检测和促进心磷脂重塑和心肌细胞成熟的方法和组合物以及治疗线粒体功能障碍的相关方法
阅读说明：本技术 检测和促进心磷脂重塑和心肌细胞成熟的方法和组合物以及治疗线粒体功能障碍的相关方法 (Methods and compositions for detecting and promoting cardiolipin remodeling and cardiomyocyte maturation and related methods for treating mitochondrial dysfunction ) 是由 J·W·米克拉斯 H·劳霍拉-贝克 Y·王 于 2018-12-07 设计创作，主要内容包括：本公开的实施方案涉及用于诱导心肌细胞成熟的方法和组合物。在一些实施方案中,心肌细胞体外衍生自干细胞。在一些实施方案中,该组合物和方法通过在心肌细胞中诱导Let7i microRNA(miRNA)的过表达、miR-452的过表达、miR-122的降低表达和/或miR-200a的降低表达来诱导成熟。在其他实施方案中,本公开涉及用于治疗诸如脂肪酸氧化紊乱等以线粒体功能障碍为特征的病症的方法。在其他实施方案中,本公开涉及筛选影响心脏肌肉功能的化合物的方法。在其他实施方案中,本公开涉及通过检测或监测细胞的心磷脂概况来检测或监测细胞中的线粒体功能障碍的方法。(Embodiments of the present disclosure relate to methods and compositions for inducing cardiomyocyte maturation. In some embodiments, the cardiomyocytes are derived in vitro from stem cells. In some embodiments, the compositions and methods induce maturation by inducing overexpression of Let7i microrna (mirna), overexpression of miR-452, decreased expression of miR-122, and/or decreased expression of miR-200a in cardiomyocytes. In other embodiments, the disclosure relates to methods for treating conditions characterized by mitochondrial dysfunction, such as fatty acid oxidation disorders. In other embodiments, the disclosure relates to methods of screening for compounds that affect cardiac muscle function. In other embodiments, the disclosure relates to methods of detecting or monitoring mitochondrial dysfunction in a cell by detecting or monitoring a cardiolipin profile of the cell.)
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2017年12月8日提交的美国临时申请62/596,438和2018年5月22日提交的美国临时申请62/674,978的权益，据此通过援引将其全部内容收入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过援引收录入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为67910_Sequence_Listing_Final_2018-12-07.txt。文本文件为11KB；创建于2018年12月7日；并通过EFS-Web在提交说明书的同时提交。
政府特许权声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金P01 GM081619和R01 GM083867和R01GM097372和R01 HL135143和U01 HL099993和U01 HL099997的政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
背景
线粒体三功能蛋白(Mitochondrial trifunctional protein，MTP/TFP)缺乏被认为是由于羟酰基-CoA脱氢酶/3酮酰基-CoA硫解酶/烯酰-CoA水合酶亚基A(HADHA/LCHAD)或亚基B(HADHB)突变所致脂肪酸氧化(FAO)受损的结果。MTP缺陷型新生儿的主要表型是婴儿猝死综合症(SIDS)，其在婴儿出生后在孩子开始使用富含脂质的母乳喂养时出现。FAO的缺陷在促进心律失常前的心脏环境中起作用，但是，确切的作用机制尚不清楚，目前尚无治疗方法。
多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CM)提供了一种在体外研究人类疾病的方法，但由于它们的不成熟性而受到限制，因为它们代表了胎儿心肌细胞(FCM)而不是成人心肌细胞(ACM)。由于缺乏有关如何将成熟的心肌细胞从未成熟的FCM转变为成熟的ACM的知识，许多出生后发作的心脏病没有很好的表征。在心脏发生期间，FCM经历发育状态，一旦超过了心肌细胞的表现，就会展现出：细胞周期退出，自发搏动停止，乳酸利用，然后在出生后阶段利用脂肪酸作为主要能源和心磷脂成熟。由于未成熟的hPSC-CM无法通过FAO利用脂肪酸作为能源，因此它们在模拟FAO疾病中的使用受到限制。
使hPSC-CMs趋向ACM成熟的当前方法聚焦于用电刺激或机械刺激在物理上刺激细胞或通过2D表面图案提示直接指导细胞定向的延长培养过程。
尽管在心脏发生和线粒体三功能蛋白(MTP/TFP)的研究方面取得了进展，但仍需要开发成人心肌细胞以促进用于研究出生后发生的心脏病的模型。本公开解决了这个和相关需求。
概述
提供本概述以简化形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详述中进一步描述。该概述不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
一方面，本公开提供了一种诱导心肌细胞成熟的方法。该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下两种或更多种：Let7i microRNA(miRNA)的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。在一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导Let7i miRNA的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。
在另一方面，本公开提供了通过本文描述的任何方法产生的心肌细胞。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的方法，该受试者具有通过施用具有成熟心磷脂概况的心肌细胞可治疗的病症。该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的心肌细胞。
在另一方面，本公开提供了筛选用于调节心脏功能的化合物的方法。该方法包括使一种或多种如本文所述的心肌细胞与候选药剂接触；并测量该一个或多个心肌细胞中的心脏功能参数；其中心脏功能参数的变化指示候选药剂调节心脏功能。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者中线粒体脂肪酸氧化(FAO)失调的方法。该方法包括施用有效量的稳定受试者的线粒体中的心磷脂概况或促进成熟的心磷脂重构的组合物。
在另一方面，本公开提供了一种检测培养的心肌细胞的病理状态的方法。该方法包括确定心肌细胞中的心磷脂概况，其中具有大于18个碳的酰基链的心磷脂的相对增加以及具有小于18个碳的酰基链的心磷脂的相对减少指示心肌细胞的病理状态降低。
在另一方面，本公开内容提供了诱导培养的心肌细胞成熟的组合物或组合物的试剂盒。该组合物或试剂盒包含以下两种或多种：编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体。
具体实施方式
当结合附图时，通过参考以下详述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易领会也更好理解，其中：
