阅读说明：本技术 T细胞信号传导的miRNA调节及其应用 (MiRNA regulation of T cell signaling and uses thereof ) 是由 陈长征 C·玉 T·孙 H·拉克莱 于 2019-01-07 设计创作，主要内容包括：提供了使用过继细胞疗法治疗癌症的方法,其中T细胞被修饰以具有降低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性,并且具有改善的抗肿瘤性质,如细胞毒性活性增加以及对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。还提供了制备的方法和包含这种修饰的T细胞的组合物。(Methods of treating cancer using adoptive cell therapy are provided, wherein T cells are modified to have a reduced T Cell Receptor (TCR) signaling threshold and/or increased TCR sensitivity, and have improved anti-tumor properties, such as increased cytotoxic activity and reduced susceptibility to immunosuppression and/or failure. Methods of preparation and compositions comprising such modified T cells are also provided.)

T细胞信号传导的miRNA调节及其应用

相关申请

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技术领域

本发明涉及使用过继细胞疗法治疗癌症的方法，其中T细胞被修饰以具有降低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性，并具有改善的抗肿瘤性质，如细胞毒性活性增加以及对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低，并且包括制备的方法和包含这种修饰的T细胞的组合物。

背景技术

T细胞介导的免疫是包括能够消除病毒、细菌或寄生虫感染或恶性细胞的抗原特异性T淋巴细胞的发育的适应性过程。T细胞对自身抗原的异常识别可导致自身免疫性炎性疾病。T淋巴细胞的抗原特异性是基于T细胞受体(TCR)对抗原呈递细胞(APCs)上的主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的抗原肽的识别作用(Broere,et al.,Principles ofImmunopharmacology,2011)。由于胸腺成熟后的发育选择，每个T淋巴细胞在细胞表面上表达独特的TCR。

在过去的二十年中，免疫学和肿瘤生物学的基础发展，结合对大量肿瘤抗原的鉴别已经在基于细胞的免疫疗法领域取得了显著进展。T细胞疗法在基于细胞的免疫疗法领域中占有大的空间，其目标是通过将自体和离体扩增的T细胞转移至患者来治疗癌症，并已导致一些显著的抗肿瘤反应(Blattman et al.,Science.305(5681):200-5,2004)。例如，给予离体扩增的天然存在的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)在黑素瘤患者体内(包括在包括肝、肺、软组织和脑的多个部位的大块浸润性肿瘤)介导的客观响应率在50-70％之间(Rosenberg et al.,Nat.Rev.Cancer.8(4):299-308,2008；Dudley ME et al.,J.Clin.Oncol.23(10):2346-57,2005)。

已知源自宿主的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和其它抗肿瘤T细胞具有抗肿瘤活性，但是显著的限制性已防止了TIL疗法治疗癌症的广泛应用。由于多种肿瘤抗原是内源性蛋白质，并且我们的免疫耐受系统在消除带有对自身抗原具有高亲和力的TCRs的T细胞中非常有效，因此TILs通常具有对肿瘤抗原具有低或中等亲和力的TCRs。此外，其抗肿瘤功能通常对肿瘤微环境中的抑制敏感。作为可选的方法，已经通过T细胞工程将包括TCRs和嵌合抗原受体(CARs)的外源性高亲和力受体引入患者的正常自体T细胞中。这些细胞向淋巴衰竭的患者中的过继性转移已显示在诸如黑素瘤、结肠直肠癌(colorectal carcinoma)、和滑膜肉瘤的癌症中介导癌症消退(Kunert R et al.,Front.Immunol.4:363,2013)。最近的使用抗NY-ESO-1TCRs针对滑膜肉瘤的I期临床试验报道了66％的总响应率，并且在一位接受T细胞疗法的患者中实现了完全响应(Robbins PF et al.,Clin.Cancer Res.21(5):1019-27,2015)。

目标特异性TCRs的鉴定需要从患者T细胞建立目标肽/MHC特异性TCR克隆，并筛选具有最佳目标抗原结合亲和力的正确的α-β链组合。从患者T细胞克隆TCR后，通常采用体内亲和力成熟化，以进一步增强TCR的目标结合亲和力。整个过程需要多个领域的专业知识并且耗时(Kobayashi E et al.,Oncoimmunology.3(1):e27258,2014)。TCR发现过程中的困难已经在很大程度上阻碍了TCR修饰的T细胞疗法的广泛应用。其也已受与治疗先关的毒性，特别是针对在肿瘤细胞上过表达但也在健康细胞上表达的抗原的TCRs，或识别目标肽外/MHC复合物的TCRs的阻碍(Rosenberg SA et al.,Science.348(6230):62-8,2015)。

CAR T细胞疗法将单克隆抗体的精细的靶向特异性与细胞毒性T细胞提供的有效细胞毒性和长期持久性融合在一起。CAR总体上由识别细胞表面抗原的胞外结构域、跨膜区、和细胞内信号传导结构域组成。移植到T细胞表面上的CARs与目标抗原的结合可以触发T细胞效应子功能，而与TCR-肽/MHC复合物的相互作用无关。因此，装配有CARs的T细胞可被重新定向以攻击各种细胞，包括与T细胞上MHC类型的TCRs不匹配但表达目标细胞表面抗原的那些细胞。这种方法克服了MHC限制性TCR识别的限制，并避免了通过抗原呈递或MHC分子表达受损而导致的肿瘤逃逸。临床试验已显示CAR T细胞疗法在成神经细胞瘤(Louis CUet al.,Blood.118(23):6050-6056,2011)、B-ALL(Maude,SL,et al.,New EnglandJournal of Medicine 371:16:1507-1517,2014)、CLL(Brentjens,RJ,et al.Blood 118:18:4817-4828,2011)、和B细胞淋巴瘤(Kochenderfer,JN,et al.Blood 116:20:4099-4102,2010)中具有临床上显著的抗肿瘤活性。

尽管这些早期的成功，CAR T细胞疗法仍面临若干必须克服的障碍，包括CAR设计产生的功效问题、逃逸变体的复发、和肿瘤微环境的存活、以及CAR-修饰的T细胞的极强效力产生的安全问题，这可导致危及生命的状况，如细胞因子释放综合征(CRS)和巨噬细胞激活综合征(MAS)、以及肿瘤溶解综合征(TLS)、目标上肿瘤外的细胞毒性(on-target off-tumor toxicity)和神经毒性(H.et al.,Journal of Immunology Research,2016)。更重要的是，一些固有的限制性可防止CAR T细胞疗法在实体瘤中的广泛采用。对于实体瘤，发现适合CAR T细胞靶向的肿瘤特异性抗原是挑战性和耗时的。因此，目标上/肿瘤外的毒性可能难以避免。甚至通过单克隆抗体的多特异性抗原识别也对预测CAR T细胞的目标外毒性呈现挑战。最后，随着肿瘤细胞通过诱变而演化，作为单克隆治疗剂的CAR T细胞易受抗原逃逸的影响。

因此，提高TILs对多种肿瘤抗原的反应性的方法可以有助于克服CAR-T和TCR-T技术的多种固有限制，并使TIL疗法广泛适用于实体瘤。

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发明内容

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的癌症的方法，包括向个体给予识别癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含microRNA(miRNA)的RNA转录物的外源性核酸分子，该microRNA(miRNA)包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白质磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的每个mRNAs。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区(stem region)，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，方法进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的癌症的方法，包括向个体给予识别个体中癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包括增加内源性miR-181a的表达的修饰，并且其中与未被修饰以增加内源性miR-181a表达的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，该融合蛋白包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶-缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，该引导核苷酸将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。在一些实施方式中，修饰包括将上调miR-181a的核酸序列***T细胞的基因组中。在一些实施方式中，核酸序列编码miR-181a。在一些实施方式中，核酸序列包含启动子序列，并且被***使得启动子序列与miR-181a基因可操作地连接。在一些实施方式中，通过同源重组***核酸序列。在一些实施方式中，利用CRISPR***核酸序列。在一些实施方式中，通过随机整合***核酸序列。在一些实施方式中，通过病毒转导***核酸序列。在一些实施方式中，修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。在一些实施方式中，方法进一步包括修饰输入的T细胞群体，进而生成修饰的T细胞群体。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，方法进一步包括给予第二疗法或治疗剂。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前给予调理化学疗法(conditioning chemotherapy)。在一些实施方式中，方法进一步包括给予化学治疗剂。在一些实施方式中，方法进一步包括给予免疫治疗剂。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成自体输入的T细胞。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，修饰的T细胞对个体是同种异体的。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射向个体给予修饰的T细胞。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，个体为人。

在一些实施方式中，根据上述治疗癌症的方法中的任一种，癌症为实体瘤。在一些实施方式中，癌症为胰腺癌、乳腺癌、或黑素瘤。在一些实施方式中，癌症为转移癌。

在一些实施方式中，提供了产生修饰的T细胞群体的方法，包括识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入编码miRNA的外源性核酸分子，该miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5和DUSP6的每个mRNAs。

在一些实施方式中，根据上述产生修饰的T细胞群体的方法中的任一种，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。

在一些实施方式中，根据上述产生修饰的T细胞群体的方法中的任一种，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。

在一些实施方式中，提供了产生修饰的T细胞群体的方法，包括向识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入增加内源性miR-181a表达的修饰，其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的TCR信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，该融合蛋白包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶-缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，该引导核苷酸将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。在一些实施方式中，修饰包括将上调miR-181a的核酸序列***T细胞的基因组中。在一些实施方式中，核酸序列编码miR-181a。在一些实施方式中，核酸序列包含启动子序列，并且被***使得启动子序列与miR-181a基因可操作地连接。在一些实施方式中，通过同源重组***核酸序列。在一些实施方式中，利用CRISPR***核酸序列。在一些实施方式中，通过随机整合***核酸序列。在一些实施方式中，通过病毒转导***核酸序列。在一些实施方式中，修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。

在一些实施方式中，根据上述产生修饰的T细胞群体的方法中的任一种，从个体中的实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括从实体瘤分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。

在一些实施方式中，提供了通过上述方法中的任一种制备的修饰的T细胞群体。

在一些实施方式中，提供了包含上述修饰的T细胞群体中的任一种的组合物。

在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含上述修饰的T细胞群体中的任一种和药学上可接受的载剂。

在一些实施方式中，提供了识别个体中的两种或更多种癌症相关抗原的修饰的T细胞的多克隆群体，其中修饰的T细胞包含编码microRNA(miRNA)的外源性核酸分子，该microRNA(miRNA)包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

在一些实施方式中，提供了识别个体中的两种或更多中癌症相关抗原的修饰的T细胞的多克隆群体，其中修饰的T细胞包含增加内源性miR-181a表达的修饰，并且其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

附图说明

图1显示了由对照TILs或被转导以过表达miR-181的TILs(miR-181TILs)介导的KPC胰腺癌细胞的肿瘤细胞杀伤。

图2A和2B显示了用对照TILs+IL-2或miR-181TILs+IL-2处理的胰腺癌小鼠模型KPC小鼠中的肿瘤生长。

图3显示了用对照TILs+IL-2或miR-181TILs+IL-2处理的KPC小鼠的存活图。

图4显示了用(i)无处理、(ii)化学疗法+IL-2、(iii)化学疗法+对照TILs+IL-2、或(iv)化学疗法+miR-181TILs+IL-2处理的KPC小鼠的存活图。

图5显示了由对照TILs或被转导以过表达miR-181的TILs介导的B16F0黑素瘤细胞的肿瘤细胞杀伤。

图6显示了用1)模拟调理化学疗法+模拟TIL注射、2)调理化学疗法+模拟TIL注射、3)调理化学疗法+对照TILs、或4)调理化学疗法+miR-181TILs处理的黑素瘤小鼠模型同系B16F0小鼠的肿瘤生长。

图7显示了用1)调理化学疗法+模拟TIL注射、2)调理化学疗法+对照TILs、或3)调理化学疗法+miR-181TILs处理的同系B16F0小鼠的存活图。

图8显示了由对照TILs或被转导以过表达miR-181的TILs介导的4T1乳腺肿瘤细胞的肿瘤细胞杀伤。

图9显示了用1)模拟TIL注射、2)对照TILs、或3)miR-181TILs处理的同系4T1小鼠的存活图。

图10显示了对gp100肽敏感并用非特异性肽或gp100肽重新激发(re-challenged)的载体对照(409)TILs和miR-181TILs中PD-1表达的FACS分析的结果。

图11显示了对gp100肽敏感并用非特异性肽或gp100肽重新激发的载体对照(409)TILs和miR-181TILs中CD28表达的FACS分析的结果。

具体实施方式

miR-181在控制TCR信号传导强度和T细胞敏感性中起T细胞敏感性变阻器的最初发现示例了使用miR-181提高TILs对肿瘤抗原的反应性的潜力(Li,Qi-Jing,et al.Cell129.1(2007):147-161；U.S.Patent 9,364,522)。然而，尚不清楚具有异位表达的miR-181的基因修饰的TILs是否可以在体内加强TILs的抗肿瘤功能。重要的是应注意TILs的抗肿瘤功能不仅取决于对肿瘤抗原的TCR信号传导的强度，还取决于其它抗肿瘤性质。例如，未知的是TILs的miR-181修饰将如何影响其对肿瘤细胞的CTL活性、其在肿瘤中的增殖、分化、和迁移、以及其对免疫抑制性肿瘤微环境的敏感性。本申请至少部分基于以下意外发现：修饰TILs以增加miR-181表达可提高其在临床黑素瘤、乳腺癌和胰腺癌模型中的抗肿瘤活性。此外，增加的miR-181表达对TILs的抗肿瘤功能提供了多种其它有益作用。增加的miR-181表达提高TILs对肿瘤细胞的CTL活性、抑制TILs上PD-1抑制性检查点表达(PD-1inhibitorycheckpoint expression)的表达、和加强共刺激分子CD28的表达。这些发现首次提供了癌症疗法中增加的miR-181的作用的证据。

本文提供了使用过继细胞疗法治疗个体中的癌症的方法，其中癌症相关抗原特异性T细胞群体具有天然受体并且被修饰以具有降低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，修饰的T细胞还具有降低的对免疫抑制和/或衰竭的易感性和增加的CTL活性，进而克服了T细胞疗法、免疫抑制和无反应性的另外显著的限制。在一些实施方式中，修饰的T细胞群体源自输入的T细胞(如从个体中的实体瘤分离的自体T细胞)的多克隆群体，并且能够识别由个体中的癌症细胞表达的多种癌症相关抗原，因此使得利用这种细胞的疗法较不易于因逃逸变体而复发。在一些实施方式中，修饰的T细胞群体源自输入的T细胞(如从具有负载有肿瘤抗原的抗原呈递细胞的自体T细胞体外扩增的抗肿瘤T细胞)的多克隆群体。在一些实施方式中，修饰的T细胞群体源自具有识别肿瘤抗原的特异性TCRs的单克隆T细胞。还提供了制备修饰的T细胞群体的方法，以及包含修饰的T细胞群体的组合物和制品。

定义

如本文所用，“个体”是哺乳动物，如人或其它动物。在一些实施方式中，向其给予细胞、细胞群体或组合物的个体(例如，患者)是哺乳动物，例如，灵长类动物，如人。在一些实施方式中，灵长类动物是猴或猿。个体可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年个体。在一些实施方式中，个体是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指代完全或部分改善或减轻疾病或状况或障碍、或与之相关的症状、副作用或结果、或表型。期望的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、缓解或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。术语不一定暗示完全治愈疾病或完全消除所有症状或结果的任何症状或作用(一种或多种)。

