该CAR-T细胞中选择记忆T细胞，其表现出对表达肿瘤抗原的肿瘤细胞的特异性提高并且记忆性得到改善，并且还显示出CAR-T细胞稳态得到改善。特别地，该方法提供了具有改善的T细胞稳态的活化的CAR-T细胞的扩增的群，该T细胞稳态包括T细胞衰竭减少、持续的细胞因子表达、T细胞克隆维持和/或促进CAR-T记忆发育。

在各种实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含表达嵌合抗原受体蛋白质的T细胞(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂。优选地，T细胞表达包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白(IL13 CAR-T)。特别地，T细胞表达包含白介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白。

在各种实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含表达嵌合抗原受体蛋白的T细胞(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂，其中所述嵌合抗原受体蛋白与肿瘤抗原结合。优选地，T细胞表达包含白介素13或其变体或其片段的嵌合抗原受体蛋白(IL13 CAR-T)。特别地，T细胞表达包含白介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白。

在各种实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含表达嵌合抗原受体蛋白的T细胞(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂。在一些实施方式中，所述组合物包含CAR-T细胞和小分子GSK3β抑制剂，例如SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。可选地或另外地，所述组合物包含CAR-T细胞和遗传试剂，所述遗传试剂包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。

在各种实施方式中，本发明提供一种单独施用的制剂，其包含表达嵌合抗原受体蛋白的T细胞(CAR-T细胞)和GSK3β抑制剂。优选地，GSK3β抑制剂是小分子GSK3β抑制剂，例如，SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。可选地或另外地，所述制剂包含遗传试剂，所述遗传试剂包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。

在各种实施方式中，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒在一个或多于一个包装中包括：编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸构建体，其编码白介素13(IL13CAR-T)或其变体或片段；GSK3β抑制剂；任选地包含用于通过所述CAR核酸构建体转导T细胞的第一试剂；以及进一步任选地包含用于活化T细胞的第二试剂。优选地，所述试剂盒包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸构建体；GSK3β抑制剂；通过所述CAR核酸构建体转导T细胞的第一试剂；用于活化T细胞的第二试剂。在该实施方式中，第一试剂是逆转录病毒载体。更进一步地，在该实施方式中，第二试剂是IL13Rα2-Fc。特别地，试剂盒中包括的核酸构建体编码包含白细胞介素13变体IL13.E13K.R109K的嵌合抗原受体蛋白，试剂盒中包括的GSK3β抑制剂是SB216763、1-Azakenpaullone、TWS-119或6-溴靛红-3’-肟(BIO)。可选地或另外地，试剂盒包含GSK3β遗传抑制剂，其包含siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、ddRNAi或GSK3的显性负抑制剂(GSK3DN)。

实施例

本文所述的结构、材料、组合物和方法旨在作为本发明的示例性实施例，应当理解，本发明的范围不受实施例范围的限制。本领域技术人员将认识到，本发明可以通过对所公开的结构、材料、组合物和方法的变化来实现，并且这些变化被视为在本发明的范围内。

实施例1

选择CAR-T

将IL13修饰为IL13.E13K.R109K增加了IL13分子对IL13Rα2的亲和力。

已有研究表明，由作为胞外配体结合结构域的IL13.E13K.R109K(IL13CAR-T)和细胞内CD28协同刺激结构域(IL13CAR-T)组成的第二代CAR能够成功地诱导针对表达IL-13Rα2的U251MG人类神经胶质瘤细胞系的特异性细胞毒性反应，并在异种移植神经胶质瘤小鼠模型中成功地消除原位肿瘤。此外，已在实验中证实了IL13CAR-T对IL-13Rα2的绝对特异性，其中，当在丝裂霉素-C处理的(每5x10⁶个细胞/ml 50μg/ml，在37℃下持续20分钟；Sigma，St.Louis，MO)U251MG胶质瘤细胞(T细胞与肿瘤细胞的比例不同)存在的条件下活化IL13CAR-T时，或随着IL13Rα2-Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN)的浓度增加时，IL13CAR-T显示出CAR富集以及IL13CAR-T增殖。当用浓度逐渐增加的IL13Rα1-Fc嵌合体(高达10μg/ml的纯化配体)处理IL13CAR-T细胞时，没有观察到类似结果(图1-补充)。因此，IL13CAR-T是该研究选择的嵌合抗原受体(CAR)。