图1A-1F说明了HADHA突变体(Mut)和敲除(KO)干细胞来源的心肌细胞的产生。图1A)是详述四个酶促步骤的脂肪酸β-氧化的示意图。图1B)是来自WTC iPSC系的显示导致早期终止密码子的22bp缺失的HADHA KO DNA和蛋白质序列示意图。示意的HADHAWT DNA片段序列如SEQ ID NO：1所示，相应的HADHAWT蛋白质片段序列如SEQ ID NO：2所示。示意的HADHAKODNA片段序列如SEQ ID NO：3所示，相应的HADHAKO蛋白质片段序列如SEQ ID NO：4所示。指示了外显子，内含子和In/Del域。图1C)来自WTC iPSC系的显示在第一个等位基因上有2bp的缺失和9bp的***且在第二个等位基因上有2bp的缺失的HADHA Mut DNA和蛋白质序列的示意图。示意的HADHAWT DNA片段序列如SEQ ID NO：5所示。示意的HADHAMutDNA片段序列如SEQID NO：7和9所示。RNA测序读取计数显示HADHAMut表达外显子4-20，导致截短的蛋白质。图1D)对WTC iPSC中HADHA表达和持家蛋白β-肌动蛋白的Western分析(蛋白质印迹分析)。图1E)针对心脏标记物α辅肌动蛋白(左)和HADHA(右)的WT、HADHA Mut和HADHA KO hiPSC-CM的共聚焦显微镜检查。图1F)WT、HADHA Mut和HADHA KO hiPSC-CM的脂肪酸氧化能力的海马分析追踪。
图2A-2F图示了心肌细胞成熟microRNA筛选的方面。图2A)为确定候选microRNA以筛选心肌细胞成熟而进行的工作流程示意图。图2B)为产生经microRNA转导的干细胞衍生的心肌细胞而进行的工作流程的示意图。图2C)经microRNA处理的hiPSC-CM的细胞面积分析。MicroRNA-208b OE导致细胞面积显著增加，而miR-205KO导致显著减少。对细胞进行α辅肌动蛋白、鬼笔环肽染色和用DAPI染色，并用共聚焦显微镜成像。图2D)经microRNA处理的hiPSC-CM的微电极阵列分析校正了场电势持续时间(cFPD)。MiR-452OE导致更长的cFPD。图2E)使用微柱测定法(micro-post assay)的单细胞颤搐力(twitch force)分析。MiR-200aKO导致hiPSC-CM的颤搐力显著增加。图2F)因经micro RNA处理的hiPSC-CM的寡聚霉素处理后的FCCP引起的耗氧率(OCR)最大变化的海马分析。MiR-122KO导致最大OCR显著增加，而miR-208b OE、-378e OE和-200a KO导致最大OCR显著下降。
图3A-3O图示MiMaC加速了hiPSC-CM的成熟。图3A)四种miroRNA组合产生miMaC的示意图。图3B)微柱上的单细胞收缩力测定显示用MiMaC处理的hiPSC-CM导致颤搐力显著增加。图3C)EV(对照)和经MiMaC处理的hiPSC-CM的代表性追踪。图3D)微柱上的单细胞颤搐力分析显示用MiMaC处理的hiPSC-CMs导致功率显著增加。图3E)细胞大小分析显示经MiMaC处理的hiPSC-CM导致面积显著增加。图3F)EV和MiMaC处理的hiPSC-CM的代表性共聚焦显微镜图像。显示了α辅肌动蛋白(绿色)，鬼笔环肽(红色)和DAPI。图3G)脂肪酸氧化能力的海马分析显示经MiMaC处理的hiPSC-CM成熟到可以氧化棕榈酸盐/酯以生成ATP的程度，而对照细胞无法利用棕榈酸酯。由于添加了棕榈酸盐/酯，MiMaChiPSC-CMs的OCR显著增加。图3H)KOmicroRNA预测靶标的Venn图，以及将HOPX鉴定为针对心肌细胞成熟筛选的所有KO miR之间的共同预测靶标。图3I)心肌细胞成熟期间来自RNA序列数据的HOPX表达图。与D30 hESC-CM相比，D30和1年期hESC-CM中的HOPX表达显著较高，而1年期hESC-CM具有统计学显著更高的HOPX。*表示相对于D20的显著性。#表示相对于D30的关系。图3J)成年人心室组织中的HOPX表达显著高于人类胎儿心室组织。使用RNA测序数据绘图。图3K)HOPX的HOPX表达的RT-qPCR显示，与EV对照D30hiPSC-CM相比，在D30经MiMaC处理的hiPSC-CM具有统计学上显著更高的HOPX水平。图3L)经microRNA处理的hPSC-CM的无偏聚簇的单细胞RNA-Seq tSNE图。图3M)详细说明每个聚簇中富集了哪些治疗组的聚簇图。图3N)基于MiMaC聚簇的成熟类别的热图。图3O)随着成熟而上调的体内人类成熟标记物的热图(黄色)。
图4A-4L描述经脂肪酸攻击的HADHA Mut CM展示出升高的胞质钙水平，导致搏动率不规则性增加。图4A)分析添加寡霉素和FCCP后的最大耗氧率的海马线粒体压力(mitostress)测定法。与对照EV CM相比，经MiMaC处理的CM显示出最大OCR显著增加。图4B)线粒体压力测定的代表性追踪。图4C)脂肪酸氧化能力的海马分析显示，经MiMaC处理的hiPSC-CM成熟到可以氧化棕榈酸盐/酯以生成ATP的程度，而对照细胞无法利用棕榈酸盐/酯。由于添加了棕榈酸盐/酯，MiMaChiPSC-CMs的OCR显著增加。MiMaC处理的Mut和KOhiPSC-CM二者均不能氧化棕榈酸盐/酯。图4D)钙瞬态分析期间荧光变化的代表性追踪。图4E)钙瞬变期间荧光最大变化的定量。在Glc+FA培养基处理12天后，与WT CM相比，Mut CM的钙变化在统计学上显著较低。图4F)tau-衰变常数的定量。在Glc+FA培养基处理12天后，与WT CM相比，Mut CM具有更高的tau衰变常数。图4G)在Fluovolt，动作电位，分析过程中荧光变化的代表性追踪。图4H)定量分析动作电位期间荧光的最大变化。图4I)经过12天的Glc+FA培养基处理后，与WT CM相比，Mut CM的波持续时间50％明显更长。图4J)在Glc或Glc+FA培养基中Mut CM的代表性搏动速率追踪。图4K)搏动间隔变化(ΔBI)的量化。与Glc培养基中的Mut CM相比，Glc+FA培养基中的Mut CM具有统计上显著更高的ΔBI。图4L)Poincare图显示了每组具有95％置信区间的椭圆。Mut Glc+FA条件下更圆的椭圆形显示与Mut Glc CM相比，这些细胞的搏动间不稳定性更大。
图5A-5J描述了scRNA-Seq揭示了经脂肪酸攻击的HADHA Mut CM的多种疾病状态。图5A)与HADHA Mut CM相比WT的单细胞RNA测序tSNE图显示了这两组之间的明显区别。D30CM的四个条件：FA处理MiMaC WT CM为6天，FA和SS-31MiMaC WT CM为6天，FA处理MiMaCHADHA Mut CM为6天，FA和SS-31处理MiMaC HADHA Mut CM为6天。图5B)无偏聚簇分析揭示了6个独特的组。图5C)详细说明每个聚簇中条件的富集的热图。图5D)基于MiMaC聚簇的成熟类别的热图。图5E)随着成熟而上调的体内小鼠成熟标志物的热图。图5F)共聚焦显微镜显示HADHA Mut CM比WT CM具有更多的核。蓝色-DAPI，绿色-ATP合酶β亚基，粉红色-肌联蛋白(Titin)。插图为以灰度显示的核。图5G)具有1、2、3或4个或更多个核的细胞频率的直方图。HADHA突变体CM拥有大量具有3个或更多个核的细胞。图5H)与聚簇3(WT CM)相比聚簇0(非复制型HADHA CM)中下调的代谢途径。图5I)与聚簇3(WT CM)相比，聚簇2(内复制型HADHA CM)中下调的代谢途径。图5J)与聚簇3(WT CM)相比聚簇2(内复制型HADHA CM)中上调的代谢途径。代谢气泡图的圆大小与统计显著性成正比。p值越小，圆圈越大。调整后的p值0.01用作临界值。
图6A-6H描述了用脂肪酸攻击的HADHA Mut CMs展示具有严重的线粒体功能障碍的肿胀线粒体。图6A)在Glc+FA培养基12天中WT和Mut CM的代表性共聚焦图像。图6B)定量线粒体追踪剂和ATP合酶β的共定位和强度。图6C)在Glc+FA培养基12天后WT和Mut CM的透射电子显微镜图像，显示了肌节和线粒体结构。图6D)在Glc+FA培养基12天后，WT和HADHAMut CM的线粒体圆度指数直方图显示，HADHA Mut CM的线粒体更圆。图6E)Glc+FA培养基12天后，WT和HADHA Mut CM的线粒体面积直方图显示，HADHA Mut CM的线粒体较小。图6F)来自线粒体压力测定法(mitostress assay)的最大OCR的定量。在12天的Glc+FA培养基后，与WT CM相比，Mut和KO CM具有显著较低的max OCR。图6G)来自线粒体压力测定法的ATP产生的定量，计算为基线OCR和寡霉素后OCR之间的差异。在12天的Glc+FA培养基后，与WT CM相比，Mut和KO CM具有显著更低的ATP产生。图6H)来自线粒体压力测定法的质子泄漏的定量，计算为寡霉素后的OCR与抗霉素和鱼藤酮后的OCR之间的差异。在12天的Glc+FA培养基后，与WT CM相比，Mut和KO CM具有明显更高的质子泄漏。在12天的Glc+FA后，经SS-31处理的Mut CM具有较未经处理的Mut CM而言显著降低的质子泄漏。