如本文所用，“延迟疾病的发展”意为延迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或推迟疾病(如癌症)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以包括在不发展疾病的个体中的预防。例如，可以延迟晚期癌症，如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括关于可能易患该疾病但尚未被诊断出该疾病的个体中疾病的发生或复发提供预防。在一些实施方式中，提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，“抑制”功能或活性是与除感兴趣的条件或参数以外的其它相同条件相比，或者可选地与另一条件相比，降低功能或活性。例如，与缺乏细胞的情况下，与肿瘤的生长速度相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速度。

在给药的环境中试剂(例如，药物制剂、细胞、或组合物)的“有效量”指代在必要的剂量/量和时间段内有效实现期望结果(如治疗或预防结果)的量。

试剂(例如，药物制剂或细胞)的“治疗有效量”指代在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果(如用于治疗疾病、状况、或障碍和/或治疗的药代动力学或药效学作用)的量。治疗有效量可根据诸如对象的疾病状态、年龄、性别、和体重以及所给予的细胞群体的因素而变化。在一些实施方式中，提供的方法包括以有效量(例如，治疗有效量)给予细胞和/或组合物。

“预防有效量”指代在必要的剂量和时间段内有效实现期望的预防结果的量。通常但并非必须地，由于在疾病的早期之前或在疾病的早期，在对象中使用预防剂量，因此预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负担的环境中，预防有效量在一些方面将高于治疗有效量。

治疗方法

提供了给予本文所述的细胞、群体、和组合物的方法，以及这种细胞、群体、和组合物在治疗或预防疾病、状况、和障碍(如癌症)中的应用。在一些实施方式中，例如通过修饰的T细胞靶向疾病细胞(如癌症细胞)，将细胞、群体、和组合物给予患有待治疗的特定疾病或状况的个体或患者。在一些实施方式中，通过提供的方法制备的细胞和组合物(如在培育和/或其它处理步骤之后的工程化组合物和生产结束组合物(end-of-productioncompositions))被给予个体，如患有疾病或状况或具有该疾病或状况风险的个体。在一些方面，方法由此诸如通过在表达由修饰的T细胞识别的抗原的癌症中减轻肿瘤负担来治疗(例如，改善)疾病或状况的一种或多种症状。

在一些实施方式中，提供的方法总体上包括向患有癌症(如其组分被修饰的T细胞特异性识别的癌症)的个体给予一定剂量的提供的修饰的T细胞。给药总体上实现一种或多种癌症症状的改善和/或治疗或预防癌症或其症状。在一些实施方式中，促进修饰的T细胞的生长和激活的T细胞生长因子与修饰的T细胞被同时给予个体或随后给予修饰的T细胞。T细胞生长因子可以是促进修饰的T细胞的生长和激活的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21，其可以单独或以各种组合(如IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-7和IL-15、IL-2、IL-7和IL-15、IL-12和IL-7、IL-12和IL-15、或IL-12和IL2)使用。

在一些实施方式中，在将修饰的T细胞给予个体中之前，例如使用药物的混合物对个体进行淋巴清除(lymphodepleted)以消耗T细胞和B细胞。在一些实施方式中，在将修饰的T细胞给予到个体中之前，将调理化学疗法给予个体。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，IL-2被全身给予以帮助在淋巴清除和细胞输注后支持转移的修饰的T细胞。在T细胞输注之后，用IL-2处理支持体内输注的T细胞的持久性。

待治疗的癌症为肿瘤，包括实体瘤、溶血性恶性肿瘤(hematologicmalignancies)、和黑素瘤。这种癌症包括但不限于实体瘤，包括肉瘤和癌，包括肾上腺皮质癌、胆管癌、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂质肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌和***状甲状腺癌)、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌(pheochromocytomas sebaceousgland carcinoma)、***状癌、***状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、***症(例如，***和癌前宫颈发育不良(侵入性前宫颈发育不良，pre-invasive cervical dysplasia))、结肠直肠癌、***、肛管、或直肠***的癌症、***癌、外阴癌症(例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、和纤维肉瘤)、***癌、口咽癌、食管癌、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如，***瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、莱迪希细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、和脂瘤)、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、子宫癌(例如，子宫内膜癌)、泌尿道上皮癌(urothelial cancers)(例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、输尿管癌、和膀胱癌)、和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合性神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤(Schwannomacraniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移。溶血性(或造血性(hematogenous))癌症包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞、前髓细胞性、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞性白血病和脊髓发育不良。

在一些实施方式中，根据本文描述的治疗癌症的方法中的任一种，癌症为胰腺癌。在一些实施方式中，胰腺癌为胰腺外分泌癌。在一些实施方式中，胰腺癌为胰腺神经内分泌癌。

在一些实施方式中，根据本文描述的治疗癌症的方法中的任一种，癌症为胰腺外分泌癌。在一些实施方式中，胰腺外分泌癌是胰腺腺癌(如浸润性或导管性胰腺腺癌)、胰腺的腺泡细胞癌、囊腺癌、胰腺母细胞瘤(pancreatoblastoma)、或胰腺粘液性囊性肿瘤(pancreatic mucinous cystic neoplasm)。在一些实施方式中，个体可以是具有与胰腺外分泌癌相关的基因、遗传突变、或多态性或者具有与胰腺神经内分泌癌相关的基因的一个或多个额外拷贝的人。

在一些实施方式中，根据本文所述的治疗癌症的方法中的任一种，癌症是胰腺神经内分泌癌。在一些实施方式中，胰腺神经内分泌癌是高分化的神经内分泌肿瘤、高分化的(低级)神经内分泌癌、或低分化(高级)神经内分泌癌。在一些实施方式中，胰腺神经内分泌癌是功能性胰腺神经内分泌肿瘤。在一些实施方式中，胰腺神经内分泌肿瘤是非功能性胰腺神经内分泌肿瘤。在一些实施方式中，胰腺神经内分泌癌是胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、生长抑制素瘤、胃泌素瘤(gastrinoma)、VIPoma、GRFoma、或ACTHoma。在一些实施方式中，个体可以是具有与胰腺神经内分泌癌(例如，NF1和/或MEN1)相关的基因、遗传突变多多态性或者具有与胰腺神经内分泌癌相关的基因的一个或多个额外拷贝的人。

在一些实施方式中，根据本文所述的治疗癌症的方法中的任一种，癌症为乳腺癌。在一些实施方式中，乳腺癌为早期乳腺癌、非转移性乳腺癌、晚期乳腺癌、IV期乳腺癌、局部晚期乳腺癌、转移性乳腺癌、缓解期的乳腺癌(breast cancer in remission)、辅助环境中的乳腺癌、或新辅助环境中的乳腺癌。在一些实施方式中，乳腺癌处于新辅助环境中。在一些实施方式中，乳腺癌处于晚期。在一些实施方式中，乳腺癌(其可以是HER2阳性或HER2阴性)包括例如，晚期乳腺癌、IV期乳腺癌、局部晚期乳腺癌、和转移性乳腺癌。在一些实施方式中，个体可以是具有与乳腺癌相关的基因、遗传突变或多态性(例如，BRCAl、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN、和/或PDK)或者具有与乳腺癌相关的基因的一个或多个额外拷贝(例如，HER2基因的一个或多个额外拷贝)的人。在一些实施方式中，方法进一步包括基于具有不表达ER和PgR的肿瘤组织的患者的激素受体状态来鉴定癌症患者群体(即乳腺癌群体)。

在一些实施方式中，根据本文所述的治疗癌症的方法中的任一种，癌症是黑素瘤。在一些实施方式中，黑素瘤浅表扩散性黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、结节性黑素瘤、粘膜黑素瘤、息肉样黑素瘤、促***增生黑素瘤(desmoplastic melanoma)、无黑色素性恶性黑素瘤、软组织黑素瘤、或肢端着色斑性黑素瘤。在一些实施方式中，根据美国癌症联合委员会(AJCC)分期组(American Joint Committee on Cancer(AJCC)staging groups)，黑素瘤处于I、II、III、或IV的任何阶段。在一些实施方式中，黑素瘤是复发性的。

用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞疗法的方法描述于例如授予Gruenberg et al的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)NatRev Clin Oncol.8(10):577-85)中。参见，例如Themeli et al.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara et al.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila et al.(2013)PLoSONE 8(4):e61338。

在一些实施方式中，通过自体转移进行细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)，其中从将接受细胞疗法的个体或从源自此个体的样品分离和/或以其它方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗和细胞的个体，例如患者，随后对相同个体给予分离和处理。

在一些实施方式中，通过同种异体转移进行细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法)，其中从除了将接受或最终接受细胞疗法的个体以外的个体(例如，第一个体)分离和/或以其它方式制备细胞。。在这种实施方式中，然后将细胞给予相同物种的不同个体，例如第二个体。在一些实施方式中，第一和第二体在遗传上是相同或相似的。在一些实施方式中，第二个体表达与第一个体相同的HLA类别或超型。

可以通过任何合适的手段，例如，通过大剂量(bolus)输注、通过注射(例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前眼房注射、subconjectval注射、结膜下注射(subconjuntivalinjection)、特农氏下注射(sub-Tenon's injection)、球后注射、球周注射、或后近巩膜递送(posterior juxtascleral delivery)来给予细胞。在一些实施方式中，其通过肠胃外、肺内、和鼻内给予，并且如果期望用于局部治疗、损伤区给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸内、颅内、或皮下给药。在一些实施方式中，通过单次大剂量给予(single bolus administration)细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，其通过多次大剂量给予(multiple bolus administrations)细胞(例如，在不超过3天的时间内)或通过连续输注给予细胞来给予。

为了预防或治疗疾病，适当的剂量可取决于要治疗的疾病的类型、细胞或目标抗原的类型、疾病的严重性和病程、是否为预防或治疗目的而给予细胞、先前的疗法、个体的临床史和对细胞的响应、以及主治医生的酌处权(discretion of the attendingphysician)。在一些实施方式中，组合物和细胞被一次或通过一系列治疗而适当地给予个体。

给予细胞后，在一些实施方式中，例如通过多种已知方法中的任一种来测量工程化细胞群体的生物活性。评估的参数包括在体内例如通过成像或离体例如通过ELISA或流式细胞术将工程化或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原特异性结合。在某些实施方式中，可使用本领域已知的任何合适的方法(如描述于例如Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman et al.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中的细胞毒性测定法)测量工程化细胞破坏目标细胞的能力。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2、和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿瘤负担或负载的减轻)来测量生物学活性。在一些方面，评估了毒性结果、细胞的持久性和/或扩增、和/或宿主免疫反应的存在或不存在。

在一些实施方式中，与将输入的T细胞或包含这种输入的T细胞的组合物可比较的单次给予至个体产生的临床终点相比，将修饰的T细胞或组合物单次给予个体导致个体中的临床终点(例如，总体存活率、无进展存活率、进展的时间、治疗失败的时间、无事件存活率、下一次治疗的时间、客观响应率、或响应持续时间)得到改善。在一些实施方式中，增加为至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、或5倍。

在一些实施方式中，方法导致个体中的响应的持续时间(从记录肿瘤响应到疾病进展的时间)为至少约1个月、至少约2个月、至少约6个月、至少约1年、至少约2年、或更长的时间。在一些实施方式中，与将输入的T细胞或包含这种输入的T细胞的组合物可比较的单次给予至个体产生的响应持续时间相比，将修饰的T细胞或组合物单次给予个体导致对象中的响应持续时间增加。在一些实施方式中，增加为至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、或5倍。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的癌症的方法，包括向个体给予识别癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的RNA转录物的外源性核酸分子，其中miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQID NO:4的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，RNA转录物包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。在一些实施方式中，方法进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是同种异体的。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予促进修饰的T细胞的生长和激活的合适的生长因子，包括例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一些实施方式中，方法进一步包括将IL-2给予个体。在一些实施方式中，IL-2与修饰的T细胞同时被给予个体和/或随后给予修饰的T细胞。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌、乳腺癌、或黑素瘤。在一些实施方式中，癌症是转移癌。在一些实施方式中，个体是人。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的胰腺癌的方法，包括向个体给予识别胰腺癌相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的RNA转录物的外源性核酸分子，其中miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中修饰的T细胞对胰腺癌相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，RNA转录物包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。在一些实施方式中，方法进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是同种异体的。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予促进修饰的T细胞的生长和激活的合适的生长因子，包括例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予IL-2。在一些实施方式中，IL-2与修饰的T细胞被同时给予个体和/或随后给予修饰的T细胞。在一些实施方式中，胰腺癌是转移胰腺癌。在一些实施方式中，个体是人。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的乳腺癌的方法，包括向个体给予识别乳腺癌相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的RNA转录物的外源性核酸分子，其中miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中修饰的T细胞对乳腺癌相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，RNA转录物包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。在一些实施方式中，方法进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是同种异体的。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予促进修饰的T细胞的生长和激活的合适的生长因子，包括例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予IL-2。在一些实施方式中，IL-2与修饰的T细胞被同时给予个体和/或随后给予修饰的T细胞。在一些实施方式中，乳腺癌是转移乳腺癌。在一些实施方式中，个体是人。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的黑素瘤的方法，包括向个体给予识别黑素瘤相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的RNA转录物的外源性核酸分子，其中miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中修饰的T细胞对黑素瘤相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，RNA转录物包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。在一些实施方式中，方法进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是同种异体的。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予促进修饰的T细胞的生长和激活的合适的生长因子，包括例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予IL-2个体。在一些实施方式中，IL-2与修饰的T细胞被同时给予个体和/或随后给予修饰的T细胞。在一些实施方式中，黑素瘤是转移黑素瘤。在一些实施方式中，个体是人。

在一些实施方式中，提供了治疗个体中的癌症的方法，包括向个体给予识别个体中癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包括增加内源性miR-181a表达的修饰，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，该融合蛋白包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶-缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，该引导核苷酸将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。在一些实施方式中，miR-181a基因为miR-181a-1。在一些实施方式中，miR-181a基因为miR-181a-2。在一些实施方式中，修饰包括将上调miR-181a的核酸序列引入T细胞的基因组中。在一些实施方式中，核酸序列编码miR-181a。在一些实施方式中，核酸序列包含启动子序列并且被***使得启动子序列与miR-181a基因(miR-181a-1或miR-181a-2)可操作地连接。在一些实施方式中，通过同源重组***核酸序列。在一些实施方式中，利用CRISPR***核酸序列。在一些实施方式中，通过随机整合***核酸序列。在一些实施方式中，通过病毒转导***核酸序列。在一些实施方式中，修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。在一些实施方式中，方法进一步包括将修饰引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是自体的。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体中的实体瘤分离T细胞。在一些实施方式中，修饰的T细胞对个体是同种异体的。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁵个细胞/千克个体的体重。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞。在一些实施方式中，给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x10⁷个细胞/m²个体的体表面积。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。在一些实施方式中，方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法。在一些实施方式中，调理化学疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予促进修饰的T细胞的生长和激活的合适的生长因子，包括例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一些实施方式中，方法进一步包括向个体给予IL-2。在一些实施方式中，IL-2与修饰的T细胞被同时给予个体和/或随后给予修饰的T细胞。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在一些实施方式中，癌症为胰腺癌、乳腺癌、或黑素瘤。在一些实施方式中，癌症是转移癌。在一些实施方式中，个体是人。