IL13CAR逆转录病毒的产生和人原代T细胞的修饰

如前所述，制备含有表达IL13CAR的病毒颗粒的逆转录病毒上清液并分离外周血单核细胞(PBMC)(Beaudoin et等人，J Virol Methods 148:253-259,2008)。用OKT3(100ng/ml；Orthoclone)和IL2(Proleukin，3000IU/ml；Prometheus Laboratories，SanDiego，CA)对PBMC进行活化48小时。

使用“旋转感染(spinfection)”技术，用逆转录病毒上清液转染富集的T细胞(Kong等人，Clin Cancer Res 18:5949-5960,2012)。对转染的PBMC进行IL13CAR表达测试(图2-补充)，并在含有10％FBS(Sigma,St.Louis MO)、抗生素和IL2的RPMI-1640培养基中(Invitrogen,Grand Island,NY)培养，得到10-20倍扩增并且纯度>95％的T细胞。活化的未转导的T细胞被用来作为所有实验中的对照组。

监测在CAR-T细胞扩增过程中产生的T细胞类型的实验显示CD8富集。IL13Rα2-Fc对IL13CAR-T细胞的活化以及GSK3β抑制也显示出持续的CD8富集的表型。此外，用GSK3β抑制剂处理的活化的IL13CAR-T细胞的IFNG基因表达增加了7.5倍，干扰素-γ(IFNγ)分泌增加了2倍(图3-补充)，这证实了CD8在IL13CAR-T细胞中富集。

为了减轻供体的差异性，根据IL13CAR表达控制上述研究结果。

流式细胞计数分析

使用LSRII仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)和FACSDiva软件(版本6.2；BDBiosciences)进行流式细胞计数分析。所有流式细胞计数数据均使用FlowJo软件(版本10.2；Flow Jo LLC,Ashland,OR)进行分析。

纯化的大鼠抗人IL13抗体和结合有别藻蓝蛋白(APC)的抗大鼠抗体用于测量IL13CAR的表达。在某些实验中，抗人CD3-FITC用于识别T细胞。为了对IL13CAR-T细胞进行CD4：CD8分析，将抗人CD4-FITC和抗人CD8-PE.Cy7用于IL13CAR表达阳性的CAR-T细胞中。分别通过抗人FasL-FITC(Thermo-Fisher)抗人PD1-FITC染色来测量活化的IL13CAR-T细胞上的FasL表达和PD-1表达。抗人CD127-FITC、抗人CD62L-PE、抗人CCR7-FITC、抗人CD45RO-PE和抗人CD45RA-PE.Cy7用于流式细胞计数测量T细胞记忆标志物。分别使用同种型对照或抗体对照(如果适用)为每个实验绘制阳性门。所有抗体均购自BD Biosciences或eBisociences。对于β-连环蛋白(β-catenin)定位的核内染色，使用FoxP3染色缓冲液(eBioscience-Affymetrix，San Diego，CA)，并用抗人β-连环蛋白兔单克隆抗体(CellSignaling Technologies，Danvers MA)和与Alexa Fluor(AF)488或647(Cell SignalingTechnologies)偶联的抗兔IgG进行染色，实现CAR-T细胞的核通透性。未使用FoxP3染色缓冲液进行核通透性处理的细胞在β-连环蛋白的表达方面未见任何变化。