图7A-7K图示了经脂肪酸攻击的HADHA KO和Mut CM具有升高的脂肪酸和异常的心磷脂概况。图7A)由于HADHA丢失，在长链FAO第一步之后的长链FA中间体积累的模型。图7B)WT，Mut和KO FA处理的hPSC-CM中所有长链酰基肉碱的总和。图7C)在WT，Mut和KO FA处理的hPSC-CM中处于游离脂肪酸状态的抹香鲸酸的量。图7D)在WT，Mut和KO FA处理的hPSC-CM中处于游离脂肪酸状态的棕榈油酸的量。图7E)在WT，Mut和KO FA处理的hPSC-CM中处于游离脂肪酸状态的油酸的量。图7F)在用Glc或Glc+FA处理的WT和HADHA KO CM中tetra[18：2]-CL的相对量。图7G)从针对Glc或Glc+FA处理的WT和HADHA KO CM的靶向脂质组学产生的心磷脂概况。图7H)从整体脂质组学产生的WT CM12D Glc+FA，HADHA Muts CM 6D和12D Glc+FA和HADHA KO CM 12D Glc+FA的心磷脂概况。图7I)在WT，HADHA Mut和HADHA KO CM FA处理的hPSC-CM中，在其侧链上具有肉豆蔻酸(14：0)的所有CL的总和。图7J)在WT，HADHA Mut和HADHA KO CM FA处理的hPSC-CM中，在其侧链上具有棕榈酸(16：0)的所有CL的总和。图7K)HADHA如何与TAZ一起工作以重塑CL的示意图。
图8以图形方式描述了CM中心磷脂的成熟。与未成熟的iPSC衍生的CM相比，WTiPSC衍生的CM通过降低具有[14：0]，[14：1][16：1]或[16：0]的CL和增加具有大于18个碳的酰基链的CL(包括中间物[18：1][18：2][18：2][20：2]在成熟期间改变它们的CL概况。
详述
本公开基于发明人对线粒体三功能蛋白质缺乏的分析。如以下更详细描述的，发明人通过从HADHA缺陷的人诱导的多能干细胞(hiPSC)产生新的干细胞衍生的心肌细胞来解决当前细胞模型中的主要缺陷。发明人开发了使用工程化的microRNA成熟混合物来加速心肌细胞成熟的方法，该混合物能够上调表观遗传调节子同源盒蛋白(homeobox protein，HOPX)。脂肪酸(FA)攻击的HADHA突变型心肌细胞显示出异常的钙调控，延迟的复极化和不规则的跳动，提示前心律失常状态。这些病理性心脏表现是潜在线粒体病理学的结果，线粒体病理学表现为由于质子梯度损失和线粒体缺乏正常线粒体嵴(cristae)而引起的线粒体功能障碍。这种病理性线粒体状态的潜在机制被认为是由于HADHA基因敲除导致的心磷脂体内稳态失调和tetra[18：2]心磷脂种类减少的后果。这些数据揭示了HADHA在脂肪酸β-氧化中以及在心脏内稳态的心磷脂重塑中作为酰基转移酶的基本双重作用。
这些研究为治疗、实验建模或药物筛选应用提供了促进心肌细胞成熟的新方法。另外，CL建模的基本观察结果提供了检测和监视CL重构状态以推断细胞健康或成熟的方法。
根据前述内容，一方面，本公开提供了一种诱导心肌细胞成熟的方法。该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下的两种、三种或全部：Let7 microRNA(miRNA)的过表达，miR-208b的过表达，miR-452的过表达，miR-1222的降低表达以及miR-200a的降低表达。诱导调节的miRNA表达的药剂在本文中一起称为microRNA成熟混合物(MiMaC)。
在一些实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导至少Let7 miRNA的过表达和miR-452的过表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导Let7 miRNA的过表达和miR-122的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导Let7 miRNA的过表达和miR-200a的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导miR-452的过表达和miR-122的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导miR-452的过表达和miR-200a的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。
在一些实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导Let7 miRNA的过表达，miR-452的过表达和miR-122的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导Let7 miRNA的过表达，miR-452的过表达和miR-200a的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导Let7 miRNA的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。在另一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中至少诱导miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。
，，，()Let7，miR-452，miR-208b，miR-122和miR-200a均是心肌细胞(CM)中的在本文中显示对SM的成熟各方面有影响的microRNA(见下文的实验讨论)。如所述，这些miRNA的操纵显示影响导致CM中更高级的成熟和心磷脂重塑的信号传导途径。当在培养的(例如，干细胞衍生的)CM中实施时，这些miRNA操作导致与成人心肌细胞(ACM)更加相似的CM。
Let7是一个miRNA家族，在Kuppusamy，K.T.等人，Let-7family of microRNA isrequired for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derivedcardiomyocytes.Proc Natl Acad Sci U S A,2015,和US 9,624,471中有更详细的描述，通过援引将其全部内容收录入本文。Let-7miRNA可以选自Let7a-1，Let7a-2，Let7b，Let7c，Let7e，Let7f-1，Let7f-2，Let7g和Let7i。在一些实施方案中，Let7 miRNA是Let7i。编码Let7imiRNA的代表性DNA序列包括在SEQ ID NO：11所示的序列内，该序列是从人基因组模板产生的扩增子的序列，其被***表达载体中以促进Let7i miRNA的表达。可以通过任何常规方法获得编码所示Let7 miRNA的核酸分子。在一些实施方案中，可以通过使用特异性引物从编码基因组扩增序列来获得核酸。例如，如下面更详细地描述的，该扩增过程用于扩增和获得Let7i的编码序列(加上上游和下游的附加序列)，使得其可以掺入表达载体中用于在细胞中过表达。用于扩增包括Let7i的这种区域的示例性正向和反向引物分别在SEQ IDNO：12和13中给出。
编码miR-452的代表性序列包括在SEQ ID NO：14所示的序列中，该序列是从人基因组模板产生的扩增子的序列，该扩增子被***表达载体中以促进mi-452miRNA的表达。用于扩增包括人miR-452的区域的示例性正向和反向引物分别在SEQ ID NO：41和42中列出。
miR-208b描述于例如Callis，T.E.等人，Callis,T.E.,et al.,MicroRNA-208a isa regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice.J Clin Invest,2009.119(9):p.2772-86，通过援引完整收录入本文。用于扩增包括人miR-452的区域的示例性正向和反向引物分别在SEQ ID NO：39和40中列出。
编码miR-122的代表性序列包括在SEQ ID NO：46所示的序列内。编码miR-200a的代表性序列包括在SEQ ID NO：45所示的序列内。这些序列中的每一个代表人类基因组序列的扩增子，除了上下游的另外序列之外，还包括所指示的miRNA编码区。整个扩增子的序列可以用于转基因表达整个miRNA。本领域普通技术人员可以容易地使用该序列产生与编码序列杂交的引导RNA，或产生与miRNA的一部分杂交的单链核酸片段，以减少靶标miRNA的功能性表达(下文进行了更详细的讨论)。
关于Let7i，miR-452和miR-208b，术语“诱导过度表达”及其语法变体涵盖细胞内任何额外水平的miRNA。在一些实施方案中，靶miRNA的表达水平增加至少约1％、5％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。可以通过从其编码区增强细胞自身的内源表达活性，或通过为细胞提供附加外源编码区用于额外的转录活性来诱导过表达。在一些实施方案中，“诱导过度表达”需要简单地向细胞提供额外拷贝的miRNA本身。