联合疗法

在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的部分(如与另一种治疗干预如抗体或工程化细胞或受体或其它试剂(如细胞毒性或治疗剂)同时或以任何顺序顺序地)给予。因此，一些实施方式中的细胞与一种或多种另外的治疗剂被共同给予，或者以任何顺序同时或顺序地结合另一种治疗干预。在一些环境中，细胞与另一种疗法在时间上足够接近地被共同给予，使得细胞群体增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种另外的治疗剂之前给予细胞。在一些实施方式中，在一种或多种另外的治疗剂之后给予细胞。

在一些实施方式中，方法包括向个体给予化学治疗剂(例如，条件化学治疗剂)，例如以在剂量给予之前减轻肿瘤负担。在一些实施方式中，方法包括在给予修饰的T细胞之前向个体给予调理化学疗法方案。在一些实施方式中，给予根据本领域已知的调理化学疗法方案中的任一种的条件化学疗法方案。例如，在一些实施方式中，调理化学疗法方案包括给予环磷酰胺和氟达拉滨。

在一些实施方式中，根据本文描述的实施方式中的任一种的治疗癌症的方法包括向个体给予第二治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂为化学治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂为免疫治疗剂。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。

给药

在一些实施方式中，以期望的剂量给予细胞，该期望的剂量在一些方面包括期望的剂量或细胞数量或细胞类型(一种或多种)和/或期望的细胞类型的比。因此，细胞的剂量在一些实施方式中基于细胞的总数(或每千克体重的数量)和个体群体或亚型的期望比，如CD4+与CD8+的比。在一些实施方式中，细胞的剂量基于个体群体或个体细胞类型中细胞的期望总数(或每千克体重的数量)。在一些实施方式中，剂量基于这些特征的组合，如个体群体中期望的总细胞数、期望的比、和期望的细胞总数。

在一些实施方式中，以总细胞的期望剂量(如T细胞的期望剂量)的容忍差异或在其容忍差异内给予细胞(如CD8⁺和CD4⁺T细胞)的群体或亚型。在一些方面，期望的剂量是期望的细胞数量或期望的细胞数量/要给予细胞的对象的单位体重，例如，细胞/kg。在一些方面，期望的剂量等于或大于最小细胞数量或最小细胞数量/单位体重。在一些方面，在以期望的剂量给予的总细胞中，个体群体或亚型以期望的输出比(如CD4⁺与CD8⁺的比)或接近期望的输出比，例如在这种比的某些容忍差异或误差内存在。

在一些实施方式中，以细胞的个体群体或亚型中的一种或多种的期望剂量(如CD4+细胞的期望剂量和/或CD8+细胞的期望剂量)的容忍差异或在其容忍差异内给予细胞。在一些方面，期望的剂量是亚型或群体的期望的细胞数量，或这种细胞的期望数量/要给予细胞的对象的单位体重，例如，细胞/kg。在一些方面，期望的剂量等于或大于群体或亚型的最小细胞数量，或群体或亚型的最小细胞数量/单位体重。

因此，在一些实施方式中，剂量基于总细胞的期望的固定剂量和期望的比，和/或基于个体亚型或亚群中的一种或多种(例如，每种)的期望的固定剂量。因此，在一些实施方式中，剂量基于T细胞的期望的固定或最小剂量和CD4⁺与CD8⁺细胞的期望比，和/或基于CD4⁺和/或CD8⁺细胞的期望的固定或最小剂量。

在某些实施方式中，细胞或细胞亚型的个体群体以约1百万至约1,000亿个细胞的范围，如例如1百万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2,500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞、或前述值中的任两个值限定的范围)、如约1,000万至约1,000亿个细胞(例如，约2,000万个细胞、约3,000万细胞、约4,000万个细胞、约6,000万个细胞、约7,000万个细胞、约8,000万个细胞、约9,000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、或前述值中的任两个值限定的范围)、和在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)、或这些范围中的任意值给予对象。

在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或细胞的个体亚群的剂量在等于或约10⁴个至等于或约10⁹个细胞/千克(kg)体重的范围内，如10⁵个至10⁶个细胞/kg体重，例如，等于或约1x10⁵个细胞/kg体重、1.5x10⁵个细胞/kg体重、2x10⁵个细胞/kg体重、或1x10⁶个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，以等于或约10⁴个至等于或约10⁹个T细胞/千克(kg)体重(如10⁵个至10⁶个T细胞/kg体重，例如，等于或约1x10⁵个T细胞/kg体重、1.5x10⁵个T细胞/kg体重、2x10⁵个T细胞/kg体重、或1x10⁶个T细胞/kg体重)之间的误差的某些范围或在该范围内给予细胞。

在一些实施方式中，以等于或约10⁴个至等于或约10⁹个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/千克(kg)体重(如10⁵个至10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重，例如，等于或约1x10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重、1.5x10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重、2x10⁵个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重、或1x10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重)之间的误差的某些范围或在该范围内给予细胞。

在一些实施方式中，以大于和/或至少约1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶、或约9x10⁶个CD4⁺细胞、和/或至少约1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶、或约9x10⁶个CD8+细胞、和/或至少约1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶、或约9x10⁶个T细胞的误差范围或在该误差范围内给予细胞。在一些实施方式中，以约10⁸至10¹²或约10¹⁰至10¹¹个T细胞、约10⁸至10¹²或约10¹⁰至10¹¹个CD4⁺细胞、和/或约10⁸至10¹²或约10¹⁰至10¹¹个CD8⁺细胞的某些误差范围或在该误差范围内给予细胞。

在一些实施方式中，以多种细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的期望输出比的容忍范围或在该容忍范围内给予细胞。在一些方面，期望的比可以是特定比或者可以是比的范围。例如，在一些实施方式中，期望的比(例如，CD4⁺与CD8⁺细胞的比)为等于或约5:1至等于或约5:1(或大于约1:5并且小于约5:1)、或等于或约1:3至等于或约3:1(或大约1:3并且小于约3:1)，如等于或约2:1至等于或约1:5(或大于约1:5至小于约2:1，如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、或1:5)。在一些方面，容忍差异在期望的比的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％的内，包括这些范围之间的任何值。

在过继细胞疗法的环境中，给予给定“剂量”包括作为单个组合物和/或单个不间断给予(例如，单个注射或连续输注)给予给定量或数量的细胞，并且还包括在不超过3天的指定时间段内，作为以多种个体组合物或输注的提供的分次剂量给予给定量或数量的细胞。因此，在一些环境中，剂量是在单个时间点给定或启动的特定数量的细胞的单次或连续给药。在一些环境下，然而，剂量是在若干天(如不超过三天)的时间段以多次注射或输注给予，如每天一次，持续三天或持续两天，或者在一天内多次输注。

因此，在一些方面，以单一药物组合物给予细胞。

在一些实施方式中，以共同含有单个剂量的细胞的多种组合物给予细胞。

因此，一个或多个剂量在一些方面可以作为分次剂量给予。例如，在一些实施方式中，可以在2天或3天将剂量给予对象。分次给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量，并在第二天给予其余75％的剂量。在其它实施方式中，可以在第一天给予33％的剂量，并在第二天给予其余67％的剂量。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并在第三天给予60％的剂量。在一些实施方式中，分次剂量分布不超过3天。

在一些实施方式中，例如通过给予第一剂量和一个或多个后续剂量来给定多个剂量，其中在给予第一或先前剂量后，每个后续剂量在大于约28天的时间点被给定。

在一些实施方式中，剂量含有约10⁵至约10⁶个这种细胞/千克对象的体重的范围内的细胞数量、修饰的T细胞的数量、或肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)的数量、和/或不超过约10⁵或约10⁶个这种细胞/千克对象的体重的这种细胞的数量。例如，在一些实施方式中，第一或后续剂量包括小于或不大于或等于约1x10⁵、等于或约2x10⁵、等于或约5x10⁵、或等于或约1x10⁶个这种细胞/千克对象的体重。在一些实施方式中，第一剂量包括等于或约1x10⁵、等于或约2x10⁵、等于或约5x10⁵、或等于或约1x10⁶个这种细胞/千克对象的体重，或前述值中的任两个之间范围内的值。在特定的实施方式中，细胞的数量和/或浓度指代修饰的T细胞的数量。在其它实施方式中，细胞的数量和/或浓度指代给予的所有细胞、T细胞、或TILs的数量或浓度。

在一些实施方式中，例如，在对象为人的情况下，剂量包括少于约1x10⁸个总的修饰的T细胞、T细胞、或TILs，例如，约1x10⁶至1x10⁸个这种细胞的范围内，如2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、或1x10⁸或总的这种细胞，或前述值中的任两个之间的范围。

在一些实施方式中，剂量含有少于约1x10⁸个总的修饰的T细胞、T细胞、或TILs细胞/m²的对象，例如，在约1x10⁶至1x10⁸个这种细胞/m²对象的范围内，如2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、或1x10⁸个这种细胞/m²的对象，或前述值中的任两个之间的范围。

在某些实施方式中，剂量中的细胞、修饰的T细胞、T细胞、或TILs的数量大于约1x10⁶个这种细胞/千克对象的体重，例如，2x10⁶、3x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、或1x10¹⁰个这种细胞/千克的体重和/或1x10⁸、或1x10⁹、1x10¹⁰个这种细胞/m²的对象或总数，或前述值中的任两个之间的范围。

在一些方面，基于一种或多种标准(如在治疗(例如化学疗法)之前对象的响应、对象中的疾病负担(如肿瘤负荷、肿块、大小、或转移的程度、范围或类型)、阶段和/或对象发生毒性后果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性)的可能性或发生率和/或宿主对细胞的免疫响应和/或被给予的重组受体)确定剂量的大小。

miRNA-介导的T细胞信号传导的调节

本文所述的方法在一些实施方式中采用识别癌症相关抗原(CAA)的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含对输入的T细胞群体的一种或多种修饰，其导致与miR-181a具有相同种子序列的microRNA(miRNA)表达，或增加内源性miR-181a的表达和/或活性。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含编码miRNA的外源性核酸分子。在一些实施方式中，miRNA是miR-181a。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含增加内源性miR-181a-1和/或miR-181a-2的表达的一种或多种修饰。与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，输入的T细胞是多克隆的。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞，并且CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。在一些实施方式中，从血液分离输入的T细胞，并且CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自血液恶性肿瘤的癌细胞表达或与来自血液恶性肿瘤的癌细胞相关。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含另外的修饰，该修饰进一步降低其对免疫抑制和/或衰竭的易感性。

外源性核酸分子

本文描述的方法在一些实施方式中采用识别CAA的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码miRNA的外源性核酸分子，该miRNA与miR-181a具有相同的种子序列。在一些实施方式中，miRNA种子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA是miR-181a。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，外源性核酸编码包含miRNA的前体miRNA(pre-miRNA)。在一些实施方式中，外源性核酸编码包含miRNA的初级miRNA(pri-miRNA)。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pre-miRNA为the miR-181a-1或miR-181a-2pre-miRNA。在一些实施方式中，pre-miRNA包含SEQID NO:6或7的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，pri-miRNA为the miR-181a-1或miR-181a-2pri-miRNA。在一些实施方式中，pri-miRNA包含SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，外源性核酸分子包含与编码miRNA的序列可操作地连接的调节元件。在一些实施方式中，调节元件为miR-181a-1或miR-181a-2启动子。在一些实施方式中，调节元件是组成性活性启动子(constitutively active promoter)。在一些实施方式中，组成性活性启动子选自SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK或CAGG。在一些实施方式中，调节元件是条件启动子、增强子、或反式激活子(transactivator)。在一些实施方式中，条件启动子、增强子、或反式激活子是诱导型启动子、增强子、或反式激活子或可阻抑启动子、增强子、或反式激活子。在一些实施方式中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西霉素操纵子序列、或其类似物。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含编码miRNA的外源性核酸分子，该miRNA包含(如由…组成)miR-181a的序列。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，外源性核酸编码包含miRNA的前体miRNA(pre-miRNA)。在一些实施方式中，外源性核酸编码包含miRNA的初级miRNA(pri-miRNA)。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA或pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pre-miRNA是miR-181a-1或miR-181a-2pre-miRNA。在一些实施方式中，pre-miRNA包含SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，pri-miRNA是miR-181a-1或miR-181a-2pri-miRNA。在一些实施方式中，pri-miRNA包含SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列或由其组成。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的pre-miRNA的外源性核酸分子，该miRNA与miR-181a具有相同的种子序列。在一些实施方式中，miRNA种子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA是miR-181a。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pre-miRNA是miR-181a-1或miR-181a-2pre-miRNA。在一些实施方式中，pre-miRNA包含SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列或由其组成。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的pre-miRNA的外源性核酸分子，该miRNA包含(如由…组成)miR-181a的序列。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6mRNAs的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pre-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pre-miRNA是the miR-181a-1或miR-181a-2pre-miRNA。在一些实施方式中，pre-miRNA包含SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列或由其组成。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有降低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的pri-miRNA的外源性核酸分子，该miRNA具有与miR-181a相同的种子序列。在一些实施方式中，miRNA种子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA是miR-181a。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3a的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pri-miRNA是miR-181a-1或miR-181a-2pri-miRNA。在一些实施方式中，pri-miRNA包含SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列或由其组成。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含编码包含miRNA的pri-miRNA的外源性核酸分子，该miRNA包含(如由…组成)miR-181a的序列。在一些实施方式中，miRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3核苷酸序列的茎，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，pri-miRNA包含具有SEQ ID NOs:2和3的核苷酸序列的茎。在一些实施方式中，pri-miRNA是miR-181a-1或miR-181a-2pri-miRNA。在一些实施方式中，pri-miRNA包含SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列或由其组成。与衍生修饰的T细胞的缺乏外源性核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

内源性miR-181a的调节

本文描述的方法在一些实施方式中采用识别CAA的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含增加内源性miR-181a的表达的修饰。在一些实施方式中，修饰增加内源性miR-181a-1的表达。在一些实施方式中，修饰增加内源性miR-181a-2的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含***到其基因组中的核酸分子，该核酸分子上调miR-181a基因(即，miR-181a-1或miR-181a-2)。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含对miR-181a基因的修饰，该修饰导致其mRNA转录物的稳定性增加。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含导致miR-181a基因的转录增加的序列-引导的复合物。与衍生修饰的T细胞的缺乏修饰的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含***到其基因组中的核酸分子，该核酸分子包含内源性miR-181a基因(包括编码miR-181a的序列)的全部或部分。在一些实施方式中，内源性miR-181a基因是miR-181a-1。在一些实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方式中，内源性miR-181a基因是miR-181a-2。在一些实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方式中，***的核酸分子包含与miR-181a序列可操作地连接的调节元件。在一些实施方式中，调节元件是内源驱动miR-181a序列表达的调节元件，如miR-181a-1或miR-181a-2启动子。在一些实施方式中，调节元件是组成性活性启动子。在一些实施方式中，组成性活性启动子选自SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK或CAGG。在一些实施方式中，调节元件是条件启动子、增强子、或反式激活子。在一些实施方式中，条件启动子、增强子、或反式激活子是诱导型启动子、增强子、或反式激活子或可阻抑启动子、增强子、或反式激活子。在一些实施方式中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西霉素操作子序列、或其类似物。与衍生修饰的T细胞的缺乏***核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含***到其基因组中的核酸分子，该核酸分子上调内源性miR-181a-1或miR-181a-2。在一些实施方式中，内源性miR-181a-1被上调。在一些实施方式中，内源性miR-181a-2被上调。在一些实施方式中，***的核酸分子包含能够增加miR-181a基因的转录的调节元件。在一些实施方式中，调节元件能够募集RNA聚合酶II机制。在一些实施方式中，调节元件是启动子，并替换miR-181a基因的内源性启动子。在一些实施方式中，启动子是组成性活性启动子。在一些实施方式中，组成性活性启动子选自SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK或CAGG。在一些实施方式中，调节元件是条件启动子、增强子、或反式激活子。在一些实施方式中，条件启动子、增强子、或反式激活子是诱导型启动子、增强子、或反式激活子、或可阻抑启动子、增强子、或反式激活子。在一些实施方式中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西霉素操纵子序列、或其类似物。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含***到其基因组中使得两个内源性miR-181基因被上调的核酸分子。与衍生修饰的T细胞的缺乏***核酸分子的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含对内源性miR-181a-1或miR-181a-2基因的修饰，该修饰导致其mRNA转录物的稳定性增加。在一些实施方式中，内源性miR-181a-1基因被修饰以增加其mRNA转录物的稳定性。在一些实施方式中，内源性miR-181a-2基因被修饰以增加其mRNA转录物的稳定性。在一些实施方式中，两个内源性miR-181a基因被修饰以增加其RNA转录物的稳定性。与衍生修饰的T细胞的缺乏修饰的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