通过流式细胞计数法，使用羧基荧光琥珀酰亚胺酯(CFSE；0.5μg/ml；Invitrogen)测量T细胞增殖。

T细胞存活试验

无论是否使用GSK3β抑制剂(SB216763，20μM；Sigma,St Louis,MO)或是否在培养基中添加IL2，在24孔板中添加未转导的T细胞，或在24孔板中用特定浓度的IL13Rα2-Fc嵌合体活化IL13CAR-T细胞(1×10⁶)。IL13CAR-T细胞存活试验按上述方法进行14天。通过使用活死门控法的流式细胞计数法测量GSK3β抑制后的IL13CAR-T细胞的长期存活率(Sengupta等人，Immunobiology 210:647-659,2005)。通过流式细胞计数法读取活化的IL13CAR-T细胞上的FasL表达(FITC；Thermo-Fisher)来测量活化T细胞死亡(ATCD)。

定量PCR(qPCR)

根据生产厂商的操作规程(Qiagen)，使用RNeasy微型试剂盒从IL13CAR-T细胞中分离出总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad，Carlsbad,CA)从RNA制备cDNA。使用SyBR Green PCR master Mix(Applied Biosystems)对靶定的IFNG，TBX21和PDCD1基因进行qPCR。将靶基因的C_T值经管家基因GAPDH标准化，并且使用ΔΔC_T方法计算相对基因表达。

ELISA

从IL13CAR-T提取培养物上清液，用IL13Rα2-Fc±SB216763活化72小时，并根据生产厂商的操作规程使用现成的(Ready-Set-Go)ELISA检测试剂盒(eBiocience，USA)通过ELISA检测干扰素-γ(IFNγ)水平。使用(Biotek，USA)测量OD值。未活化的IL13CAR-T细胞或仅用SB216763处理的细胞作为实验对照。IL13CAR-T细胞分泌的IFNγ的浓度是使用测得的OD值从相应实验设置绘制的标准曲线中外推得出的。

体内免疫再激发研究

六周大的雄性无胸腺裸鼠购自JAX Mice(ME，Bar Harbor，ME)。所有小鼠均被安置在罗杰·威廉姆斯医学中心的特定无病原体设施中，根据联邦和机构指南并在罗杰·威廉姆斯医学中心机构动物护理和使用委员会的批准下进行实验。

随机选择四十五只动物，其中40只动物植入肿瘤细胞，5只作为实验对照。每只小鼠的左后肢的上侧面通过皮下注射悬浮在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2×10⁶个表达IL13Rα2的U251MG人神经胶质瘤细胞。肿瘤植入后7天，将荷瘤小鼠随机分为5组，分别用50μlPBS中的5×10⁶个IL13CAR-T细胞(40％修饰；n＝10)；或用IL13Rα2-Fc嵌合体活化的5×10⁶个IL13CAR-T(n＝10)；或用IL13Rα2-Fc嵌合体+SB216763活化的5x10⁶个IL13CAR-T(n＝10)；或5x10⁶个未转导的T细胞(n＝5)；或仅PBS(n＝5)进行治疗。观察动物的肿瘤生长、全身和神经毒性，并记录死亡情况。

在CAR-T治疗后六十天，在原始肿瘤植入的相对侧，皮下注射200μlPBS中的2x10⁶个U251MG神经胶质瘤细胞，对存活的动物进行再激发。在第100天，实验结束，对存活的动物实施安乐死。从每只动物收集肿瘤组织、引流***(腹股沟)和脾脏，用流式细胞计数法分析肿瘤浸润的IL13CAR-T和T细胞记忆标志物。