在一些实施方案中，miRNA(例如，Let7i，miR-452和miR-208b中的一个或多个)过表达的诱导可包括使未成熟的CM与包含编码待过表达的miRNA的核酸的载体接触的步骤。所述载体可以被配置为促进miRNA在细胞中的瞬时或组成性表达。在这方面，核酸可操作地连接至启动子序列，该启动子序列可驱动细胞内miRNA编码区的转录。启动子区域可以由本领域普通技术人员选择以适应所期望的表达类型。
在一些实施方案中，将载体配置为促进编码待过表达的miRNA的核酸的整合(例如，在相同或分开的载体中的Let7i，miR-452和miR-208b中的一个或多个)。例如，载体可以是包含编码待过表达的miRNA的核酸的病毒载体。本文考虑用于编码核酸的此类基因组整合的任何合适的病毒载体。为此目的的非限制性的示例性病毒载体是慢病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。慢病毒实施方案的使用在下面更详细地描述以用于说明。
关于miR-122和miR-200a，术语“降低的表达”涵盖细胞内功能性miRNA的表达水平的任何降低。在一些实施方案中，靶miRNA表达水平的降低涵盖“海绵”方法，其中与所述miRNA(即，miR-122或miR-200a)的至少一部分杂交的单链核酸干扰了miRNA影响其基因组靶标转录的能力。如上所指示的，编码miR-122和mi-200a的序列分别包括在SEQ ID NO：46和35所示的扩增子序列内。在这种意义上，添加的核酸从未成熟的心肌细胞中“吸收”靶标miRNA，并将其从细胞内转录调节剂的环境中去除。在一些实施方案中，杂交导致miRNA的降解，例如在RNA干扰中。单链核酸可以直接施用。在其他实施方案中，可以使用被配置为促进单链核酸的瞬时或组成性表达的载体，用编码所述单链核酸的序列转化未成熟的心肌细胞。可用于该目的的载体平台的非限制性实例包括慢病毒和AAV载体。参见以上关于适用载体的讨论，其在此情况下也适用。
在其他方法中，被靶向进行降低表达的miRNA(即miR-122和/或miR-200a)靶向未成熟心肌细胞内的基因组改变，该改变永久性降低或敲除细胞中功能性靶miRNA的表达。在一个实施方案中，提供具有引导RNA和核酸酶的未成熟心肌细胞。引导RNA具有允许其与编码靶miRNA的基因组序列的区域杂交的序列。杂交后，引导RNA促进了核酸酶对基因组区域的特异性切割。未成熟心肌细胞具有内源性DNA修复酶，该酶定期引入修复错误，这些错误以编码序列内的取代，***或缺失形式出现，从而导致miRNA的功能敲除。即使修复过程在最初的几轮中是精确的，最终，引导RNA/核酸酶/修复组合也将导致错修复，从而导致功能敲除。miR 122和miR 200a的示例性引导RNA在下文的实施例中进行讨论，并在表1中列为SEQ ID NOS：17和18(对于miR-200a)以及SEQ ID NOS：19和20(对于miR-122)。
在一些实施方案中，核酸酶具有核酸内切酶活性。示例性的非限制性核酸酶包括Cas9和TALENS。可基于引导RNA特异性编辑或切割DNA的其他此类核酸酶是已知的，并且被本公开内容涵盖。
引导RNA可以直接或通过在未成熟的心肌细胞中转基因表达引导RNA而提供给未成熟的心肌细胞。，独立于引导RNA，核酸酶可以直接或者通过在未成熟的心肌细胞中转基因表达所述核酸酶而提供给未成熟的心肌细胞。
在一个实施方案中，将与编码靶miRNA的基因组序列的区域杂交的引导RNA直接施用于未成熟的心肌细胞，以促进核酸酶对基因组区域的特异性切割。在其他实施方案中，通过用编码引导RNA的核酸构建体转化细胞，在未成熟的心肌细胞中瞬时或组成性地转基因表达引导RNA。可以为期望的表达选择合适的载体。例如，可用于将引导RNA编码序列整合入未成熟心肌细胞基因组中的载体平台的非限制性实例包括慢病毒和AAV载体。参见以上关于适用载体的讨论，其在此情况下也适用。
如上所指示，核酸酶可直接提供给未成熟的心肌细胞，或可在未成熟的心肌细胞内瞬时或组成性转基因表达。为了在未成熟的心肌细胞中诱导核酸酶表达，可以使用被配置为促进单链核酸的瞬时或组成型表达的载体，用编码核酸酶的核酸构建体转化细胞。例如，可用于在未成熟的心肌细胞基因组中整合核酸酶编码序列的载体平台的非限制性实例包括慢病毒和AAV载体。参见以上关于适用载体的讨论，其在此情况下也适用。
鉴于前述内容，描述了用于诱导心肌细胞成熟的具体实施方案的说明性实例。
在一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导miR-122和miR-200a之一或两者的表达降低。相应的指导RNA和核酸酶(例如，Cas9)在未成熟的心肌细胞中转基因表达。可以将编码引导RNA的DNA(如果两个miRNA都作为靶标，则引导RNA)和编码核酸酶的DNA可以整合入相同或分开的载体中。每个编码DNA区可操作地连接至其自身的启动子序列，所述启动子序列配置为在未成熟心肌细胞中驱动转录。编码引导RNA的序列通常可操作地连接至RNA启动子，以确保转录的引导RNA保持为RNA构建体。在一些实施方案中，将编码miR-122和miR-200a的引导RNA的DNA整合入同一载体中。在其他实施方案中，将编码miR-122和miR-200a的引导RNA的DNA整合入不同的载体中。在一些实施方案中，将编码核酸酶的DNA与编码一个或两个引导RNA的DNA整合入同一载体中。在其他实施方案中，将编码核酸酶的DNA与编码一个或两个引导RNA的DNA整合入不同的载体中。
在一些实施方案中，未成熟心肌细胞的细胞系被转基因修饰以将编码核酸酶的基因整合入细胞基因组中。在该实施方案中，可以在未成熟的心肌细胞或其干细胞祖细胞上实施修饰。例如，使细胞与包含与启动子可操作地连接的编码核酸酶(例如Cas9)的DNA的载体(例如慢病毒载体)接触，其中所述慢病毒载体将表达盒与核酸酶基因和启动子永久整合入细胞的基因组中。启动子可以被配置为促进核酸酶的条件或组成性表达。具有这样的遗传背景，可使未成熟的心肌细胞与如上所述的一种或多种引导RNA接触，所述引导RNA促进编码靶miRNA(例如，miR-122或miR-200a)的DNA的特异性切割。可以使用典型的方法(例如，在细菌中重组表达等)预先产生引导RNA。这允许用所期望的靶miRNA(例如，miR-122和/或miR-200a)的敲除来高效生产心肌细胞的细胞培养物。或者，可使未成熟的心肌细胞与一种或多种质粒或其他载体接触，所述质粒或其他载体掺入如上所述的编码引导RNA的序列，所述序列可促进编码靶miRNA(例如，miR-122或miR-200a)的DNA的特异性切割。可以将编码不同的引导RNA的DNA掺入相同或不同的质粒或其他载体中。整合入基因组不是必需的，并且引导RNA的瞬时表达足以引起细胞的敲除。
在又一个实施方案中，核酸酶(例如，Cas9)和引导RNA(例如，针对编码miR-122或miR-200a的DNA)可以外源产生并直接施用于未成熟的心肌细胞，而不依赖于在未成熟心肌细胞自身中的转基因表达。
在寻求靶miRNA的过表达和其他靶miRNA的降低表达二者的其他实施方案中，可以将驱动每个各自靶miRNA的过表达或降低表达的核酸构建体整合入同一载体构建体中。在示例性的实施方案中，使细胞与包含具有多个核酸表达构建体的表达盒的载体接触。在该实施方案中，细胞可以是未成熟的心肌细胞或其干细胞祖细胞。表达盒可以使用对载体特异的诱导剂促进其中编码的转录物的诱导表达。表达盒可以包括上述编码构建体的任何组合。为了说明，在一个实施方案中，表达盒包含编码一个或多个靶向过表达的miRNA(例如，Let7，miR-452和miR-208b中的一个或多个)的DNA序列以及编码与靶向降低表达的一种或多种miRNA(例如，miR-122和miR-200a之一或两者)杂交的单链核酸的DNA序列。适用于该实施方案的示例性载体是pAC150-PBLHL-4xHS-EF1a-DEST(Addgene，#48234)，其具有位于表达盒侧翼的绝缘子序列以确保盒中的表达构建体不沉默。这种诱导型载体可以通过例如强力霉素诱导，以促进其中所含的MiMaC成员的表达。
如上所述，未成熟的心肌细胞可以来源于干细胞。在一些实施方案中，如实施例中更详细描述的，通过促进干细胞分化为未成熟的干细胞，细胞在体外衍生自干细胞。该过程也更为详细的描述于例如Palpant，N.J.等，Generating high-purity cardiac andendothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stemcells.Nat Protoc,2017.12(1):p.15-31；Burridge,P.W.等,Chemicallydefinedgeneration of human cardiomyocytes.Nat Methods,2014.11(8):p.855-60；和Tohyama,S.等,Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse andhuman pluripotent stemcell-derived cardiomyocytes.Cell Stem Cell,2013.12(1):p.127-37中，其每一篇均通过援引整体收录入本文。干细胞可以是胚胎干细胞、多能干细胞或诱导的多能干细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使未成熟的心肌细胞与有效量的长链脂肪酸接触。如本文所用，术语“有效量”是指足以促进心肌细胞成熟和/或细胞中的心磷脂重塑成更成熟状态的量。在一些实施方案中，该方法进一步包括使未成熟的心肌细胞与至少两种长链脂肪酸种类接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括使未成熟的心肌细胞与至少三种长链脂肪酸种类接触。长链脂肪酸种类可以选自棕榈酸，油酸和亚油酸。通常，棕榈酸与油酸或亚油酸一起使用，因为它本身对细胞可能具有细胞毒性。