在一些实施方式中，修饰的T细胞群体识别CAA，其中修饰的T细胞包含导致内源性miR-181a-1或miR-181a-2基因的转录增加的序列-引导的复合物。在一些实施方式中，序列-引导的复合物增加内源性miR-181a-1的表达。在一些实施方式中，序列-引导的复合物增加内源性miR-181a-2的表达。在一些实施方式中，序列-引导的复合物包含与融合蛋白相关的引导核苷酸，包括a)第一结构域，其能够被靶向至与引导核苷酸互补的识别位点；和b)第二结构域，其是RNA聚合酶II的激活子。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含编码引导核苷酸的第一核酸分子。在一些实施方式中，第一核酸分子被***到修饰的T细胞的基因组中。在一些实施方式中，修饰的T细胞包含编码融合蛋白的第二核酸分子。在一些实施方式中，第二核酸分子被***到修饰的T细胞的基因组中。在一些实施方式中，引导核苷酸是RNA分子，并且融合蛋白的第一结构域包含RNA-引导的核酸内切酶或其变体，如核酸酶缺陷的变体。在一些实施方式中，融合蛋白的第一结构域包含核酸酶死亡的CRISPR-相关的核酸内切酶，如核酸酶死亡的Cas9(dCas9)。在一些实施方式中，引导核苷酸是DNA分子，并且融合蛋白的第一结构域包含DNA-引导的核酸内切酶或其变体，如核酸酶缺陷的变体。在一些实施方式中，融合蛋白的第一结构域包含核酸酶死亡的格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(Natronobacterium gregoryi Argonaute)(NgAgo)核酸内切酶。与衍生修饰的T细胞的缺乏修饰的输入的T细胞相比，修饰的T细胞对CAA具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，与输入的T细胞相比，修饰的T细胞对免疫抑制和/或衰竭的易感性降低。在一些实施方式中，修饰的T细胞具有降低的免疫检查点抑制剂PD-1的表达。在一些实施方式中，修饰的T细胞识别一种或多种另外的CAAs。在一些实施方式中，从实体瘤分离输入的T细胞。在一些实施方式中，CAA和/或一种或多种另外的CAAs由来自实体瘤的癌细胞表达或与来自实体瘤的癌细胞相关。

修饰的T细胞的制备

本文描述的方法在一些实施方式中采用用于制备和培养本文提供的修饰的T细胞的方法。

细胞来源

用于工程化的输入的细胞和含有输入细胞的组合物通常从样品(如生物样品，例如从个体获得的生物样品或源自个体的生物样品)中分离。在一些实施方式中，从其分离细胞的个体是患有特定疾病或状况或需要细胞疗法或将给予细胞疗法的个体。个体在一些实施方式中为哺乳动物，如人、如需要特定治疗干预(如分离、处理、和/或工程化细胞过继细胞疗法)的个体。

因此，输入的细胞在一些实施方式中为原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自个体的组织、流体、和其它样品、以及由一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程(例如用病毒载体转导)、洗涤、和/或培育)产生的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或被处理的样品。生物样品包括但不限于肿瘤片段、体液，如血液、血浆、血清、扁桃体、和骨髓，包括源自其的处理样品(如消化的肿瘤细胞悬浮液)。在一些实施方式中，源自其或从其分离细胞的样品是一种或多种肿瘤片段。在一些方面，源自其或从其分离细胞的样品是血液或源自血液的样品，或者是单采血液成分术产物或白细胞提取法产物，或源自单采血液成分术产物或白细胞提取法产物。示例性样品包括肿瘤片段、全血、外周血单核细胞(PBMCs)、白细胞、和骨髓、和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的环境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方式中，输入的细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人零长类和猪。

细胞处理、制备、和分离

在一些实施方式中，输入的细胞的分离包括一个或多个制备和/或细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心、和/或培育细胞，例如，以去除不需要的组分、富集期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，根据一种或多种性质(如亲和力、密度、粘附性质、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性)分离细胞。

在一些实施方式中，获得来自个体的一个或多个肿瘤片段的细胞。在一些方面，样品含有包括T细胞的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)。可以通过在一种或多种生长促进物质的存在下培养一种或多种肿瘤片段、或源自其的细胞来实现TILs的扩增。参见，例如，WO2015157636、WO2016096903、和Wu,R.,et al.(2012).Cancer journal(Sudbury,Mass.),18(2),160。

在一些实施方式中，自体TILs获自切除的肿瘤的基质。在一些实施方式中，肿瘤样品获自个体，并且获得单个细胞悬浮液。可以以任何合适的方式(例如，机械地(使用例如，gentleMACS(TM)Dissociator,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.解聚细胞)或酶促地(例如，胶原酶或DNA酶(DNase))获得单个细胞悬浮液。

无论在修饰输入的T细胞以产生本文所述的修饰的T细胞之前还是之后，通常可以使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法激活和扩增T细胞。

通常，T细胞通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和任选地刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体地，可以如通过与抗CD3抗体、或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过结合钙离子载体而接触蛋白激酶C激活子(例如，苔藓抑制素)来刺激T细胞群体。为共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的增殖，可以如本领域公知的其它方法一样使用抗CD3抗体和抗CD28抗体(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,

France)。

在一些实施方式中，通过本领域已知的多种方法中的任一种来完成淋巴细胞(包括肿瘤浸润性淋巴细胞，如T细胞)的扩增。例如，在一些实施方式中，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21、或其组合的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激扩速扩增T细胞。在一些实施方式中，非特异性T细胞受体刺激物可以包括例如，小鼠单克隆抗CD3抗体(如OKT3)。在其它实施方式中，在T细胞生长因子的存在下，通过用T细胞(包括其抗原部分和呈递这种抗原的细胞)识别的一种或多种抗原在体外刺激而快速扩增T细胞。在一些实施方式中，通过用脉冲到抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原(一种或多种)重新刺激来快速扩增体外诱导的T细胞。在一些实施方式中，例如，用照射的自体淋巴细胞或用照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2重新刺激T细胞。可以通过本领域已知的任何方法(例如，通过在与肿瘤细胞共培养之后测量细胞因子的释放(例如，干扰素-γ))来测试扩增的TILs的特异性肿瘤反应性。

在一些实施方式中，方法包括在快速扩增细胞之前针对CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、和/或CD45RO⁺T细胞亚群富集培养的TILs。在一些实施方式中，通过阳性或阴性选择技术分离T细胞的特定亚群。例如，在一些实施方式中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)-缀合的珠子(如M-450CD3/CD28T)一起培育足以对期望的T细胞进行阳性选择的时间段来分离T细胞。在一些实施方式中，时间段为约30分钟。在一些实施方式中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其之间的所有整数值。在一些实施方式中，时间段为至少1、2、3、4、5、或6小时。在一些实施方式中，时间段为10至24小时。在一些实施方式中，培育时间段为24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用较长的培育时间(如24小时)可以增加细胞产量。在与其它细胞类型相比存在少量T细胞的任何情况下，较长的培育时间可以用于分离T细胞，如从肿瘤组织或从免疫受损的个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。进一步，使用较长的培育时间可以增加CD8⁺T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合至CD3/CD28珠子的时间和/或通过增加或降低珠子与T细胞的比，可以在处理期间的培养开始或其它时间点优选地对或针对T细胞的亚群进行选择。另外地，通过增加或降低珠子或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比，可以在培养开始或在其它期望的时间点优选地对或针对T细胞的亚群进行选择。技术人员将认识到也可以在本发明的上下文中使用多轮选择。在一些实施方式中，可以期望执行选择程序，并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经历进一步的多轮选择。

通过阴性选择富集T细胞群体可以通过针对阴性选择细胞独特的表面标志物的抗体的组合来完成。一种方法是通过负磁免疫粘附(negative magnetic immunoadherence)或流式细胞术(其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物)进行的细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR、和CD8的抗体。在一些实施方式中，可以期望富集或阳性选择通常表达CD4⁺、CD25⁺、CD62Lhi、GITR⁺、和FoxP3⁺的调节性T细胞。可选地，在一些实施方式中，T调节性细胞由抗CD25缀合的珠子或其它类似的选择方法去除。

为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群体，细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度可以变化。在一些实施方式中，可以期望显著减小珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞与珠子的最大接触。例如，在一些实施方式中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方式中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方式中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施方式中，使用约1,000万、1,500万、2,000万、2,500万、3,000万、3,500万、4,000万、4,500万或5,000万个细胞/ml中的任一个的细胞浓度。在一些实施方式中，使用约7,500万、8,000万、8,500万、9,000万、9,500万或1亿个细胞/ml中的任一个的细胞浓度。在一些实施方式中，使用约1.25亿或约1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获细胞，该细胞可能弱表达感兴趣的目标抗原(如CD28阴性T细胞)，或来自存在多个肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)。这样的细胞群体可能具有治疗价值，并且将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8⁺T细胞。

在一些实施方式中，在IL-2中培养TILs之后，使用例如CD8微珠分离(例如，使用

CD8微珠系统(Miltenyi Biotec))去除T细胞的CD4+细胞并富集CD8+细胞。

在一些实施方式中，TILs在两个阶段中离体扩增。在一些实施方式中，第一阶段包括从一个或多个肿瘤片段或消化的肿瘤细胞悬浮液中初始扩增TILs，例如，在具有IL-2的培养基中历时5周的时间。在一些实施方式中，例如用新鲜IL-2定期进行培养基交换，以确保在此时间期间持续的T细胞***和存活。此第一阶段产生产物(“pre-REP”TIL)，该产物然后被用于遵循“快速扩增方案”(REP)生成最终的TIL输注产物。在一些实施方式中，pre-REPTILs在该过程的此阶段被冷藏，以用于以后在REP中的二次扩增。在一些实施方式中，pre-REP TILs立即被使用。在一些实施方式中，REP包括例如任选地在例如200:1比率的从患者(自体饲养者)或从正常健康共体(同种异体饲养者)获得的照射(5,000cGy)PBMC饲养细胞的存在下，通过使用抗CD3mAb的CD3复合物激活TILs。在一些实施方式中，在REP启动后(例如，在REP启动后两天)添加IL-2(如6,000U/ml IL-2(终浓度))以驱动激活的TILs中的快速细胞***。在一些实施方式中，然后TILs被扩增例如另外12天，并根据需要例如用含有IL-2的1:1培养基稀释。

在一些实例中，例如通过单采血液成分术或白细胞提取法从个体的循环血液中获得细胞。样品在一些方面含有淋巴细胞，包括T细胞。

在一些实施方式中，洗涤从个体收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，以用于后续处理步骤。在一些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方式中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明，通过半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明，通过切向流过滤(tangential flow filtration)(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方式中，在洗涤后将细胞重悬浮在多种生物相容性缓冲液(如，例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方式中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。

在一些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。

冷藏

在一些实施方式中，制备方法包括冷冻步骤，例如在分离、培育和/或工程化之前或之后将细胞冷藏。在一些实施方式中，冷冻和随后的解冻步骤去除了细胞群体中的粒细胞，并且在一些程度上去除了单核细胞。在一些实施方式中，例如在洗涤步骤以去除血浆和血小板之后，将细胞悬浮在冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个实例包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基以1:1稀释，使得DMSO和HAS的终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并存储在液氮储存罐的气相中。

在一些实施方式中，提供的方法包括培养、培育、培养和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于培育和/或工程化消耗的细胞群体和培养起始组合物的方法。

因此，在一些实施方式中，将细胞群体培养在培育在起始组合物中。培育和/或工程化可以在培养容器(如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋、或用于培养基或培养细胞的其它容器)中。

培育和培养

在一些实施方式中，在基因工程以前或与基因工程一起培育和/或培养细胞。培育步骤可以包括培养(culture)、培养(cultivation)、刺激、激活、和/或繁殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂的存在下培育组合物或细胞。此类条件包括被设计以诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活、和/或存活，以模拟抗原暴露和/或以引发细胞进行基因工程(如用于引入基因工程外源性蛋白和/或受体)的条件。

条件可以包括特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体、和被设计以激活细胞的任何其它试剂中的一种或多种。

在一些实施方式中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常在37摄氏度或约37摄氏度。

在一些方面，方法包括评价修饰的T细胞或工程化的细胞的表面上一种或多种标志物的表达。在一个实施方式中，方法包括例如通过基于亲和力的检测方法(如通过流式细胞术)评价特定T细胞谱系的一种或多种表面标志物的表面表达。

修饰

本文描述的方法在一些实施方式中采用产生修饰的T细胞群体的方法，包括向识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入编码包含miRNA的RNA转录物的外源性核酸分子中，其中miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，miRNA靶向多种T细胞mRNAs，该T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。在一些实施方式中，miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的环区。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。在一些实施方式中，RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。在一些实施方式中，RNA转录物包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，RNA转录物相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。在一些实施方式中，RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。在一些实施方式中，相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，外源性核酸分子如通过同源重组被引入输入的T细胞群体的基因组的目标基因座中。在一些实施方式中，外源性核酸分子被引入输入的T细胞群体的基因组中的随机基因座中。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体的实体瘤中分离T细胞。

细胞修饰的方法，如将核酸分子引入细胞基因组中、阻抑基因表达和激活基因表达是本领域公知的并在以下更详细地描述。

在一些实施方式中，生产修饰的T细胞群体的方法包括向识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入增加内源性miR-181a表达的第一修饰，其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的TCR信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。在一些实施方式中，第一修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，其包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶-缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，其将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。在一些实施方式中，miR-181a基因是miR-181a-1。在一些实施方式中，miR-181a基因是miR-181a-2。在一些实施方式中，第一修饰包括将增加miR-181a表达的核酸分子引入T细胞的基因组中。在一些实施方式中，核酸分子编码miR-181a。在一些实施方式中，核酸分子包括启动子序列并且被***使得启动子序列与miR-181a基因(miR-181a-1或miR-181a-2)可操作地连接。在一些实施方式中，通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入核酸分子。在一些实施方式中，如通过同源重组将核酸分子引入输入的T细胞群体的基因组的目标基因座中。在一些实施方式中，核酸分子被引入输入的T细胞群体的基因组的随机基因座中。在一些实施方式中，第一修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。在一些实施方式中，方法进一步包括从个体分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。在一些实施方式中，从个体的实体瘤中分离T细胞。