实验结果证明：

在没有补充IL2的情况下，GSK3β抑制可保护活化的CAR-T细胞免于活化T细胞死亡(ATCD)的影响

IL13CAR-T细胞(32％CAR+)在可溶性IL13Rα2-Fc(1μg/ml)和GSK3β抑制剂(SB216763；20μM)存在下，在添加或不添加IL2的补充有10％FBS和抗生素的RPMI1640培养基中培养14天。第1、4、7、10和14天收获细胞，并对IL13CAR-T细胞进行染色以进行CD3和IL13CAR的表达，如前所述的那样，通过流式细胞计数法测量细胞的存活率，并分析其存活率。在缺乏SB216763的情况下，IL13Rα2-Fc处理后显示出存活率的稳定下降，这表明活化的T细胞死亡(图1A；上图；空心正方形)。通过在培养环境中添加IL2(图1A；上图；实心正方形)或在没有添加IL2的情况下用SB216763抑制GSK3β(图1A；下图；空心正方形)，损失的存活率被挽救。在存在SB216763的情况下，在培养环境中添加IL2对IL13CAR-T细胞的存活率并没有累加或协同作用(图1A；下图；实心正方形)。这表明在活化的CAR-T细胞中抑制GSK3β促进存活信号传导，并表明在没有补充IL2的情况下，GSK3β抑制可以保护活化的CAR-T细胞不受ATCD的影响。为证实该现象，在第14天，在IL13Rα2-Fc处理的CAR-T细胞中测量了FasL表达。观察得出的结论是，与未使用抑制剂处理的活化CAR-T细胞(55％)相比，SB216763处理使活化的CAR-T细胞(25.3％)中的FasL表达降低了55％，这证明GSK3β抑制确实保护了活化的CAR-T细胞不受ATCD(图1B)的影响。本研究中的所有其他实验都是在培养环境中没有添加IL2的情况下进行的。

为了进一步理解其机制，用CFSE染色CAR-T细胞，并在没有刺激或用IL13Rα2-Fc±SB216763处理的情况下培养72小时。CFSE是一种荧光细胞染色染料，由于其染色的每个细胞***后子细胞内的CFSE荧光逐渐减半，因此CFSE可用于体外和体内监测淋巴细胞增殖(Lyons et等人，Journal of immunological methods 171:131-137,1994)。GSK3β抑制仅引起IL13Rα2-Fc活化的CAR-T细胞的增殖提高，而对未刺激的CAR-T细胞没有这种作用(图1C)。这些结果表明，GSK3β抑制可使IL13Rα2活化的IL13CAR-T细胞的扩增增加，这是活化的CAR-T细胞的增殖增加和存活提高的结果。

T-bet介导活化的CAR-T细胞中PD-1表达的降低

GSK3抑制降低了PD-1介导的T细胞衰竭，这取决于T-bet表达(Taylor等人,Immunity 44:274-286.2016)，并且GSK3β通路直接调节活化的T细胞中的T-bet表达(Verma等人，J Immunol 197:108-118,2016)。GSK3β抑制在活化的T细胞中具有显着的存活优势，这促使我们研究IL13Rα2活化的IL13CAR-T细胞中T-bet和PD-1的表达。活化的IL13CAR-T细胞的FACS分析显示出T-bet表达的显著上调(图2A，左图)，与未经SB21673处理的IL13CAR-T细胞(43％；图2A，右图)相比，IL13CAR-T细胞在GSK3β抑制后PD-1表达降低了60％(17.3％)。qPCR分析显示，GSK3β抑制后，TBX21基因增加90倍(图2B，左图)，PDCD1基因降低5倍(图2B，右图)，这证实了GSK3β抑制诱导T-bet介导的活化的CAR-T细胞中PD-1表达降低。

GSK3β抑制导致β-连环蛋白在活化的CAR-T细胞的细胞核内积累增加

通过实验了解了GSK3β抑制在活化的T细胞扩增方面的分子机制。通过保护β-连环蛋白降解，GSK3β抑制活化了Wnt信号传导通路(Lyons等人,Journal of immunologicalmethods 171:131-137,1994)。此前已显示出，在小鼠T细胞存活模型中，通过增加核β-连环蛋白的表达，GSK3β抑制提高了活化的T细胞的存活(Sengupta等人,J Immunol 178:6083-6091,2007)。使用SB216763处理IL13Rα2-Fc活化的CAR-T细胞36-48小时或不使用SB216763处理IL13Rα2-Fc活化的CAR-T细胞，并通过流式细胞计数法测量β-连环蛋白的核内积累。与未经SB216762处理的细胞相比，GSK3β抑制导致活化的CAR-T细胞核中β-连环蛋白(MFI1618)的积累增加了66％。(MFI 974；图3)。