长链脂肪酸可以以其中它缀合到可以帮助其摄取和稳定的载剂例如BSA的形式与未成熟的心肌细胞接触。细胞培养基中的示例性油酸/BSA缀合物浓度或范围包括：约10-14μg/mL，约11-13μg/mL，约12-13μg/mL，例如约11μg/mL，约11.5μg/mL，约12μg/mL，约12.5μg/mL，约12.7μg/mL，约13μg/mL和约13.25μg/mL。细胞培养基中的示例性亚油酸/BSA缀合物浓度或范围包括：约5.5-8.5μg/mL，约6.5-8μg/mL，约6.75-8.0μg/mL，例如约6μg/mL，约6.5μg/mL，约7μg/mL，约7.05μg/mL，约7.5μg/mL，约8μg/mL和约8.25μg/mL。细胞培养基中的示例性过棕榈酸(plamitic acid)(棕榈酸钠形式)/BSA缀合物浓度或范围包括：约40-60μM，约45-55μM，约50-55μM，例如约45μg/mL，约48μM，约50μM，约52.5μM，约55μM，约58μM和约60μM。在一个示例性实施方案中，如实施例中所述，脂肪酸介质利用与BSA缀合的油酸(SigmaO3008)的浓度：12.7μg/mL，与BSA缀合的亚油酸(Sigma L9530)的浓度：7.05μg/mL，与BSA(Sigma A8806)缀合的棕榈酸钠(Sigma P9767)的浓度：52.5μM。
在进一步的实施方案中，该方法进一步包括使未成熟的心肌细胞与肉碱以约100-150μM，例如约110-140μM，约115-135μM和约120-130μM的浓度接触。示例性浓度包括约100μg/mL，110μg/mL，约120μM，约125μM，约130μM，约135μM，约140μM和约150μM。肉碱有助于将施用的长链脂肪酸转运到线粒体中。
在一些实施方案中，未成熟的心肌细胞包含遗传畸变。所述遗传畸变可能与心脏的代谢或病理性疾病状态有关。例如，所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。在一些实施方案中，心肌细胞在编码下述之一的基因中包含突变：HADHA，FATP1，FACS1，OCTN2，L-CPTI，M-CPT I，CAT，CPT II，VLCAD，LCAD，MCAD，SCAD，LCHAD，SHYD，M/SCHAD，SKAT，MKAT，HS，HL，ETF和ETF QO，会导致脂肪酸紊乱。通过在诱导成熟的心肌细胞中实施遗传畸变，所得的心肌细胞提供了具有所示畸变的ACM的疾病模型。
在另一方面，本公开提供了通过以上方法产生的心肌细胞。如所指出的，心肌细胞可以来源于干细胞，例如胚胎干细胞，多能干细胞或诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，干细胞来自人。
此外，如更详细地描述的，细胞可以包含遗传畸变，例如与脂肪酸氧化(FAO)紊乱相关的畸变。上面列出了含有示例性遗传畸变的靶基因。在一个实施方案中，遗传畸变是编码HADHA的基因中的突变。
考虑应用MiMaC诱导心肌细胞成熟的方法，该细胞可以包含外源核酸，该外源核酸是或编码待过表达的miRNA(即Let7，miR-452和/或miR-208b)。替代地或另外地，细胞可包含是或编码单链核酸的外源核酸，所述单链核酸可与被靶向进行降低表达的靶miRNA(即miR-122和/或miR-200a)杂交。替代地或另外地，细胞可以包含外源核酸，其是或编码可以与编码被靶向进行降低表达的miRNA的基因组序列(即，miR-122和/或miR-200a)杂交的引导RNA。在涉及用于降低靶miRNA表达的引导RNA的一些实施方案中，细胞还包含核酸酶(例如，Cas9或TALENS)或编码所述核酸酶的核酸构建体。在一个实施方案中，所述细胞包含表达盒，该表达盒具有编码Let7 miRNA的第一核酸，编码miR-452的第二核酸，编码与miR-122的至少一部分杂交的单链核酸的第三核酸，和编码与miR-200a的至少一部分杂交的单链核酸的第四核酸。所述核酸序列与一个或多个启动子可操作地连接。在一个进一步的实施方案中，所述核酸序列的表达可以由强力霉素的应用诱导。
在另一方面，本公开提供了一种治疗患有通过施用具有成熟心磷脂概况的心肌细胞能够治疗的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用有效量的通过本文所述的方法产生的心肌细胞以促进培养物中的成熟。例如，该方法可以包括培养从受试者获得的诱导干细胞以分化为未成熟的心肌细胞，以本文所述的任何形式向细胞施用MiMaC，并允许细胞在其成熟过程中向成年心肌细胞发展。然后可以将细胞施用于需要的受试者。在其他实施方案中，所述干细胞可以来自相同物种的不同受试者。如上所述，所述干细胞可以是胚胎干细胞、多能干细胞或诱导的多能干细胞。
受试者可以是任何哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人，狗，猫，小鼠，大鼠，家兔等。
在一些实施方案中，受试者的心脏组织中的心肌细胞受损。这可以包括受试者患有糖尿病、先天性心脏病、局部缺血、肌病、线粒体疾病和/或患有梗塞事件的情况。在一些实施方案中，线粒体疾病是脂肪酸氧化(FAO)紊乱。在一些实施方案中，受试者患有线粒体三功能蛋白(MTP/TFP)缺乏。在一些实施方案中，受试者在编码HADHA的基因中具有突变。在其他实施方案中，受试者在编码FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPT II、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF和ETF QO中的至少一种的基因中具有突变。
在一些实施方案中，病症或功能障碍可表现为经历心律不齐。受试者可以是具有婴儿猝死综合症(SIDS)的高风险的新生儿或婴儿，诸如例如在具有线粒体三功能蛋白(MTP/TFP)缺乏的情况下。
根据本领域理解的技术，可以容易地配制细胞以施用给受损的心脏组织。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的线粒体脂肪酸氧化(FAO)紊乱的方法。该方法包括施用有效量的稳定受试者线粒体中的心磷脂概况或促进成熟的心磷脂重构的组合物。
受试者可以是任何哺乳动物，诸如人。
线粒体功能障碍可能与糖尿病、心力衰竭、神经退行性疾病、高龄、先天性心脏病、局部缺血、肌病和/或梗死有关。在一些实施方案中，FAO紊乱是脂肪酸β-氧化紊乱。FAO紊乱可以与上述任何基因的突变有关。在一些实施方案中，线粒体功能障碍与心律不齐和/或婴儿猝死综合症的风险增加有关。
在一些实施方案中，稳定心磷脂概况包括防止心磷脂氧化。在一些实施方案中，该组合物是或包含依拉普肽(也称为SS-31)(Stealth BioTherapeutics Inc，牛顿，MA)，其是靶向线粒体的小的四肽，已知其可减少有毒的活性氧种类的产生并稳定心磷脂。在一个实施方案中，向患有线粒体三功能蛋白质缺乏症的受试者施用有效量的依拉普肽。
在另一方面，本公开提供了一种筛选潜在的心脏功能调节的候选化合物的方法。在这方面，本文描述的方法和组合物使得培养的心肌细胞的生产能够在其成熟中进行以更准确地反映成年心肌细胞。因此，此类细胞可以在体外容易地产生，以提供候选药剂/化合物的筛选过程。
所述方法包括使通过本文所述的方法产生的一种或多种心肌细胞与候选药剂接触；并测量该一种或多种心肌细胞中的心脏功能参数。心脏功能参数的变化指示候选药剂调节心脏功能。可以选择促进有利的功能参数和/或减少负面功能参数的候选物作为用于治疗或继续研究的强候选剂或化合物。
心脏功能参数可以包括对心脏组织功能有影响的任何相关的，可测量的参数。非限制性的示例性心脏功能参数包括在特定情况下的脂质概况、心磷脂概况、代谢概况、耗氧率、线粒体质子梯度、收缩力、钙转运、传导速度、葡萄糖应激和细胞死亡。此外，可以在公开的细胞中测试潜在的毒性和给药浓度。