组合物

本文描述的方法在一些实施方式中采用含有通过提供的方法产生的工程化细胞的组合物。在组合物中，为用于给药(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和制剂。

在一些实施方式中，将细胞和细胞群体以组合物(如药物组合物)的形式给予个体。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱、长春新碱等。在一些实施方式中，组合物中的细胞群体为盐的形式，例如，药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸、和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些。

在一些实施方式中，药物组合物中载剂的选择部分地由特定修饰的T细胞，以及由用于给予修饰的T细胞的特定方法确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量可以为按总组合物的重量计约0.0001％至约2％。

另外，缓冲剂在一些方面包括在组合物中。合适的缓冲剂包括例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾、和各种其它酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细描述于例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed(2005年5月1日)中。

在某些实施方式中，包含本文描述的细胞群体的药物组合物可以配制成包合复合物，如环糊精包合复合物、或脂质体。脂质体可以用于将宿主细胞(例如，T细胞或NK细胞)靶向特定组织。多种方法可用于制备脂质体，如描述于例如，Szoka et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)，和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028、和5,019,369中的那些。

药物组合物在一些方面可以采用时间释放(time-released)、延迟释放、和持续释放的递送系统，使得组合物的递送发生在要治疗的部位致敏之前，并且有足够的时间使要治疗的部位致敏。多种类型的释放递送系统是可用的，并且是本领域技术人员已知的。这样的系统可以避免组合物的重复给药，进而增加对象和医师的便利性。

一些实施方式中的药物组合物包含有效治疗或预防疾病或状况的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方式中，通过周期性评价治疗的对象来监测治疗或预防功效。对于几天或更长时间的重复给药，根据状况，重复治疗直至出现疾病症状的期望抑制。然而，其它剂量方案可能是有用的并且可以被确定。通过单次大剂量给予组合物、通过多次大剂量给予组合物、或通过连续输注给予组合物来递送期望的剂量。

细胞修饰的方法

在一些实施方式中，本文描述的修饰的T细胞包含一种或多种外源性核酸分子。在一些实施方式中，一种或多种基因的表达、活性、和/或功能在本文所述的修饰的T中被修饰。提供了实现这种修饰的方法。

在一些实施方式中，修饰是引入外源性核酸分子。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码miR-181a的序列。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码pre-miR-181a-1或pre-miR-181a-2的序列。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码pri-miR-181a-1或pri-miR-181a-2的序列。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码修饰的miR-181a的序列。在一些实施方式中，修饰的miR-181a包含人miR-181a的种子序列。在一些实施方式中，外源性核酸包含调节元件，如启动子。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码T细胞激活受体的序列。在一些实施方式中，外源性核酸包含编码免疫检查点抑制剂的显性负配体的序列。

在一些实施方式中，修饰是基因阻抑。在一些实施方式中，通过实现基因(基因编辑)的破坏，如敲除、***、错义或移码突变(如双等位基因移码突变)、基因的全部或部分(例如，一个或多个外显子或其部分)的缺失、和/或敲入来进行基因阻抑。在一些实施方式中，通过被具体设计以靶向基因或其部分的序列的序列特异性或靶向的核酸酶(包括DNA结合靶向核酸酶(如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应子核酸酶(TALENs))和RNA引导的核酸酶(如CRISPR相关的核酸酶(Cas))实现这种破坏。

在一些实施方式中，通过引入靶向该基因的抑制性核酸分子来进行基因阻抑。在一些实施方式中，抑制性核酸包括小干扰RNA(siRNA)、microRNA适应的shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、microRNA(miRNA-前体)或microRNA(miRNA)。

在一些实施方式中，修饰是基因激活。在一些实施方式中，通过增加基因的拷贝数(如基因的敲入)，或通过激活基因的转录和/或翻译进行基因激活。在一些实施方式中，通过RNA引导的核酸酶(如CRISPR相关的核酸酶(Cas)结合包含该基因的编码序列的供体模板来实现敲入。在一些实施方式中，通过RNA引导的核酸酶(如CRISPR相关的核酸酶(Cas)，其包含核酸酶失活的突变并与转录激活子融合)实现转录激活。

核酸分子的引入

在一些实施方式中，使用重组感染性病毒颗粒(如，例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、或腺伴随病毒(AAV)的载体)将本文所述的核酸分子转移至细胞(如T细胞)中。在一些实施方式中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将核酸转移至细胞中(参见，例如，Koste et al.(2014)Gene Therapy 2014Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens et al.(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino etal.(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park et al.,TrendsBiotechnol.2011November；29(11):550–557。

在一些实施方式中，逆转录病毒载体具有长的末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼小鼠白血病毒(MoMLV)、骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)、小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、小鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(spleen focus forming virus)(SFFV)、或腺伴随病毒(AAV)的逆转录病毒载体。多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是两性的，这意味着其能够感染包括人的若干物种的宿主细胞。在一个实施方式中，待表达的基因替代了逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了多种示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al.(1991)Virology180:849-852；Burns et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。

慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如，Wang et al.(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper et al.(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyenet al.(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri et al.(2003)Blood.102(2):497-505中。

在一些实施方式中，本文所述的核酸通过电穿孔转移至细胞(如T细胞)中(参见，例如，Chicaybam et al.,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298and Van Tedeloo et al.(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，核酸通过转座转移至细胞中(参见，例如，Manuri et al.(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma et al.(2013)MolecTher Nucl Acids 2,e74；和Huang et al.(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传材料的其它方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(tungsten particle-facilitatedmicroparticle bombardment)(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码外源性蛋白质的基因工程化的核酸的其它方法和载体包括例如在国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。

在一些实施方式中，本文所述的核酸被引入修饰的T细胞的随机基因座中。在一些实施方式中，核酸被***随机基因座中。在一些实施方式中，核酸替换随机基因座的全部或部分。使用基因工程(如通过病毒转导)引入转基因的技术是本领域公知的。参见例如WO9429438、WO9533824、WO9712052、WO200111067、WO200218609、WO2013014537、和WO2014026110。

在一些实施方式中，本文所述的核酸被整合到修饰的T细胞的目标基因座中。在一些实施方式中，核酸包括允许通过同源重组在目标基因座处整合的序列。在一些实施方式中，核酸包含与目标基因座处的序列同源的侧翼序列。在一些实施方式中，核酸被***到目标基因座中。在一些实施方式中，核酸替换目标基因座的全部或部分。在一些实施方式中，通过由选自锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)、或RNA引导的核酸酶(RGNs)的设计核酸酶(designer nuclease)介导目标基因座中的整合。在一些实施方式中，RGN是聚集的、规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas9(CRISPR-Cas9)核酸酶。使用CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术是本领域已知的。参见例如Auer,T.O.et al.(2014)Genome research 24(1):142-153；Kimura,Y.,et al.(2014)Scientific reports,4；Aida,T.,et al.(2015)Genome biology,16(1):1；和Park,A.,et al.(2014)PloS one,9(4):e95101。

在一些实施方式中，本文所述的核酸被整合到修饰的T细胞的目标基因座中，其中目标基因座是miR-181a基因座。在一些实施方式中，miR-181a基因座是miR-181a-1基因座。在一些实施方式中，miR-181a基因座是miR-181a-2基因座。在一些实施方式中，核酸被整合到miR-181a基因座中，使得不能表达由该基因座编码的内源性miR-181a。在一些实施方式中，核酸被整合到miR-181a基因座中，使得仍可以表达由基因座编码的内源性miR-181a。在一些实施方式中，核酸被***miR-181a基因座中，而无需替换任何序列。在一些实施方式中，核酸被***到编码初级miR-181a的序列的上游。在一些实施方式中，核酸与miR-181a基因座处的启动子和/或增强子可操作地连接。在一些其它实施方式中，核酸替换miR-181a基因座的全部或部分，如编码初级miR-181a的序列的全部或部分。在一些实施方式中，核酸替换miR-181a基因座的全部或部分，并且包含足以表达由核酸编码的产物的调节序列(例如，修饰的miR-181a)。在一些实施方式中，核酸替换miR-181a基因座的部分，如编码初级miR-181a的序列的部分。在一些实施方式中，核酸不替换miR-181a基因座处的一个或多个调节序列，并且包含与一个或多个剩余的调节序列可操作地连接的编码修饰的miR-181a的序列，使得在整合修饰的miR-181a之前，修饰的miR-181a类似于内源性miR-181a被调节。在一些这种实施方式中，核酸可以包含初级miR-181a的修饰的部分，使得修饰的miR-181a被表达为包括内源性miR-181a的部分的嵌合体。

引入的另外的核酸包括包含下列的核酸：(1)如通过促进修饰的T细胞的生存力和/或功能来改善治疗功效的基因(例如，编码免疫检查点抑制剂的激活受体或显性负配体的基因)；(2)为选择和/或评价细胞选择(如评价体内存活或定位)提供遗传标志物的基因；和/或(3)例如，通过使修饰的T细胞易于在体内进行阴性选择以改善安全性的基因，如Lupton S.D.et al.,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell et al.,Human GeneTherapy 3:319-338(1992)中所述；还参见Lupton et al.的出版物PCT/US91/08442和PCT/US94/05601，描述了源自显性阳性选择标志物与阴性选择标志物融合的双功能选择融合基因的用途。参见，例如，Riddell et al.，美国专利号6,040,177，第14-17栏。

基因阻抑

在一些实施方式中，通过破外基因来进行基因的表达、活性、和/或功能的阻抑。在一些方面，基因被破坏，使得与缺乏基因破坏或缺乏被引入以影响破坏的组分下的表达相比，其表达降低了至少或约20、30、或40％，通常至少或约50、60、70、80、90、或95％。

在一些实施方式中，通常通过以目标方式在基因中诱导一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂来进行基因破坏。在一些实施方式中，双链或单链断裂是由核酸酶(例如核酸内切酶，如基因靶向的核酸酶)造成。在一些方面，在基因的编码区(例如外显子中)诱导断裂。例如，在一些实施方式中，诱导发生在编码区的N-末端部分附近，例如第一外显子中、第二外显子中、或随后的外显子中。

在一些方面，双链或单链断裂通过细胞修复过程(如通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))进行修复。在一些方面，修复工程是易错的(error-prone)并导致基因的破坏，如，移码突变，例如双等位基因移码突变，这可导致基因的完全敲除。例如，在一些方面，破坏包括诱导缺失、突变、和/或***。在一些实施方式中，破坏导致早期终止密码子的存在。在一些方面，***、缺失、易位、移码突变、和/或早期终止密码子的存在导致基因的表达、活性和/或功能的阻抑。

在一些实施方式中，阻抑是短暂或可逆的，使得在稍后的时间恢复基因的表达。在其它实施方式中，抑制是不可逆的或短暂的，例如是永久的。

在一些实施方式中，使用反义技术，如通过RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、和/或核酶来选择性地抑制或阻抑基因的表达来实现基因阻抑。siRNA技术包括基于利用双链RNA分子的RNAi的技术，该RNA分子具有与从该基因转录的mRNA的核苷酸序列同源的序列，以及与核苷酸序列互补的序列。siRNA通常与从基因转录的mRNA的一个区同源/互补，或者可以是包括与不同区同源/互补的多个RNA分子的siRNA。

DNA靶向分子和复合物；目标核酸内切酶

在一些实施方式中，使用与基因特异性结合或杂交的DNA靶向分子(如DNA结合蛋白或DNA结合核酸、或含有其的复合物、化合物、或组合物)实现阻抑。在一些实施方式中，DNA靶向分子包含DNA结合结构域，例如，锌指蛋白质(ZFP)DNA结合机构域、转录激活因子样蛋白质(TAL)或TAL效应子(TALE)DNA结合结构域、聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)DNA结合结构域、或来自mega核酸酶的DNA结合结构域。

可以“工程化”锌指、TALE、和CRISPR系统结合结构域，以例如通过工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区而与预定的核苷酸序列结合。工程化的DNA结合蛋白(锌指或TALEs)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用替代规则和计算机化算法，以处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；也参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496以及美国公开号20110301073。

在一些实施方式中，DNA靶向分子、复合物或组合含有DNA结合分子和一个或多个另外的结构域(如效应子结构域)，以促进基因的阻抑或破坏。例如，在一些实施方式中，通过包含DNA结合蛋白和异源调节结构域或其功能片段的融合蛋白进行基因破坏。在一些方面，结构域包括例如，转录因子结构域，如激活因子、阻抑因子、共激活因子、共阻抑因子、沉默子、致癌基因、DNA修复酶及其相关因子和修饰物、DNA重排酶(DNArearrangementenzymes)及其相关因子和修饰物、染色质相关蛋白及其修饰物，例如激酶、乙酰化酶和脱乙酰酶、和DNA修饰酶，例如甲基转移酶、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶及其相关因子和修饰物。参见，例如，美国专利申请公开号20050064474；20060188987和2007/0218528，其关于DNA结合结构域和核酸酶切割结构域的融合的细节以其整体通过引用并入本文。在一些方面，另外的结构域是核酸酶结构域。因此，在一些实施方式中，使用由与非特异性DNA切割分子(如核酸酶)融合或复合的序列特异性DNA结合结构域组成的工程化蛋白(如核酸酶和含核酸酶-复合物或融合蛋白)，通过基因编辑或基因组编辑促进基因破坏。

在一些方面，这些靶向的嵌合核酸酶或含核酸酶的复合物通过诱导靶向的双链断裂或单链断裂、刺激细胞DNA修复机制(包括易错的非同源末端结合(NHEJ)和同源定向的修复(HDR))进行精确的基因修饰。在一些实施方式中，核酸酶是核酸内切酶，如锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)、RNA引导的核酸内切酶(RGEN)，如CRISPR相关(Cas)蛋白、或mega核酸酶。

在一些实施方式中，在引入DSBs之后，HDR在基因编辑的位点***供体核酸，例如编码外源性蛋白和/或重组受体的供体质粒或核酸。因此，在一些实施方式中，基因的破坏和编码外源性蛋白质和/或重组受体的核酸的引入是同时进行的，由此编码外源性蛋白质和/或重组受体的核酸的敲入或***部分地破坏基因。

在一些实施方式中，没有***供体核酸。在一些方面，引入DSBs后，NHEJ介导的修复导致***或缺失突变，其可以例如通过产生错义突变或移码而引起基因破坏。

ZFPs和ZFNs；TALs、TALEs、和TALENs

在一些实施方式中，DNA靶向分子包括DNA结合蛋白，如与效应子蛋白(如核酸内切酶)融合的一个或多个锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样蛋白(TAL)。实例包括ZFNs、TALEs、和TALENs。参见Lloyd et al.,Fronteirs in Immunology,4(221),1-7(2013)。

在一些实施方式中，DNA靶向分子包含以序列特异性方式结合DNA的一种或多种锌指蛋白质(ZFPs)或其结构域。ZFP或其结构域是蛋白质或较大蛋白质内的结构域，其通过一个或多个锌指、结合结构域(其结构通过锌离子的配位而稳定)内的氨基酸序列的区域以序列特异性方式结合DNA。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

在ZFPs中是由个体手指的组装生成的靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，该特定DNA序列的长度通常为9-18个核苷酸。

ZFPs包括其中单个手指结构域长度为大约30个氨基酸并且含有α螺旋的那些，该α螺旋含有两个不变的组氨酸残基，该组氨酸残基通过锌与一个β转角的两个半胱氨酸配位，并且具有两个、三个、四个、五个、或六个锌指。通常，可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)上进行氨基酸取代来改变ZFP的序列特异性。因此，在一些实施方式中，ZFP或含ZFP的分子是天然存在的，例如，被工程化以结合选择的目标位点。参见，例如，Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所有以其整体通过引用并入本文。