GSK3β抑制和活化的CAR-T细胞记忆生成

最近的研究表明，β-连环蛋白的核内积累在CD8+记忆T细胞的发育中发挥作用(Gattinoni等人,Nat Med 15:808-813,2009；Taylor等人,Immunity 44:274-286.2016；Verma等人,J Immunol 197:108-118,2016)。进行实验测试SB216763处理对IL13Rα2-Fc活化的IL13CAR-T细胞群的记忆产生的影响。在存在或不存在SB216763的情况下，用浓度递增的IL13Rα2-Fc(0-1μg/ml)活化IL13CAR-T细胞7天。通过流式细胞计数法测量T细胞记忆标志物的细胞表面表达。由于记忆的产生是作为CD8+T细胞的功能衍生物进行监测的，因此进行了额外的实验以测量IL7R的细胞内表达(CD127)，作为CD8+记忆CAR-T细胞稳态的标志物。流式细胞计数法的数据分析显示，经过SB216763处理后，活化的IL13CAR-T细胞中CD127增加10倍(图4A，图4B，顶部图)，CD45RO增加4倍(图4A，图4B，第三张图)。该观察结果表明，GSK3β抑制诱导的核内β连环蛋白积累促进了活化CAR-T细胞中抗原特异性CD8⁺效应T记忆表型的稳态增殖。然而，CCR7(图4A，图4B，第二张图)和CD45RA(图4A，图4B，第四张图)之间没有差异，CD62L表达的完全抑制(图4A，图4B，底部图)表明在GSK3β抑制的抗原特异性CAR-T细胞中发育出细胞中央记忆表型。

人神经胶质瘤异种移植物的肿瘤再激发实验以及SB216763处理的活化CAR-T细胞的体内记忆发育

进行研究以测试GSK3β抑制在异种移植神经胶质瘤小鼠模型中的活化CAR-T细胞中的免疫再激发效应。如材料&方法中所述的那样建立实验。在用PBS治疗的荷瘤动物[中位生存期(MS)32天]中或用未转导的T细胞治疗的荷瘤动物(MS 42天)中，肿瘤快速生长，按照批准的IACUC操作规程对动物实施安乐死。在接受CAR-T细胞(无论其活化状态如何)治疗的动物组中，肿瘤迅速消退，无进展生存期延长。这反映出了先前观察到的类似模式(Kong等人,Clin Cancer Res 18:5949-5960,2012)。对那些在植入后存活超过60天的荷瘤动物，在原植入物的另一侧再次注射一次U251MG肿瘤细胞。监控肿瘤生长和动物存活，并在植入后第100天按照批准的IACUC操作规程结束实验。测量各个实验组的MS和总存活率。在实验结束时，用未活化的IL13CAR-T治疗的荷瘤动物组的复发率为100％，而用IL13Rα2-Fc活化的CAR-T治疗的荷瘤动物组的复发率为67％。用IL13Rα2-Fc+SB216763活化的IL13CAR-T治疗的组中所有存活的动物均无肿瘤(复发率为0％)。用IL13Rα2-Fc+SB216763体外活化的IL13CAR-T治疗的动物组的MS为76.5天。在该组中，十只动物中有4只存活，并且所有存活的动物(4只中的0只)都没有肿瘤。