除了筛选候选剂对健康成人心肌细胞模型的影响之外，该方法还包括筛选候选化合物对具有更成熟的心肌细胞状态的疾病模型的影响的实施方案。因此，在一些实施方案中，筛选中使用的成熟的心肌细胞可包含遗传畸变，诸如本文其他地方所述。畸变可以与例如脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。为了说明，下面的实验描述针对的是在HADHA蛋白中具有遗传突变的细胞。诱导细胞发展到更成熟的状态，以提供具有线粒体三功能蛋白(MTP/TFP)缺陷的成年心肌细胞模型。这允许测试化合物以抵消功能障碍。
在另一方面，本公开提供了一种检测培养的心肌细胞的病理状态的方法。该方法包括测定心肌细胞中的心磷脂概况。具有大于18个碳的酰基链的心磷脂的相对增加指示和/或具有小于18个碳的酰基链的心磷脂的相对减少指示心肌细胞的病理状态降低。
用于确定心磷脂概况的示例性脂质组学方法在下文的实施例中更详细地描述。
心磷脂的相对增加或减少可以与心肌细胞的参考标准相比，诸如从野生型成年心肌细胞或已建立为展现正常或可接受的线粒体功能或具有已建立的正常或成熟心磷脂概况的培养心肌细胞衍生而来。在其他实施方案中，心磷脂的相对增加或减少是与野生型未成熟心肌细胞或已建立为展现正常或可接受的线粒体功能或具有已建立的正常或成熟心磷脂概况的培养心肌细胞相比较而言的。下面的实验公开描述了在成熟过程期间培养的人心肌细胞中心磷脂的概况。
如上所述，培养的心肌细胞可以衍生自体外干细胞，诸如胚胎干细胞，多能干细胞或诱导的多能干细胞。
病理状态可以是与线粒体功能障碍相关的状态，如上所详述。在一些实施方案中，线粒体功能障碍是线粒体三功能蛋白缺乏症。
可以执行该方法以确定培养的细胞是否足够成熟，即具有足够的心磷脂重塑，以用于其预期目的。另外，该方法可以在候选药剂化合物的体外筛选期间进行一次或多次，以确定其对心脏内稳态或其他线粒体功能的影响。因此，该方法可以包括使培养的心肌细胞进一步与候选药剂接触，以降低培养的心肌细胞的病理状态。可以针对特定的筛选或处理适当地设计检测步骤的时机。该测定步骤可以例如在使培养的心肌细胞与候选药剂接触以确定该候选药剂对培养的心肌细胞的病理状态的影响的步骤之前，之中和/或之后多次进行。
将理解的是，该测定方法也可以扩展为在从受试者获得的细胞上执行以诊断心肌细胞的病理状态。
在这方面，线粒体三功能蛋白缺乏症通常在来自心脏(心肌细胞)，肝脏(肝细胞)和视网膜的细胞中协同显现。因此，可以从任何这些组织(通常是肝脏)中获得一个或多个细胞，并可以确定心磷脂的概况。如本文所述，具有18个(或更多个)碳链的心磷脂的相对水平较低指示细胞不能将心磷脂从不成熟状态完全重构为成熟状态。心磷脂重塑失败表明细胞不能有效利用脂肪酸作为主要能源。该失败可能与受试者的心肌细胞并行经历，从而导致增加诸如例如心律不齐和SIDS的病理风险。
在另一方面，本公开内容提供了诱导培养的心肌细胞成熟的组合物或组合物的试剂盒。该组合物可用于上述方法中以促进未成熟心肌细胞的成熟。该组合物涉及MiMaC配制剂，并且包含以下两种或更多种：编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体，和是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体。
在一个实施方案中，该组合物包含以下三种或更多种：编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体。在一个进一步的实施方案中，组合物包含编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的核酸片段的核酸构建体。
靶标miRNA在上面更详细地描述。还描述了与编码靶miRNA的序列的一部分杂交的核酸片段，以防止功能性并导致表达的功能性降低。
编码microRNA和/或编码核酸片段的核酸构建体各自可操作地连接至一个或多个启动子序列。
可以将一种或多种构建体掺入配置为递送至细胞的一种或多种载体中。一种或多种载体可以是病毒载体，例如慢病毒或AAV载体。
在一些实施方案中，将每种核酸构建体掺入单独的载体中，因此，该组合物包含多种载体(具有不同掺入的表达构建体)并混合。在另一个实施方案中，将每个核酸构建体掺入相同载体中。例如，可以将多种核酸构建体掺入并入单个载体的相同表达盒中。载体可以被配置为组成型或瞬时(例如通过诱导)促进盒中所有构建体的表达。载体可以提供绝缘子序列以防止递送到细胞后的失活。适用于该实施方案的示例性载体是pAC150-PBLHL-4xHS-EF1a-DEST(Addgene，#48234)。
与编码miR-122的序列的一部分杂交的核酸片段和与编码miR-200a的序列的一部分杂交的核酸片段是引导RNA分子，其被配置为诱导基因编辑酶分别切割miR-122和miR-200a。如上所述，基因编辑酶可以是核酸酶和/或具有核酸内切酶功能。例子是Cas9和TALENS，尽管其他例子是已知的并且被本公开所涵盖。
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒或组合物还包含核酸酶。在其他实施方案中，试剂盒或组合物进一步包含编码核酸酶的核酸构建体。编码核酸酶的核酸构建体可操作地连接至促进核酸酶在靶细胞中表达的启动子序列。
在一些实施方案中，试剂盒或组合物还包含一种或多种长链脂肪酸，其在上文中有更详细的描述。一种或多种长链脂肪酸包括棕榈酸、油酸和/或亚油酸。在一些实施方案中，试剂盒或组合物包含棕榈酸，油酸和亚油酸的组合。
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可进一步包含细胞培养基和说明书，以便于从干细胞衍生的心肌细胞制备成熟的培养的心肌细胞。
在另一个实施方案中，本文公开的试剂盒可以进一步包含干细胞衍生的心肌细胞，其可以是代谢活性的或冷冻的。在另一个实施方案中，试剂盒和/或其任何成分可以在环境温度或室温或例如4℃运输和/或存储。干细胞衍生的心肌细胞可以最终衍生自患有疾病或紊乱(例如，如本文所述的线粒体功能障碍)的受试者，或者经过基因修饰以模拟疾病或紊乱，包括例如心脏病或紊乱。
除非本文具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域的技术人员所了解的相同的含义。关于技术领域的定义和术语，从业人员具体参考：Sambrook J.,等(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2001)；Ausubel,F.M.,等(编辑),Current Protocols inMolecularBiology,John Wiley&Sons,New York(2010)；Coligan,J.E.,等(编辑),CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York(2010)；Mirzaei,H.和Carrasco,M.(编辑),Modern Proteomics–Sample Preparation,Analysis and PracticalApplicationsinAdvances in Experimental Medicine and Biology,SpringerInternational Publishing,2016；以及Comai,L,等(编辑),Proteomic:Methods andProtocolsinMethods in Molecular Biology,Springer International Publishing,2017。
为了方便起见，在此提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中本文采用的某些术语。提供这些定义以帮助描述特定的实施方案，并非意图限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限制。
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公开了可用于公开的方法和组合物产物的材料，组合物和组分，它们可与所述产物联合使用，可以用于制备所述产物，或者可以是该产物。应当理解，当公开了这些材料的组合，子集，相互作用，基团等时，尽管可能没有明确披露这些化合物的每个单独的组合和排列的具体参考，但是具体考虑了各种单独的和集体的组合中的每一个。该概念应用于本公开的所有方面，包括但不限于所描述的方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定元件可以被其他实施方案中的元件组合或替代。例如，如果可以执行多种附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合子集被特别考虑并且应该被认为是公开的。另外，应理解，本文描述的实施方案可以使用任何合适的材料来执行，诸如本文其他地方描述的或本领域已知的材料。
本文所引用的出版物及其所引用的主题据此特别全文收录作为参考。
以下描述了针对线粒体三功能蛋白(MTP)缺乏症的疾病病因的研究，该疾病可导致婴儿猝死综合症(SIDS)。该研究涉及一种新方法的开发，该方法可促进来自诱导的多能干细胞的心肌细胞(CMs)的成熟，从而生成反映相关疾病状态的CMs模型。