在一些方面，通过使基因中的第一目标位点与第一ZFP接触进而阻抑基因来进行基因的阻抑。在一些实施方式中，基因中的目标位点与包含六个手指和调节结构域的融合ZFP接触，进而抑制基因的表达。

在一些实施方式中，接触的步骤进一步包括使基因中的第二目标位点与第二ZFP接触。在一些方面，第一目标位点与第二目标位点相邻。在一些实施方式中，第一ZFP和第二ZFP是共价连接的。在一些方面，第一ZFP是包含调节结构域或至少两个调节结构域的融合蛋白。在一些实施方式中，第一ZFP和第二ZFP是融合蛋白，其各自包含调节结构域或各自包含至少两个调节结构域。在一些实施方式中，调节结构域是转录阻抑剂、转录激活子、核酸内切酶、甲基转移酶、组蛋白乙酰转移酶、或组蛋白脱乙酰酶。

在一些实施方式中，ZFP由与启动子可操作地连接的ZFP核酸编码。在一些方面，方法进一步包括下列步骤：首先将核酸以脂质：核酸复合物或裸核酸形式将核酸给予细胞。在一些实施方式中，ZFP由包含与启动子可操作地连接的ZFP核酸的表达载体编码。在一些实施方式中，ZFP由与诱导型启动子可操作地连接的核酸编码。在一些方面，ZFP由与弱启动子可操作地连接的核酸编码。

在一些实施方式中，目标位点在基因的转录起始位点的上游。在一些方面，目标位点与基因的转录起始位点相邻。在一些方面，目标位点与基因的转录起始位点下游的RNA聚合酶停顿位点(RNA polymerase pause site)相邻。

在一些实施方式中，DNA靶向分子是或包含与DNA切割结构域融合以形成锌指核酸酶(ZFN)的锌指DNA结合结构域。在一些实施方式中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个可以被工程化或可以不被工程化的锌指结合结构域。在一些实施方式中，切割结构域来自IIS型限制性核酸内切酶Fok I。Fok I通常在一条链上距其识别位点9个核苷酸和另一条链距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。

在一些实施方式中，ZFNs靶向修饰的T细胞中存在的基因。在一些方面，ZFNs例如在基因的编码区中的预定位点处有效地产生双链断裂(DSB)。靶向的典型区域包括外显子、编码N-末端区域的区域、第一外显子、第二外显子、和启动子或增强子区域。在一些实施方式中，ZFNs的瞬时表达促进修饰的T细胞中目标基因的高效和永久破坏。具体地，在一些实施方式中，ZFNs的递送导致基因的永久破坏，效率超过50％。

多种基因特异性工程化锌指可商购获得。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)已与Sigma–Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了用于锌指构造的平台(CompoZr)，从而使研究人员绕过锌指构造并一起验证，并提供针对数千种蛋白质的特异性靶向的锌指。Gaj et al.,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405。在一些实施方式中，使用或定制设计可商购获得的锌指(参见，例如，Sigma-Aldrich目录号CSTZFND、CSTZFN、CTI1-1KT、和PZD0020)。

TALEs和TALENs

在一些实施方式中，DNA靶向分子如在转录激活因子样蛋白质效应子(TALE)蛋白质中包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录激活因子样蛋白质(TAL)DNA结合结构域，参见，例如，以其整体通过引用并入本文的美国专利公开号20110301073。

TALE DNA结合结构域或TALE是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域包括TALE与其同源目标DNA序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复序列”)的长度通常为33-35个氨基酸，并且与天然存在的TALE蛋白内的其它TALE重复序列表现出至少一些序列同源性。每个TALE重复单元包括组成重复可变残基(RVD)的1或2个DNA结合残基，其通常位于重复序列的12和/或13位。已确定了这些TALEs的用于DNA识别的天然(规范)密码子，使得12和13位的HD序列致使与胞嘧啶(C)结合、NG与T结合、NI与A结合、NN与G或A结合、并且NG与T结合，并且非规范(非典型)RVDs也是已知的。参见，美国专利公开号20110301073。在一些实施方式中，可以通过设计对目标DNA序列具有特异性的TAL阵列将TALEs靶向至任何基因。目标序列通常以胸苷开始。

在一些实施方式中，分子是DNA结合核酸内切酶(如TALE-核酸酶(TALEN))的DNA。在一些方面，TALEN是融合蛋白，其包含源自TALE的DNA结合结构域和切割核酸目标序列的核酸酶催化结构域。在一些实施方式中，TALE DNA结合结构域已被工程化以与编码目标抗原和/或免疫抑制分子的基因内的目标序列结合。例如，在一些方面，TALEDNA结合结构域可以靶向CD38和/或腺苷受体，如A2AR。

在一些实施方式中，TALEN识别并切割基因中的目标序列。在一些方面，DNA的切割导致双链断裂。在一些方面，断裂刺激同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的速率。通常，NHEJ是不完善的修复过程，其通常导致切割位点的DNA序列改变。在一些方面，修复机制包括通过直接重新连接(Critchlow and Jackson,Trends Biochem Sci.1998Oct；23(10):394-8)或通过所谓的微同源性介导的末端连接来重新结合两个DNA末端的残基。在一些实施方式中，经由NHEJ的修复导致小的***或缺失，并且可以用于破坏并进而阻抑基因。在一些实施方式中，修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失、或添加。在一些方面，可以通过本领域公知的方法鉴定和/或选择已发生切割诱导的诱变事件(即与NHEJ事件连续的诱变事件)的细胞。

在一些实施方式中，TALE重复序列被组装以特异性地靶向基因(Gaj et al.,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405)。已经构建了靶向18,740个人蛋白编码基因的TALENs的文库(Kim et al.,Nature Biotechnology.31,251–258(2013))。定制设计的TALE阵列可通过Cellectis Bioresearch(Paris,France)、TransposagenBiopharmaceuticals(Lexington,KY,USA)、和Life Technologies(Grand Island,NY,USA)商购获得。具体地，靶向CD38的TALENs可商购获得(参见Gencopoeia，目录号HTN222870-1、HTN222870-2、和HTN222870-3，可从World Wide Web以www.genecopoeia.com/product/search/detail.php？prt＝26&cid＝&key＝HTN222870获得)。示例性的分子描述于例如美国专利公开号US 2014/0120622、和2013/0315884。

在一些实施方式中，TALENs作为由一种或多种质粒载体编码的转基因被引入。在一些方面，质粒载体可以含有选择标志物，其提供用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。

RGENs(CRISPR/Cas系统)

在一些实施方式中，使用一种或多种DNA结合核酸进行阻抑，如经由RNA引导的核酸内切酶(RGEN)进行破坏，或通过另一种RNA引导的效应分子进行其它形式的阻抑。例如，在一些实施方式中，使用聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关的(Cas)蛋白进行阻抑。参见Sander和Joung,Nature Biotechnology,32(4):347-355。

总体上，“CRISPR系统”共同地指代CRISPR相关(“Cas”)基因的活性的表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因的活性中涉及的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(内源性CRISPR系统的环境中涵盖“直接重复序列”和tracrRNA处理的部分直接重复序列)、引导序列(在内源性CRISPR系统的环境中也称为“间隔子”)、和/或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。

在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括与DNA序列特异性地结合的非编码RNA分子(引导)RNA和具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白质(例如，Cas9)。

在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型、或III型CRISPR系统。在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件源自包含内源性CRISPR系统的特定生物，如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

在一些实施方式中，Cas核酸酶和gRNA(包括对目标序列特异的crRNA和固定的tracrRNA的融合)被引入细胞中。总体上，使用互补碱基配对，位于gRNA的5’末端的目标位点将Cas核酸酶靶向至目标位点，例如，基因。在一些实施方式中，根据原间隔子相邻基序(PAM)序列(如通常为NGG、或NAG)的5’的紧邻位置选择目标位点。在这方面，通过修饰引导RNA的前20个核苷酸以相应于目标DNA序列，将gRNA靶向期望的序列。

在一些实施方式中，CRISPR系统在目标位点诱导DSBs，随后如本文所述进行破坏。在其它实施方式中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在目标位点切割单链。在一些方面，使用成对的切口酶，例如以改善特异性，其每个由不同的gRNAs靶向序列对指导，使得在同时引入切口时，引入5’突出端。在其它实施方式中，无催化活性的Cas9与异源效应子结构域(如转录阻抑子或激活子)融合，以影响基因表达。

总体上，CRISPR系统的特征在于促进在目标序列的位点处形成CRISPR复合物的元件。通常，在形成CRISPR复合物的环境中，“目标序列”总体上指代被设计以与引导序列具有互补性的序列，其中目标序列与引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补不一定是需要的，条件是存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。

目标序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方式中，目标序列位于细胞的核或胞质中。在一些实施方式中，目标序列可以在细胞的细胞器内。总体上，可用于重组为包含目标序列的靶向基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源性模板多核苷酸可以被称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。

总体上，在内源性CRISPR系统的环境下，CRISPR复合物(包含与目标序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致在目标序列内或附近(例如在距离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基内)切割一条或两条链。不希望受理论束缚，可以包含野生型tracr序列的全部或部分(例如约或大于约野生型tracr序列的20、26、32、45、48、54、63、67、85、或更多个核苷酸)或由其组成的tracr序列也可以如通过沿tracr序列的至少一部分至与引导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分杂交形成CRISPR复合物的部分。在一些实施方式中，tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性，以与CRISPR复合物杂交并参与CRISPR复合物的形成。

与目标序列一样，在一些实施方式中，不一定需要完全的互补性。在一些实施方式中，当最佳比对时，tracr序列沿tracr配对序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。在一些实施方式中，将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的一种或多种载体引入细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或多个目标位点形成CRISPR复合物。例如，Cas酶、与tracr配对序列连接的引导序列、和tracr序列可以各自与单独载体上的单独调节元件可操作地连接。可选地，由相同或不同调节元件表达的两种或更多种元件可以组合在单个载体中，其中一种或多种另外的载体提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。在一些实施方式中，可以任何合适的取向排列组合在单个载体中的CRISPR系统元件，如关于第二元件的(“上游”)位于5′或关于第二元件的“下游”位于3′的一个元件。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并以相同或相反方向取向。在一些实施方式中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物和引导序列、tracr配对序列(任选地与引导序列可操作地连接)和嵌入一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，每个在不同内含子中、两个或更多个在至少一个内含子中、或所有在单个内含子中)中的一个或多个的表达。在一些实施方式中，CRISPR酶、引导序列、tracr配对序列、和tracr序列与相同启动子可操作地连接并由相同启动子表达。

在一些实施方式中，载体包含一个或多个***位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方式中，一个或多个***位点(例如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个***位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施方式中，载体包含tracr配对序列的上游，和任选地在与tracr配对序列可操作地连接的调节元件的下游的***位点，使得在将引导序列***到***位点之后并在表达引导序列时指导CRISPR复合物与真核细胞中的目标序列的序列特异性结合。在一些实施方式中，载体包含两个或更多个***位点，每个***位点位于两个tracr配对序列之间，以允许在每个位点***引导序列。在这种布置中，两个或更多个引导序列可以包含单个引导序列、两个或更多个不同的引导序列、或这些的组合中的两个或更多个拷贝。当使用多个不同的引导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应目标序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多个引导序列。在一些实施方式中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个这种含引导序列的载体，并任选地递送至细胞。

在一些实施方式中，载体包含与编码CRISP酶(如Cas蛋白)的酶编码序列可操作地连接的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰的版本。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。在一些实施方式中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，如Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶指导在目标序列(如在目标序列内和/或在目标序列的互补序列内)的位置处切割一条或两条链。在一些实施方式中，CRISPR酶指导在距离目标序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、或更多个碱基对内切割一条或两条链。在一些实施方式中，载体编码关于相应野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有目标序列的目标多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A)将来自切割两条链的核酸酶的Cas9转换成切口酶(切割单条链)。在一些实施方式中，Cas9切口酶可与引导序列(一个或多个)(例如，两个引导序列)组合使用，该引导序列分别靶向DNA目标的有义和反义链。这种组合允许两条链被切割并用于诱导NHEJ。

在一些实施方式中，编码CRISPR酶的酶编码序列是优化在特定细胞(如真核细胞)中的表达的密码子。真核细胞可以是特定有机体(如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人灵长类)的细胞或源自其的细胞。总体上，密码子优化指代通过用更频繁或最常用于此宿主细胞的基因中的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)，同时保持天然的氨基酸序列来修饰核酸序列以用于在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚(偏向性，bias)。密码子偏倚(有机体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，信使RNA(mRNA)的翻译效率进而被认为除其它外取决于翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中所选择的tRNAs的优势通常是肽合成中最常使用的密码子的反应。因此，可以根据密码子优化来定制基因以在给定有机体中最佳基因表达。在一些实施方式中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、或多个、或所有密码子)相应于最常用于特定氨基酸的密码子。

总体上，引导序列是与目标多核苷酸序列具有足够互补性以与目标序列杂交，并指导CRISPR复合物与目标序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方式中，当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列与其相应的目标序列之间的互补性程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。

可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)、和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)的算法。在一些实施方式中，引导序列的长度为约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引导序列的长度为约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12、或更少个核苷酸。可以通过任何合适的测定评价引导序列指导CRISPR复合物与目标序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分(包括要测试的引导序列)可以提供给具有相应目标序列的细胞，如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，然后如通过本文所述的Surveyor测定评价目标序列内的优选切割。类似地，可以通过提供目标序列、CRISPR复合物的组分(包括要测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列)、并比较测试引导序列与对照引导序列反应之间的目标序列处的结合或切割速率而在测试管中评价目标多核苷酸序列的切割。

可以选择引导序列以靶向任何目标序列。在一些实施方式中，目标序列是细胞的基因组内的序列。示例性的目标序列包括在目标基因中独特的那些。在一些实施方式中，选择引导序列以减少引导序列内的二级结构的程度。可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定二级结构。

总体上，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一个或多个的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中，侧翼为tracr配对序列的引导序列的切除；和(2)目标序列处CRISPR复合物的形成，其中CRISPR复合物包含与tracr序列杂交的tracr配对序列。总体上，互补性的程度参考沿两个序列中较短的一个的长度，tracr配对序列和tracr序列的最佳比对。

最佳比对可以通过任何合适的比对算法来确定，并且可以进一步考虑二级结构，如tracr序列或tracr配对序列内的自互补性。在一些实施方式中，当最佳比对时，沿两个长度中较短的一个的长度，tracr序列与tracr配对序列之间的互补性的程度为约或大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施方式中，tracr序列的长度为约或大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得两者之间的杂交产生具有二级结构的转录物，如发夹。在一些方面，用于发夹结构的环形成序列的长度为四个核苷酸，并具有序列GAAA。然而，可以使用较长或较短的环序列，也可以使用可选的序列。在一些实施方式中，序列包括核苷酸三联体(例如，AAA)和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和AAAG。在一些实施方式中，转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在一些实施方式中，转录物具有两个、三个、四个、或五个发夹。在进一步的实施方式中，转录物具有至多五个发夹。在一些实施方式中，单个转录物进一步包括转录终止序列，如polyT序列，例如六个T核苷酸。