实验动物中CAR-T细胞记忆的产生

从上述每个存活动物中收集肿瘤(如有)，引流腹股沟***和脾脏。从各个器官制备单细胞悬浮液，并测试单细胞悬浮液中的CAR-T细胞的组织分布和免疫记忆标志物的表达。细胞被人CD3和IL13CAR(IL13CAR-T；图5A)染色。流式细胞计数分析显示，在未活化的IL13CAR-T治疗组(空心圆圈)中，有58％的引流***细胞(引流LN)，65％的脾脏细胞和48％的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)为IL13CAR-T+。在仅用经IL13Rα2-Fc体外活化的IL13CAR-T进行治疗的动物组(实心圆圈)中，有75％的引流LN和TIL和65％的脾脏细胞为IL13CAR-T+。在用经IL13Rα2-Fc+SB216763体外活化的IL13CAR-T进行治疗的动物中，只有30％的引流LN和70％的脾脏细胞对IL13CAR-T染色呈阳性(灰色圆圈)。由于该组中的所有动物均无肿瘤，因此无法研究TIL。IL13CAR-T细胞上的CD45RO+CD127+的流式细胞计数分析(图5B)显示，在使用未活化的IL13CAR-T治疗的组中和仅用经IL13Rα2-Fc体外活化的IL13CAR-T进行治疗的组中，抗原特异性CD8+效应T记忆的发生频率极低(<1-2％)。在使用通过IL13Rα2-Fc+SB216763体外活化的IL13CAR-T治疗的动物中，从引流LN(10％)和脾脏(14％)采集的IL13CAR-T细胞上观察到相对较高比例的抗原特异性CD8+效应T记忆表达。顺便提及，在实验结束时，在外周淋巴组织中具有较高的记忆标志物表达的治疗组也是动物无肿瘤的治疗组。

其他实施方式：通过由说明书中其他地方笼统或具体描述的反应物和/或操作条件替换前述实施例中使用的反应物和/或操作条件，可以基本成功地重复前述实施例。

示例性的实施方式利用淋巴细胞，例如包含IL13CAR构建体(例如IL13.E13K.R109K)的T细胞。关于此类构建体的核酸序列和/或氨基酸序列的详细内容(包括使用编码该构建体的核酸转导T细胞的方法)请参见Sengupta等人的美国专利US9,650,428和国际公布WO 2016/089916，其所公开的全部内容(包括附图、序列表和示出各种构建体的相对结构的表格)通过引用并入本文。

示例性实施方式利用GSK3β抑制剂来改善T细胞的功能，具体而言，改善包含嵌合抗原受体构建体(例如，IL13.E13K.R109K)的CAR-T细胞的功能。本发明不限于出于此目的而应用SB216763((3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3基)-1H-吡咯-2,5-二酮))(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,USA)。其他合适的GSK-3β抑制剂包括但不限于：锂，GF109203X(2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺)，1-Azakenpaullone((Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)；6-溴靛红-3’-肟(BIO)(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)；RO318220(2-[1-(3-(氨基硫脲)丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1-甲基吲哚-3-基)马来酰亚胺甲磺酸酯)；TWS-119((3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]苯酚；CAS#601514-19-6)；Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA)；SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)(GlaxoSmithKline,London,United Kingdom)；4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(“TDZD-8”)(Axxora,San Diego,CA,USA)；2-硫代(3-碘苄基-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-恶二唑(“TIBPO”)(Axxora,San Diego,CA,USA)；2,4-二苄基-5-恶噻二唑烷-3-硫酮(“OTDZT”)(Axxora,San Diego,CA,USA)；和4-(2-氨基-4-氧代-2-咪唑啉-5-亚烷基)-2-溴-4,5,6,7-四氢吡咯并[2,3-c]氮杂环-8-酮(10Z-Hymenialdisine)(Axxora,San Diego,CA,USA)。此外，许多针对GSK-3β的单克隆抗体可从Axxora购得。GSK-3β的其它药理学抑制剂可参见Meijer等人,“Pharmacological Inhibitors of Glyocogen Synthase Kinase 3,TrendsPharmacol Sci.2004Sep；25(9):471-80(PUBMED#15559249)，其全部内容通过引用并入本文。还可参见李等人的美国专利公开US2007-0196514。

尽管在示例性实施方式中，由于先前成功的临床前研究(Kong等人,Clin CancerRes 18:5949-5960,2012)，IL13CAR-T已被用作候选CAR，但本发明不限于该示例性实施方式。所公开的方法可以应用于针对实体肿瘤的任何CAR-T疗法，其中CAR-T细胞对肿瘤抗原的接触受到限制，导致免疫反应较弱。此类肿瘤的代表性实施例包括，例如，多形性胶质母细胞瘤(GBM)，间变性星形细胞瘤和小儿神经胶质瘤。