摘要
线粒体三功能蛋白缺乏症是由水合酶亚基A(HADHA)突变引起的。为了揭示疾病的病因，从HADHA缺陷型hiPSC产生了干细胞衍生的心肌细胞，并通过上调表观遗传调节因子HOPX的新型工程化MicroRNA成熟混合物(“MiMaC”)加速了它们的成熟。脂肪酸攻击的MiMaC处理的HADHA突变型心肌细胞显现出疾病表型：导致前心律失常状态的缺陷型钙动力学和复极化动力学。基于代谢基因表达，单细胞RNA-seq揭示了一种新型的心肌细胞发育中间体。该中间体在对照细胞中产生了成熟样的心肌细胞，但突变细胞转变为具有降低的脂肪酸β-氧化(FAO)，降低的线粒体质子梯度，破坏的线粒体嵴结构和有缺陷的心磷脂重塑的病理状态。这项研究表明，TFPa/HADHA，一种MLCL-AT样酶，对于FAO和心磷脂重塑是必需的，而重塑对于人类心肌细胞的功能性线粒体至关重要。
结果
线粒体三功能蛋白缺陷型心肌细胞的产生
为了在体外从细胞水平上概括线粒体三功能蛋白缺乏的心脏病理学，使用CRISPR/Cas9系统在人iPSC的基因HADHA中产生突变。从用作我们的等基因对照的野生型(WT)hiPSC系，使用两种靶向HADHA突变外显子1的不同向导，生成了多个HADHA突变体hiPSC系，并通过Western印迹证实了克隆(未显示)。使用gRNA1产生的敲除(KO)HADHA(HADHAKO)和化合物杂合子(HADHAMut)hiPSC系用于进一步研究。
检查HADHAKO系的DNA序列显示纯合的22bp缺失，这导致外显子1的早期终止密码子(图1B)。HADHAMut系在第一个等位基因上有2bp缺失和9bp***，在第二个等位基因上有2bp***(图1C)。两条线在前三个预测位点均未显示脱靶突变(未显示)。在HADHAMut系中发现的突变导致两个等位基因上的预测的早终止密码子。(对应于图1C所示的野生型序列的代表性HADHAMut蛋白片段序列在SEQ ID NO：6中列出。对应于图1C所示的两个HADHAMut突变等位基因的HADHAMut蛋白质片段序列分别如SEQ ID NO：8和10所列)。然而，当检查每个品系中的蛋白质时，观察到HADHA在WT hiPSC系中表达，在HADHAKO系中不表达，并且仍在HADHAMut系中以较低的程度表达(图1D)。然后检查在WT和HADHAMut系中表达的HADHA的转录物。发现WT系表达来自外显子1-20的全长HADHA转录物，而HADHAMut系跳过了外显子1-3而表达了HADHA外显子4-20(图1C)。由于没有外显子4-20的HADHA已知转录物，内含子-外显子连接处产生的突变可能诱导了替代性剪接事件和新的转录物。观察到的HADHA突变体分子量的降低(图1D)支持这一假设。表达的HADHAMut蛋白质跳过了外显子1-3，60个氨基酸的表达，生成了截短的C1pP/巴豆酶结构域，这可能会损害线粒体的定位和酶口袋的蛋白质折叠，从而导致不能稳定FAO期间的烯醇化阴离子中间体。
采用单层定向分化方案[Palpant,N.J.,et al.,Generating high-puritycardiac and endothelial derivatives from patternedmesoderm using humanpluripotent stem cells.Nat Protoc,2017.12(1):p.15-31]，从这三株系中产生了人诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)。发现HADHA的减少或丢失不会阻碍产生心肌细胞的能力(参见图1E中的图像)。为了评估MTP缺陷型心肌细胞的功能表型，进行了海马测定以测量由于长链FA(棕榈酸酯)的存在而导致的消耗氧气的增加。与WT CM相比，预期MTP不足的CM展示出利用长链FA的能力受阻。但是，发现所有CM，甚至是控制CM，都不能利用长链FA(图1F)。hiPSC-CM是代表FCM而非ACM的未成熟细胞，这就是为什么它们不能将FA用作ATP生产的底物的原因。因此，需要一种策略来使hiPSC-CM成熟，以便它们可以利用FA来更好地评估MTP缺陷CM的功能表型。
筛选用于hPSC-CM成熟的microRNA(miR)
为了更好地理解人类心脏成熟期间发生的生物学变化，发明人先前进行了miR筛选，其中在第20天(D20)hPSC-CM和1年成熟的hPSC-CM之间进行体外转变期间观察到许多显著调节的miR[Kuppusamy,K.T.等,Let-7family of microRNA is required formaturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes.ProcNatl Acad Sci U.S.A.,2015]。此列表与人胎儿心室至成人心室心肌的体内miR测序数据交叉参照[Akat,K.M.等,Comparative RNA-sequencing analysis of myocardial andcirculating small RNAs in human heart failure and their utility asbiomarkers.Proc Natl Acad Sci U S A,2014.111(30):p.11151-6；Yang,K.C.等,DeepRNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs infailing human heart and remodeling with mechanical circulatorysupport.Circulation,2014.129(9):p.1009-21]。发明人先前发现，miR的最高上调家族，Let-7，可以在hESC-CM中过表达以驱动强劲(尽管不完整)的成熟应答[Kuppusamy,K.T.等Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2015]。在此，通过促进更完整的成年样转录组，将另外的miRs与Let-7组合在一起以快速成熟hPSC-CM。从筛选中选择了前15个上调和下调的miR，并为每个miR鉴定了前200个预测靶标(TargetScanHuman)。对每个miR的预测目标，使用GeneAnalytics软件进行路径分析，以确定哪些miR影响与心肌细胞成熟相关的路径。这些包括葡萄糖和/或脂肪酸代谢，细胞生长和肥大以及细胞周期。许多下调的miR与维持多能状态有关，因此并未选择其筛选心肌细胞的成熟状态。最终，基于途径分析，选择了六个miR进行进一步分析，以评估其CM成熟效力：三个上调的miR(miR-452，-208b和-378e)和三个下调的miR(miR-122，-200a和-205)(图2A)。
具体而言，选择的三个候选的高度上调的miR是miR-378e[Nagalingam，R.S.等，富含心脏的microRNA miR-378e[Nagalingam,R.S.等,A cardiac-enriched microRNA,miR-378,blocks cardiac hypertrophy by targeting Ras signaling.The Journal ofbiological chemistry,2013.288(16):p.11216-32]，-208b[Callis,T.E.等,MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice.J ClinInvest,2009.119(9):p.2772-86]和-452。选择378个miR的家族是因为它们在成熟CM中的高表达水平，并涉及心脏肥大。MiR-378e和-378f共享相同的种子区，且miR-378e被选为378家族的代表性miR。选择Mir-208b是由于它预测涉及代谢和心脏肥大途径二者。此外，miR-208b是基因肌球蛋白β重链(MYH7)中的内含子miR，并据报道在抑制小鼠心脏中的快速肌纤维基因程序的同时，还在指定慢肌纤维中起作用[van Rooij,E.et al.,A family ofmicroRNAs encoded by myosin genes governs myosin expression and muscleperformance.Dev Cell,2009.17(5):p.662-73]。MiR-452是Let-7之后第二高的上调的miR，被发现具有与代谢相关的预测靶标。
选择的三个高度下调的候选miR是miR-200a，-122和-205。MiR-141和-200a共享相同的种子区，并且涉及肥大和代谢途径二者。选择MiR-200a作为代表性miR进行研究。其他两个高度下调的miR，miR-205和miR-122显示出最大程度的下调。
候选microRNA(miR)的功能分析
使用四个功能测试评估上述六个miR以确定hPSC-CM成熟：细胞面积，收缩力，代谢能力和电生理。使用CRISPR/Cas9用慢病毒转导WT D15 hiPSC-CM成OEmiR或KO miR。然后乳酸选择细胞以富集心肌细胞群，并嘌呤霉素选择以富集含有病毒载体的细胞群。在D30miR扰动两周后进行功能评估(图2B)。