在一些实施方式中，CRISPR酶是融合蛋白的部分，该融合蛋白包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除CRISPR酶之外为约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个结构域)。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白序列，以及任选地任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的实例包括但不限于表位标签、报道基因序列、和具有下列活性中的一种或多种的蛋白结构域：甲基化酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(influenza hemagglutinin)(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报道基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以与编码结合DNA分子或结合其它细胞分子的蛋白质或蛋白质的片段的基因序列融合，该蛋白包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合蛋白、GAL4ADNA结合结构域融合蛋白、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合蛋白。可形成包含CRISPR酶的融合蛋白的部分的另外结构域描述于通过引用并入本文的US20110059502中。在一些实施方式中，标记的CRISPR酶被用于鉴定目标序列的位置。

在一些实施方式中，与引导序列组合(和任选地与其复合)的CRISPR酶被递送至细胞。

在一些方面，目标多核苷酸在真核细胞中被修饰。在一些实施方式中，方法包括允许CRISPR复合物与目标多核苷酸结合，以影响所述目标多核苷酸的切割，进而修饰目标多核苷酸，其中CRISPR复合物包含与所述目标多核苷酸内的目标序列杂交的引导序列复合的CRISPR酶，其中所述引导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。

在一些方面，方法包括在真核细胞中修饰多核苷酸的表达。在一些实施方式中，方法包括允许CRISPR复合物与多核苷酸结合，使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或减少；其中CRISPR复合物包含与引导序列复合的CRISPR酶，该引导序列与所述多核苷酸内的目标序列杂交，其中所述引导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。

编码基因破坏分子和复合物的核酸的递送

在一些方面，编码DNA靶向分子、复合物、或组合的核酸被给予或引入细胞。通常以表达载体(如病毒表达载体)的形式给予核酸。在一些方面，表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体、或AAV表达载体。在一些方面，将编码破坏分子或复合物(如DNA靶向分子)的一种或多种多核苷酸引入细胞。在一些方面，递送是通过将一种或多种载体、其一种或多种转录物和/或从其转录的一种或多种蛋白质递送至细胞。

在一些实施方式中，由于将编码多肽的多核苷酸引入细胞中，因此多肽在细胞中原位合成。在一些方面，多肽可以在细胞外产生，然后被引入细胞内。用于将多核苷酸构建体引入动物细胞中的方法是已知的，并且作为非限制性实例包括其中多核苷酸构建体被整合到细胞的基因组中的稳定转化方法、其中多核苷酸构件体未被整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法、和病毒介导的方法。在一些实施方式中，可以通过例如，重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸引入细胞中。例如，在一些方面，瞬时转化方法包括显微注射、电穿孔、或粒子轰击。在一些实施方式中，鉴于在细胞中被表达，多核苷酸可以包括在载体中，更具体地在质粒或病毒中。

在一些实施方式中，基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将核酸引入哺乳动物细胞或目标组织。这种方法可以用于向培养物或宿主有机体的细胞给予编码CRISPR、ZFP、ZFN、TALE、和/或TALEN系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如本文所述的载体的转录物)、裸露的核酸、和与递送媒介(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有游离或整合的基因组。为审阅基因治疗程序，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon.TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada et al.,inCurrent Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds)(1995)；和Yu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)。

核酸的非病毒递送的方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物射弹(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸露的DNA、人工病毒粒子、和DNA的试剂增强摄取。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,35)，并且脂质转染试剂可商业销售(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体识别的脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner，WO91/17424；WO 91/16024中的那些。可以递送至细胞(例如体外或离体给药)或目标组织(例如体内给药)。

在一些实施方式中，递送是通过使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸。在一些方面，病毒载体可以直接被给予患者(体内)，或者其可以用于体外或离体治疗细胞，然后给予患者。在一些实施方式中，基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒载体。

在一些方面，包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白的报道基因可以被引入细胞中，以编码用作标志物的基因产物，通过该标志物测量基因产物的表达的改变或修饰。在进一步的实施方式中，可以通过载体将编码基因产物的DNA分子引入细胞中。在一些实施方式中，基因产物是荧光素酶。在进一步的实施方式中，基因产物的表达降低。

抑制性核酸分子

在一些实施方式中，使用为RNA干扰剂的抑制性核酸分子实现基因阻抑，该抑制性核酸分子可以用于选择性抑制或阻抑基因的表达。例如，可以通过RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、反义和/或核酶来进行基因阻抑。在一些实施方式中，RNA干扰剂还可包括可以被细胞内处理以产生shRNAs的其它RNA物种，包括但不限于与天然存在的miRNA前体或miRNA样RNA的设计前体相同的RNA物种。

在一些实施方式中，RNA干扰剂是具有本领域已知的分子结构特征的至少部分双链RNA，该分子通过RNAi机制或RNA链介导基因表达的抑制，该RNA链包含与另一部分杂交以形成这种结构的至少部分互补的部分。当RNA含有彼此杂交的互补区时，RNA将被称为自杂交。在一些实施方式中，抑制性核酸(如RNA干扰剂)包括与目标基因基本上互补的部分。在一些实施方式中，靶向转录物的RNA干扰剂也可以被认为靶向编码和指导转录物的合成的基因。在一些实施方式中，目标区域可以是与RNA干扰剂的反义链杂交的目标转录物的区域。在一些实施方式中，目标转录物可以是为RNA干扰抑制的目标的任何RNA。

在一些实施方式中，如果(1)RNAi试剂包含与长度为约15-29个核苷酸的区域(例如，长度为至少大约15、大约17、大约18、或大约19个核苷酸的区域)上的转录物至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、或大约100％互补的部分，例如链；和/或(2)在哺乳动物的细胞质或细胞核内通常发现的条件(排除温度)下，由RNAi试剂的一条链的15个核苷酸与转录物的15个核苷酸部分的延伸形成的双链体的Tm比将由RNA干扰剂的相同15个核苷酸及其正确互补序列形成的双链体的Tm低不超过大约15℃、或低不超过大约10℃；和/或(3)与缺乏RNA干扰剂相比，在RNA干扰剂的存在下，转录物的稳定性降低，则RNA干扰剂被视为将“靶向”转录物并靶向编码该转录物的基因。

在一些实施方式中，RNA干扰剂任选地包括一种或多种核苷酸类似物或修饰。本领域普通技术人员将认识到，RNAi试剂可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、修饰的核苷酸或骨架等。在一些实施方式中，可以在转录后修饰RNA干扰剂。在一些实施方式中，RNA干扰剂可以含有一条或多条链，该一条或多条链杂交或自杂交以形成包括长度为约15-29个核苷酸，任选地在双链体内具有一个或多个错配或未配对的核苷酸的双链体部分。

在一些实施方式中，术语“短干扰RNA”(siRNA)指代包括长度在约15-29个核苷酸之间的双链部分并任选地进一步在一条或两条链上包括单链突出端(例如，长度为1-6个核苷酸)的核酸。在一些实施方式中，双链部分的长度可以为17-21个核苷酸，例如，长度为19个核苷酸。在一些实施方式中，突出端存在于每条链的3′末端，可以为约或大约2至4个核苷酸长，并且可以由DNA或核苷酸类似物组成。siRNA可以由杂交在一起的两条RNA链形成，或者可以可选地由较长的双链RNA或由包括自杂交部分的单个RNA链(如短发夹RNA)生成。本领域普通技术人员将理解，在由两条siRNA链形成的双链体中可以存在一个或多个错配或未配对的核苷酸。在一些实施方式中，siRNA的一条链(“反义”或“引导”链)包括与目标核酸(例如，mRNA转录物)杂交的部分。在一些实施方式中，反义链在约15-29个核苷酸、有时在17-21个核苷酸(例如，19个核苷酸)上与目标完全互补，这意味着siRNA与目标转录物杂交，而在此长度上没有单个错配。然而，本领域普通技术人员将理解，可以在siRNA链与目标转录物之间形成的双链体中存在一个或多个错配或未配对的核苷酸。

在一些实施方式中，短发夹RNA(shRNA)是包含至少两个互补部分和至少一个单链部分的核酸分子，该至少两个互补部分杂交或能够杂交以形成足够长以介导RNAi的双链体结构(通常长度为15-29个核苷酸)，该至少一个单链部分通常长度为大约1至10个核苷酸，形成连接形成双链体的两个序列的末端的环。在一些实施方式中，结构可以进一步包含突出端。在一些实施方式中，通过shRNA的自互补部分的杂交形成的双链体可以具有与siRNAs的性质类似的性质，并且在一些情况下，可以通过保守的细胞RNAi机器将shRNAs加工成siRNAs。因此，shRNAs可以是siRNAs的前体，并且可以类似地能够抑制目标转录物的表达。在一些实施方式中，shRNA包括与目标核苷酸(例如，mRNA转录物)杂交的部分，并且可以在约15-29个核苷酸，有时在17-21个核苷酸(例如，19个核苷酸)上与目标完全互补。然而，本领域普通技术人员将理解，可以在shRNA链与目标转录物之间形成的双链体中存在一个或多个错配或未配对的核苷酸。

基因激活

在一些实施方式中，通过修饰内源基因的表达、通过引入基因的外源拷贝、或通过稳定和/或去阻抑基因产物来实现基因的表达、活性和/或功能的增强。在一些方面，与缺乏基因激活的情况下或在缺乏被引入以影响增强作用的组分的情况下的表达和/或活性相比，基因的表达和/或活性增加至少或约20、30、或40％，通常至少或约50、60、70、80、90、或95％。

在一些实施方式中，通过破坏与基因相关的负调节元件或该基因的负转录调节因子(如通过本文所述的靶向破坏的方法中的任一种)来修饰内源基因的表达。在一些实施方式中，通过引入与基因相关联的正调节元件或基因的正转录激活因子来修饰内源性基因的表达。引入基因修饰和表达外源性蛋白质的方法是本领域公知的。

在一些实施方式中，激活是瞬时的或可逆的，使得基因的表达在以后的时间降低至未修饰的水平。在其它实施方式中，激活是不可逆的或瞬时的，例如是永久的。

在一些实施方式中，使用反义技术(如通过RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、和/或用于选择性抑制或阻抑基因的负调节因子的表达的核酶)来实现基因激活。

DNA靶向分子和复合物；目标核酸内切酶

在一些实施方式中，使用与基因相关的调节元件特异性地结合或杂交的DNA靶向分子(如DNA结合蛋白或DNA结合核酸、或含有其的复合物、化合物、或组合物)来实现激活。在一些实施方式中，DNA靶向分子包含DNA结合结构域，例如，锌指蛋白(ZFP)DNA结合结构域、转录激活因子样蛋白质(TAL)或TAL效应子(TALE)DNA结合机构域、聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)DNA结合结构域、或来自mega核酸酶的DNA结合结构域。

在一些实施方式中，DNA靶向分子、复合物或组合含有DNA结合分子和一个或多个另外的结构域，如促进基因激活的效应子结构域。例如，在一些实施方式中，通过包含DNA结合蛋白和异源调节结构域或其功能片段的融合蛋白来进行基因激活。在一些方面，结构域包括例如，转录因子结构域，如激活因子、共激活因子、致癌基因、DNA修复酶及其相关因子和修饰物、DNA重排酶及其相关因子和修饰物、染色质相关蛋白及其修饰物，例如激酶、乙酰化酶和脱乙酰酶、和DNA修饰酶，例如甲基转移酶、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶、及其相关因子和修饰物。

RGENs(CRISPR/Cas系统)

在一些实施方式中，使用一种或多种DNA结合核酸进行激活，如通过RNA引导的核酸内切酶(RGEN)进行的激活、或通过另一种RNA引导的效应分子进行的其它形式的激活。例如，在一些实施方式中，使用CRISPR相关(Cas)蛋白进行激活。参见Perez-Pinera,P.,etal.(2013)Nature methods,10(10):973-976。

点突变(SpCas9中的D10A和H840A)可以使RuvC-和HNH-核酸酶结构域失活，导致不能切割目标DNA的核酸酶死亡Cas9(dCas9)分子。dCas9分子保留了基于gRNA靶向序列与目标DNA结合的能力。dCas9可以用转录激活子标记，并且将这些dCas9融合蛋白靶向启动子区导致下游目标基因的强大的转录激活。最简单的基于dCas9的激活子和阻抑子由直接与单个转录激活子(例如VP64)融合的dCas9组成。另外，已经开发出了更精细的激活策略，其导致哺乳动物细胞中目标基因的较大激活。这些包括：表位标记的dCas9与抗体激活子效应蛋白(例如SunTag系统)的共表达、与一系列若干不同的激活结构域融合的dCas9(例如dCas9-VPR)或具有“修饰支架的”gRNA的dCas9-VP64与另外的RNA结合“辅助激活子”(例如SAM激活子)的共表达。重要地，dCas9介导的基因激活是可逆的，因为其不永久地修饰基因组DNA。

治疗个体中癌症的方法，包括向个体给予识别癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含microRNA(miRNA)的RNA转录物的外源性核酸分子，该microRNA(miRNA)包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

示例性实施方式

实施方式1.治疗个体中癌症的方法，包括向个体给予识别癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含编码包含microRNA(miRNA)的RNA转录物的外源性核酸分子，该microRNA(miRNA)包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中与不包含外源性miRNA的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式2.实施方式1的方法，其中miRNA靶向多个T细胞mRNAs，该多个T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。

实施方式3.实施方式2的方法，其中miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。

实施方式4.实施方式1-3中的任一项的方法，其中RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。

实施方式5.实施方式1-4中任一项的方法，其中RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。

实施方式6.实施方式1-5中任一项的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。

实施方式7.实施方式6的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。

实施方式8.实施方式1-7中任一项的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。

实施方式9.实施方式8的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。

实施方式10.实施方式4的方法，其中相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。

实施方式11.实施方式5的方法，其中相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。

实施方式12.实施方式1-11中任一项的方法，进一步包括将外源性核酸分子引入输入的T细胞群体中，进而生成修饰的T细胞群体。

实施方式13.实施方式12的方法，其中通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。

实施方式14.治疗个体中癌症的方法，包括向个体给予识别个体中癌症相关抗原的修饰的T细胞群体，其中修饰的T细胞包含增加内源性miR-181a的表达的修饰，并且其中与不进行修饰以增加内源性miR-181a的表达的T细胞相比，修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式15.实施方式14的方法，其中修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，其包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，其将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。

实施方式16.实施方式14的方法，其中修饰包括将上调miR-181a的核酸序列***T细胞的基因组中。

实施方式17.实施方式16的方法，其中核酸序列编码miR-181a。

实施方式18.实施方式16的方法，其中核酸序列包含启动子序列，并且被***使得启动子序列与miR-181a基因可操作地连接。

实施方式19.实施方式16-18中任一项的方法，其中通过同源重组***核酸序列。

实施方式20.实施方式19的方法，其中利用CRISPR***核酸序列。

实施方式21.实施方式16或17的方法，其中通过随机整合***核酸序列。

实施方式22.实施方式21的方法，其中通过病毒转导***核酸序列。

实施方式23.实施方式14的方法，其中修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。

实施方式24.实施方式14-23中任一项的方法，进一步包括修饰输入的T细胞群体，进而生成修饰的T细胞群体。

实施方式25.实施方式1-24中任一项的方法，进一步包括给予第二疗法或治疗剂。

实施方式26.实施方式25的方法，其中方法进一步包括在给予修饰的T细胞之前给予调理化学疗法。

实施方式27.实施方式25的方法，其中方法进一步包括给予化学治疗剂。

实施方式28.实施方式25的方法，其中方法进一步包括给予免疫治疗剂。

实施方式29.实施方式28的方法，其中免疫治疗剂选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。

实施方式30.实施方式1-29中任一项的方法，其中修饰的T细胞对个体是自体的。

实施方式31.实施方式30的方法，进一步包括从个体分离T细胞，进而生成自体输入的T细胞。

实施方式32.实施方式31的方法，其中从个体中的实体瘤分离T细胞。

实施方式33.实施方式1-29中任一项的方法，其中修饰的T细胞对个体是同种异体的。

实施方式34.实施方式1-33中任一项的方法，其中给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x105个细胞/千克个体的体重。