在以上示例性的实施方式中，研究了CAR-T对例如多形性胶质母细胞瘤(GBM)等高变异性肿瘤的活性。GBM是研究实体肿瘤抗原呈递的良好模型。本发明公开的实施例部分研究了CAR-T细胞的活化、增殖和成功的记忆生成。在例如GBM的高变异性肿瘤中，抗原谱的不可预测性在包括CAR-T治疗在内的任何免疫治疗方案的成败中起着重要作用，可以通过靶向多种肿瘤抗原来解决这一问题。可选地和/或另外地，可以使用多种GBM新抗原，包括基于例如特定患者或患者类别的表达水平而选择用于个性化治疗的抗原。

尽管科学文献通常指出CAR-T细胞对实体肿瘤(例如GBM)中的抗原的暴露较弱，但GSK3β抑制剂的使用带来了强CAR-T细胞增殖，这与对照组相比意义重大，并且在肿瘤治疗方面也令人惊讶。结果表明，经SB216763处理的活化CAR-T细胞的增殖能力增强，在GSK3β抑制剂存在的情况下，经SB216763处理的活化CAR-T细胞存活时间长于未被活化的CAR-T细胞。向培养基中添加IL2不会影响GSK3β抑制的CAR-T细胞的存活。经SB216763处理的活化的IL13CAR-T细胞的存活率的增加受到这些T细胞中FasL的较低表达的影响，这证实了GSK3β的抑制可以保护活化的CAR-T细胞不受活化诱导的T细胞死亡(ATCD)的影响。然而，免于ATCD的影响不是GSK3β抑制给这些T细胞带来的唯一功能结果。如在这些细胞的CFSE谱图中所观察到的，用SB216763处理会导致活化的CAR-T细胞增殖增加。然而，在未活化的CAR-T细胞中未观察到GSK3β抑制对T细胞增殖具有相似作用，这表明GSK3β抑制对活化的或抗原特异性的CAR-T细胞具有类佐剂效果。

另外，对活化的CAR-T细胞衰竭的研究表明，在用SB216763处理活化的IL13CAR-T细胞后，T-bet基因(TBX21)的表达增加了90倍，PD-1基因(PDCD1)的表达减少了5倍，蛋白质的表达也发生了相应的变化。这些观察结果对于设计针对例如GBM的实体肿瘤的免疫疗法具有重要意义。肿瘤浸润T细胞(包括治疗性CAR-T细胞)上高水平的PD-1标记了衰竭的T细胞的子集，其由于增殖功能、细胞溶解性和细胞因子产生的能力受损而效应功能减弱。主要通过靶向PD-1或PD-L1(在靶细胞上表达)的单克隆抗体阻断PD-1通路而使T细胞免于衰竭。目前正在进行多项临床试验，其中，正在测试PD-1/PD-L1靶向免疫疗法以及与其他免疫疗法和放射疗法相结合的免疫疗法对GBM的治疗(Maxwell等人,Curr Treat Options Oncol18:51,2017；Luksik等人,Neurotherapeutics,doi:10.1007/s13311-017-0513-3,Mar 3,2017)。因此，本发明的实施方式提供了针对GBM的成功的CAR-T细胞免疫疗法，包括例如通过抑制GSK3β来降低T细胞上PD-1的表达。这样的策略可以提供减少T细胞(特别是活化和/或增殖的CAR-T细胞)衰竭的有效方法。

本文所述的实施方式报道了非常不同的CD62L阴性CAR-T细胞群，其也是CD45RO和T细胞稳态标志物IL7R或CD127(CD62L-CD45RO⁺CD127⁺)的高表达者。在活化的CAR-T细胞中，经GSK3β抑制后，未观察到CD45RA表达发生变化，这与以下事实一致，即人CD8⁺T细胞上的CD45RA表达取决于原始的抗原刺激。这些细胞是CCR7的低表达者，这清楚地表明了不同的CD8⁺T效应记忆(T_EM)的发育。在异种移植动物实验中，带有U251MG人胶质瘤细胞的小鼠用IL13CAR-T细胞进行治疗，该IL13CAR-T细胞：ⅰ)由IL13Rα2-Fc在体外被活化，ⅱ)由IL13Rα2-Fc+SB216763在体外被活化，iii)为未活化的IL13CAR-T细胞，或iv)为未转导的T细胞。采用肿瘤细胞对存活超过60天的动物进行再次激发。注射(体外活化或未体外活化)IL13CAR-T细胞的动物比未接受治疗或接受未转导的T细胞的动物更好地存活地(中位生存期42天vs76.5天)。然而，最重要的是，在实验结束时(100天)，在荷瘤组中所有接受GSK3β抑制的活化CAR-T细胞(IL13Rα2-Fc+SB216763体外)治疗的存活动物都没有肿瘤。其他存活组为100％复发(未活化的CAR-T)或67％复发(2/3；仅在体外经IL13Rα2-Fc活化)。体内CAR-T细胞记忆生成的分析显示，在注射有未经GSK3β抑制剂(仅IL13Rα2-Fc)处理的未活化或活化的CAR-T的荷瘤动物中，其引流***和脾脏中的CAR-T细胞的积累增加。与预期一致，这些CAR-T是CD45RO⁺IL7R⁺表型的低表达者。有趣的是，与接受未活化的CAR-T细胞的组相比，在用活化的CAR-T(仅IL13Rα2-Fc)治疗的组中观察到肿瘤浸润的IL13CAR-T细胞增加。这表明活化的CAR-T细胞的肿瘤清除效率提高，这也在与未活化的CAR-T细胞注射组中的100％的复发率相比活化的CAR-T细胞注射组中67％的复发率中反映出来。然而，在GSK3β抑制的CAR-T细胞(IL13Rα2-Fc+SB216763)治疗的荷瘤动物的***中观察到低水平的IL13CAR-T细胞，而在脾脏中却存在非常高水平的IL13CAR-T细胞。因为这些动物都没有肿瘤，因此在这些动物中没有观察到肿瘤浸润淋巴细胞。这些CAR-T细胞是CD45RO⁺IL7R⁺表型的高表达者，这与TEM细胞通常不存在于***中并且通常在脾脏和其他外周组织中积累这一事实相一致。这些体内结果表明，GSK3β抑制对抗原特异性CAR-T细胞具有类疫苗样作用。

免疫应答成功的标志是a)免疫系统对抗原产生有效应答，并且b)产生记忆以便将来识别同一抗原。示例性实施方式首次显示，GSK3β抑制通过减轻ATCD和增加抗原特异性CAR-T细胞中的增殖并通过给予针对实体肿瘤的成功的免疫应答所需的“免疫增强”来促进存活增加。显示CAR-T细胞衰竭减少的其他数据包括随后在实验动物中清除肿瘤，这满足第二标准，其中，通过降低PD-1表达，以及抗原特异性CAR-T细胞中GSK3β抑制后CD8⁺CAR-T_EM记忆产生而减少CAR-T细胞衰竭。GSK3β抑制对抗原处理过(antigen-experienced)的CAR-T细胞的类佐剂作用提供了本发明的组合物和方法(例如，GSK3β抑制剂与CAR-T)在癌症(更具体地，实体肿瘤)的免疫疗法中的应用以及肿瘤疫苗的开发。

此外，随着发现癌症新抗原的进展，可以修改本文所公开的实施方式以开发基于CAR-T细胞的新的肿瘤疫苗，所述CAR-T细胞可以疾病特异性或患者特异性的方式进行个性化。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定所述方法的本质特征，并且在不背离本发明的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管可使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料来实施或测试本发明，但是，在前述段落中还是描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，无意是限制性的。如有冲突，以本说明书所包括的定义为准。

本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的参考文献、文件、手稿、科学文献均通过引用并入本文。与本文引用的科学数据库(例如PUBMED、NCBI)有关的所有标识符和登录号均通过引用并入本文。

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