实施方式35.实施方式1-33中任一项的方法，其中给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x107个细胞。

实施方式36.实施方式1-33中任一项的方法，其中给予个体的修饰的T细胞的剂量为至少约1x107个细胞/m2个体的体表面积。

实施方式37.实施方式1-36中任一项的方法，其中通过静脉内、腹膜内、或皮下注射将修饰的T细胞给予个体。

实施方式38.实施方式1-37中任一项的方法，其中个体是人。

实施方式39.实施方式1-38中任一项的方法，其中癌症是实体瘤。

实施方式40.实施方式39的方法，其中癌症是胰腺癌、乳腺癌、或黑素瘤。

实施方式41.实施方式1-40中任一项的方法，其中癌症是转移癌。

实施方式42.产生修饰的T细胞群体的方法，包括向识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入编码miRNA的外源性核酸分子，该miRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式43.实施方式42的方法，其中miRNA靶向多个T细胞mRNAs，该多个T细胞mRNAs选自编码酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型(PTPN)11(PTPN11)、PTPN22、双重特异性蛋白磷酸酶(DUSP)5(DUSP5)、和DUSP6的mRNAs。

实施方式44.实施方式43的方法，其中miRNA靶向编码PTPN11、PTPN22、DUSP5、和DUSP6的mRNAs中的每一种。

实施方式45.实施方式42-44中任一项的方法，其中RNA转录物包含相应于前体miRNA(pre-miRNA)的序列。

实施方式46.实施方式42-45中任一项的方法，其中RNA转录物包含相应于初级miRNA(pri-miRNA)的序列。

实施方式47.实施方式42-46中任一项的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列的环区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。

实施方式48.实施方式47的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列的环区。

实施方式49.实施方式42-48中任一项的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的茎区，或其包含多达3个核苷酸取代的变体。

实施方式50.实施方式49的方法，其中RNA转录物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的茎区。

实施方式51.实施方式45的方法，其中相应于pre-miRNA的序列具有SEQ ID NO:6或7的核苷酸序列。

实施方式52.实施方式46的方法，其中相应于pri-miRNA的序列具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。

实施方式53.实施方式42-52中任一项的方法，其中通过病毒转导、转座、电穿孔、或化学转染引入外源性核酸分子。

实施方式54.产生修饰的T细胞群体的方法，包括向识别癌症相关抗原的输入的T细胞群体中引入增加内源性miR-181a的表达的修饰，其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的TCR信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式55.实施方式54的方法，其中修饰包括引入编码下列的核酸分子：a)融合蛋白，其包含与RNA聚合酶II的激活子融合的核酸酶缺陷序列引导的核酸内切酶(SGEN)；和b)引导核苷酸，其将融合蛋白导向至miR-181a基因的启动子区。

实施方式56.实施方式54的方法，其中修饰包括将上调miR-181a的核酸序列***T细胞的基因组中。

实施方式57.实施方式56的方法，其中核酸序列编码miR-181a。

实施方式58.实施方式56的方法，其中核酸序列包含启动子序列，并且被***使得启动子序列与miR-181a基因可操作地连接。

实施方式59.实施方式56-58中任一项的方法，其中通过同源重组***核酸序列。

实施方式60.实施方式59的方法，其中利用CRISPR***核酸序列。

实施方式61.实施方式56或57的方法，其中通过随机整合***核酸序列。

实施方式62.实施方式61的方法，其中通过病毒转导***核酸序列。

实施方式63.实施方式54的方法，其中修饰包括对miR-181a基因的修饰，其导致miR-181a基因的mRNA转录物的稳定性增加。

实施方式64.实施方式42-63中任一项的方法，其中从个体中的实体瘤分离输入的T细胞。

实施方式65.实施方式64的方法，进一步包括从实体瘤分离T细胞，进而生成输入的T细胞群体。

实施方式66.通过实施方式42-65中任一项的方法制备的修饰的T细胞群体。

实施方式67.组合物，其包含实施方式66的修饰的T细胞群体。

实施方式68.药物组合物，其包含实施方式66的修饰的T细胞群体和药学上可接受的载剂。

实施方式69.识别个体中两种或更多种癌症相关抗原的修饰的T细胞的多克隆群体，其中修饰的T细胞包含编码microRNA(miRNA)的外源性核酸分子，该microRNA包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的种子序列，并且其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式70.识别个体中两种或更多种癌症相关抗原的修饰的T细胞的多克隆群体，其中修饰的T细胞包含增加内源性miR-181a的表达的修饰，并且其中修饰的T细胞对癌症相关抗原具有更低的T细胞受体(TCR)信号传导阈值和/或增加的TCR敏感性。

实施方式71.药物组合物，其包含实施方式69或70的修饰的T细胞的多克隆群体和药学上可接受的载剂。

实施方式72.实施方式69或70的修饰的T细胞的多克隆群体的商业批次。

实施方式73.针，其填充有实施方式69或70的修饰的T细胞的多克隆群体。

实施例

包括以下实施例仅用于示例性目的而不旨在限制本发明的范围。

实施例1 A.miR-181介导的TIL对胰腺癌细胞的细胞毒性的潜力

为了表征肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中miR-181表达对其针对胰腺癌细胞的细胞毒性的影响，TILs从携带正位植入的KPC肿瘤细胞的小鼠中收获，并模拟转导(对照TILs)或用病毒转导，以用于过表达miR-181(miR-181TILs)。KPC肿瘤细胞源自胰腺导管腺癌(PDA)的基因工程小鼠模型(KrasLSL.G12D/+；p53R172H/+；PdxCretg/+)。

体外表征

将对照TILs和miR-181TILs与KPC细胞(使用荧光素酶报道分子)以1:0和1:1.5的目标与效应子比培育。培育16hr后，通过测量培养基中荧光素酶活性来确定具体的裂解。如图1所示，被转导以过表达miR-181的TILs显示出比对照TILs更强的肿瘤细胞杀伤(重复三次(in triplicate)；t-检验，p<0.01)。

体内表征

在携带正位KPC肿瘤的小鼠中评价对照TILs和miR-181TILs的体内抗肿瘤活性。在肿瘤植入后一周，将小鼠随机分为两组，接受：(i)对照TILs+IL-2或(ii)miR-181TILs+IL-2。随机分配后，立即通过每只小鼠每周一次静脉内(i.v.)注射1x10⁶对照或miR-181TILs，以三次剂量处理动物。密切监测小鼠的总体健康状况、可能的不良反应(如果有)、和肿瘤体积的变化。对照和miR-181TILs在当前剂量和时间表下耐受良好。小鼠在肿瘤植入后第21天注射有IRdye 800CW-2-脱氧葡萄糖(1μg/小鼠)，并在2-DG染料注射后48小时使用LicorPearl Trilogy小动物成像系统成像，并将信号强度量化为KPC肿瘤生长的指示(图2A和2B)。注射miR-181TILs的小鼠显示出比注射对照TILs的小鼠更少的肿瘤生长。模拟化学疗法调理组和化学疗法调理组的存活曲线显示于图3中。用miR-181TILs治疗比未用化学疗法调理的对照TILs更大程度地延长了携带胰腺肿瘤的小鼠的存活期。

在另一项研究中，在携带正位KPC肿瘤的小鼠中评价了联合化学疗法调理和TIL治疗的抗肿瘤活性。在肿瘤植入后一周，将动物随机分为四组，接受：(i)无治疗，(ii)化学疗法+IL-2，(iii)化学疗法+对照TILs+IL-2，或(iv)化学疗法+miR-181TILs+IL-2。每只小鼠每两周一次静脉内注射1x10⁶对照或miR-181TILs，共三剂。治疗组的存活曲线显示在图4中。miR-181TILs比用化学疗法调理的对照TILs更大程度地延长了携带胰腺肿瘤的小鼠的存活期，并且化学疗法调理进一步增强miR-181TILs的抗肿瘤活性。

实施例1 B.miR-181介导的TIL对黑素瘤癌细胞的细胞毒性的潜力

为了表征miR-181表达对肿瘤抗原特异性T细胞的CTL活性的影响，从Pmel转基因小鼠的脾中收集Pmel T细胞。这种转基因菌株携带对人前黑素体蛋白(称为PMEL、SILV或gp100)的小鼠同源物(pmel^Si或pmel-17)和T淋巴细胞特异性Thy1^a(Thy1.1)等位基因具有特异性的重排T细胞受体转基因。我们检查了对照或miR-181转导的Pmel T细胞针对B16F0黑素瘤肿瘤细胞的CTL活性。

体外表征

将对照Pmel T细胞和miR-181 Pmel T细胞与B16F0细胞(使用荧光素酶报道因子)以1:0、1:2、和1:4的目标与效应子比培育。培养后16hr，通过测量培养基中的荧光素酶活性来测量具体的裂解。如图5所示，在目标与效应子的比为1:2(重复三次；t-检验，p<0.001)和1:4(重复三次；t-检验，p<0.05)时，被转导以过表达miR-181的TILs显示出比对照TILs更大的肿瘤细胞杀伤。

体内表征

在携带B16F0黑素瘤肿瘤的小鼠中评价对照Pmel T细胞和miR-181Pmel T细胞的体内抗肿瘤活性。在肿瘤植入后第8天，将动物随机分为四组，接受：(i)无治疗，(ii)化学疗法调理，(iii)化学疗法调理+对照TILs，或(iv)化学疗法调理+miR-181TILs。小鼠未接受IL-2注射。化学疗法调理后一天处理动物，并且每只小鼠每周一次静脉内(i.v.)注射或模拟注射1x10⁶对照或miR-181TILs，共三剂。密切监测小鼠的总体健康状况、可能的不良反应(如果有)、和肿瘤体积的变化。对照和miR-181TILs在当前剂量和时间表下耐受良好。如图6所示，注射有miR-181TILs的小鼠显示出比任何其它组(包括用对照TIL的组(iii))更少的肿瘤生长。组(ii)、(iii)、和(iv)的存活曲线显示于图7中。注射miR-181TILs的小鼠显示出比任何其它组(包括用对照TIL注射的组(iii))更高的存活率(n>10；t-检验，p<0.006)。

实施例1 C.miR-181介导的TIL对胰腺癌细胞的细胞毒性的潜力

为了表征肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)中miR-181表达对其针对乳腺癌细胞的细胞毒性的作用，TILs从携带正位4T1乳腺肿瘤细胞的小鼠中收获，并模拟转导(对照TILs)或用病毒转导，以用于过表达miR-181(miR-181TILs)。

体外表征

将对照TILs和miR-181TILs与4T1细胞(使用荧光素酶报道分子)以1:0、1:2、和1:4的目标与效应子比培育。培育16hr后，通过测量培养基中的荧光素酶活性来测量具体的裂解。如图8所示，在目标与效应子的比为1:2(重复三次；t-检验，p<0.001)和1:4时，转导以过表达miR-181的TILs显示出比对照TILs更大的肿瘤细胞杀伤(重复三次；t-检验，p<0.01)。

体内表征

在携带正位4T1肿瘤的小鼠中评价用对照TILs和miR-181TILs对肿瘤转移的体内对照。在肿瘤植入后第8天，将小鼠随机分为三组，接受：(i)无治疗，(ii)对照TILs，或(iii)miR-181TILs。没有利用IL-2和化学疗法调理。随机分配后，立即通过每只小鼠静脉内注射或模拟注射1x10⁶对照或miR-181TILs处理动物一次。密切监测小鼠的总体健康状况、可能的不良反应(如果有)、以及肿瘤体积的变化。对照和miR-181TILs在当前剂量和时间表下耐受良好。组(i)、(ii)、和(iii)的存活曲线显示于图9中。注射miR-181TILs的小鼠显示出比任何其它组更高的存活率。

实施例2.过表达miR-181的TILs的表征

为了进一步表征肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)中miR-181表达的作用，评价了T细胞激活的两种调节因子PD-1和CD28的表面表达水平。用加载有无效抗原或gp100肽的抗原呈递细胞激活用对照病毒(409)或miR-181病毒转导的Pmel T细胞。通过流式细胞术分析细胞的PD-1表达(图10)或CD28表达(图11)。如图10所示，无论抗原激活如何，过表达miR-181的Pmel T细胞比对照Pmel T细胞的PD-1表达少得多。如图11所示，在用GP100肽抗原激活的miR-181Pmel T细胞而不是其它对照Pmel T细胞中观察到CD28表达的更大增加。综上所述，这些结果表明过表达miR-181的TILs可以比表达典型水平的miR-181的TILs更具响应性，更不易受到免疫检查点抑制的抑制，并且因此对于过继细胞疗法可能更有效。

本发明不旨在限于特定公开的实施方式的范围，提供特定的实施方式以例如示例本发明的各个方面。根据本文的描述和教导，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。这种变型可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践，并旨在落入本公开的范围内。

序列

序列表

<110> 阿彻罗伊斯肿瘤公司

<120> T细胞信号传导的miRNA调节及其应用

<130> 75659-20001.40

<140> 还未指定

<141> 与此同时

<150> US 62/614,924

<151> 2018-01-08

<160> 9

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 7

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

acauuca 7

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

aacauucaac gcugucggug agu 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

accatcgacc gttgattgta 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

ttggaattca aataaaa 17

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

ttgggatttg aaaaa 15

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

aacattcaac gctgtcggtg agtttggaat tcaaataaaa accatcgacc gttgattgta 60

<210> 7

<211> 110

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

agaagggcta tcaggccagc cttcagagga ctccaaggaa cattcaacgc tgtcggtgag 60

tttgggattt gaaaaaacca ctgaccgttg actgtacctt ggggtcctta 110

<210> 8

<211> 388

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

ctcgagtgtg acaggtttgg ttaaaggatt gggctttcct ctgcctccct cctgctccag 60

actcccacag atactgttta aatcagcaca tctctgcctc acaggttgct tcagtgaaca 120

ttcaacgctg tcggtgagtt tggaattcaa ataaaaacca tcgaccgttg attgtaccct 180

atagctaacc atcatctact ccatggccct ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc 240

aggacccgac aggattcttt tttaattaag aattcctagg aattcttgcc aaacctacag 300

gtggggtctt tcattccccc ctttttctgg agactaaata aaatctttta ttttatcgat 360

aagcttggct gcaggtcgac gcggccgc 388

<210> 9

<211> 310

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

tttaaatact ctcgacttga aacccagaga ggaatgtaag agcatccatc agcggtggtc 60

tcactgctca ctggttcttg ggatgtggat gggagaatga agaagggcta tcaggccagc 120

cttcagagga ctccaaggaa cattcaacgc tgtcggtgag tttgggattt gaaaaaacca 180

ctgaccgttg actgtacctt ggggtcctta cagacgacac tacatttcct gaagcaaaag 240

agcaagctgt accttcacat gtcacatgag ttcaccagaa atggtcctgc aatcccccaa 300

atgtggtcca 310