心肌细胞成熟的一个重要特征是细胞大小的增加。在测试的miR中，仅发现miR-208b OE诱导细胞面积显著增加(EV：2891μm2，208b：5802μm2，P<0.05)(图2C)。当通过细胞外微电极研究时，未成熟的hPSC-CM自发性高速率跳动，场电位持续时间短。使用微电极阵列，对OE miRs进行评估，以确定它们是否将场势持续时间增加到生理上相关的长度。在测试的miR中，只有miR-452OE将校正后的场电势持续时间(corrected field potentialduration，cFPD)增加到更成人样持续时间(cFPD，EV：296ms，452：380ms)(图2D)。心肌细胞成熟的标志之一是细胞产生的收缩力增加。使用微柱平台进行单细胞收缩力分析[Kuppusamy,K.T.等,Proc Natl Acad Sci U S A,2015；Rodriguez,M.L.等,Measuringthe contractile forces of human induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes with arrays of microposts.J BiomechEng,2014.136(5):p.051005；Beussman,K.M.等,Micropost arrays for measuring stem cell-derivedcardiomyocyte contractility.Methods,2016.94:p.43-50]。在测试的miR中，只有miR-200a的KO引起收缩力的显著增加(EV：30.8nN，miR-200a：51.7nN，P<0.05)(图2E)。最后，评估了经miR处理的hPSC-CM的代谢能力。心肌细胞是代谢需要的细胞类型，需要线粒体，其具有高的ATP合成能力。在测试的miR中，只有miR-22的KO导致最大耗氧率(oxygenconsumption rate，OCR)显著增加，指示更活跃的线粒体(miR-122KO：与EV相比变化1.35倍，P<0.001)(图2F)。
候选microRNA(miR)的生物信息学分析
在某些miR(miR-378e OE，-208b OE，-452OE，-122KO或-205KO)改变后进行RNA测序，以评估其在hPSC-CM中的整体转录影响。为了确定每个miR是否能够在全局转录水平上产生差异作用，使用主成分分析(PCA)对样品进行了分析。在每个样品中，大约有11,000个蛋白质编码基因被表达，跨越所有样品的至少三个FPKM的聚集表达被用于PCA。PCA显示，每个miR都能从其各自的对照带来显著变化(未显示)。MiR-452OE在PC1上的分离最大，而miR-122KO在PC2上的分离最大。这表明这两个miR中的每一个均对hPSC-CM转录概况具有强大的影响。此外，由于没有miR相互聚簇，因此每个miR都能诱导独特的表达特征。
然后通过专门检查心脏成熟必不可少的途径，以更具针对性的方式分析每个miR的功能。生成了显示每个miR如何影响被选为心肌细胞成熟标志的7条不同途径的途径富集热图(表征为心脏肥大，心脏同一性，细胞周期，电生理，脂肪酸代谢，葡萄糖代谢和细胞骨架；未显示)。MiR-122KO具有细胞周期和脂肪酸代谢基因上调。MiR-452OE显示出心脏肥大、电生理和细胞骨架的上调。MiR-208b OE显示心脏同一性连同细胞周期和电生理基因的强烈上调。最后，miR-378e OE显示出电生理基因的上调，而miR-205KO显示出与心脏成熟相关的途径的上调较差。该热图加强了每个miR对心肌细胞成熟的独特影响，因为每个miR带来了不同的一套途径富集。此外，基于热图数据，miR-205KO导致心肌细胞成熟的能力较弱，而miRs-122KO，-452OE和-208b OE均显示出影响心肌成熟的标志性途径的强大能力。
根据这些数据，生成了称为MiMaC的MicroRNA成熟鸡尾酒混合物，该鸡尾酒混合物包括以下构建体：Let7i OE，miR-452OE，miR-122KO和miR-200a KO。选择Let7i是由于发明人的初步研究，该研究显示了此miR引起心肌细胞成熟的潜能[Kuppusamy，KT等，Proc NatlAcad Sci El SA，2015]。从每种功能测定法中，选择带来了成熟度显著提高的miR以产生由最少数目的miR组成的混合物。
MiMaC的功能评估
为了评估MiMaC处理的hPSC-CM的成熟度，我们进行了收缩力、细胞面积和代谢测定(图3A)。与对照细胞(平均力：24nN)相比，用MiMaC处理的hiPSC-CMs的抽搐力(平均力：36nN，P＝0.002)具有统计学上的显著增加(图3B)。与对照细胞(平均功率：22fW)相比，经MiMaC处理的hiPSC-CM的产生功率(平均功率：38fW，P＝0.016)也有统计学上的显著增加(图3D)。
经MiMaC处理的hPSC-CM在细胞面积上具有统计学上的显著增加。使用hiPSC-CM，与具有平均面积2389μm2的对照细胞相比，经MiMaC处理的CM的平均面积为3022μm2，P<0.001(图3E和3F)。除了MiMaC对hiPSC-CM的影响之外，MiMaC还显著增加了处理过的hESC-CM的细胞面积(未显示)。
心肌细胞成熟的标志之一是获得利用FA生成ATP的能力。不成熟的hPSC-CM无法利用长链FA经由β-氧化来生产ATP。为了评估用MiMaC处理的hPSC-CM是否可以氧化长链FA，用棕榈酸盐/酯对细胞进行了急性攻击，并测量了OCR是否增加。经MiMaC处理的hESC-CM和hiPSC-CM二者均能比对照CM显著更大地利用棕榈酸盐/酯(参见针对hiPSC-CM的图3G；hESC-CM的相似结果未显示)。
MiMaC的转录评估
为了更好地了解MiMaC如何影响hiPSC-CM的转录组，对比D30EV对照CM与D30MiMaC处理的CM进行RNA测序。使用标志性基因集进行的途径富集分析表明，许多细胞成熟和肌肉过程均被上调，例如：肌发生和上皮间充质转变[34]。顶部的下调途径与细胞周期相关，这是心肌细胞成熟的一个关键特征。使用STRING分析，我们确定了与两个途径相关的显著上调和相互关联的基因的网络：肌发生和上皮间质转变。还使用STRING分析显示与细胞周期受抑制相关的显著下调和相互关联的基因是有丝***纺锤体和G2M检查点。这些发现表明，MiMaC工具可在hiPSC-CM中促进更成熟的转录组。
HOPX是CM成熟的新型调节剂
为了更好地了解对于心脏成熟至关重要的分子机制，确定了所选六个miR的重叠预测靶标。预测的靶标之一，HOPX(图3H)对于心肌母细胞的规范很重要[Jain,R.等,HEARTDEVELOPMENT.Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitmentof cardiomyoblasts.Science,2015.348(6242):p.aaa6071]，但有关此转录调节子的工作尚未解决后来的过程，即人类心肌细胞的成熟。在这里，确定了HOPX表达在体外(图3I)，在体内(图3J)和在MiMaC处理的hiPSC-CM(图3K)中被上调。为了分析所选的MiMaCmiR如何可能在成熟期间单独调节HOPX表达，分析了miR-122KO和Let7i OE hiPSC-CM中的HOPX水平。发现HOPX在D30 miR-1 22KO hiPSC-CM中被上调了6.8倍，而Let7i OE成熟的hiPSC-CM对HOPX表达没有影响(未显示)。这些数据指示Let7i OE成熟不支配HOPX心脏成熟途径。这突显了将多个miR组合在一起以在hPSC-CM中产生强大的成熟效果的必要性，并且HOPX似乎是定向后心肌细胞成熟的强有力候选者。
miR处理的CM成熟的scRNA测序分析
通过使用单细胞RN A测序(scRNA-Seq)，利用MiMaC工具进一步洞察心肌细胞成熟的潜在机制，并更好地了解构成MiMaC的每个miR在CM成熟中的行为。对五组经miR处理的CM进行scRNA-Seq：EV，Let7i和miR-452OE，miR-1222和-200a KO，MiMaC和MiMaC+FA。进行了无偏倚聚簇以确定miR扰动如何改变CM；发现了五个亚组(图3L)，并使用卡方检验评估了miR扰动是否导致了这五个簇的富集(图3M)。EV组富集于簇0和3中，Let7i和miR-452OE组富集于簇0和1中，miR-122和-200a KO组富集于簇0和3中，而MiMaC和MiMaC+FA富集于簇1和2。簇4主要由读取计数较差的细胞组成，因此不作进一步分析。对每个亚组中的细胞命运进行表征显示，大多数细胞是心肌细胞，簇1中非常小的细胞子集展示成纤维细胞(ENC1，DCN和THY1)和心外膜标志物(WT1，TBX18)(未显示)。这些数据表明乳酸富集方案成功生成了高度富集的心肌细胞群。
为了对哪些簇具有更高程度的心肌成熟进行排序，以两种不同的方式评估了scRNA-Seq簇。首先，对富集MiMaC的簇(簇2)中高度上调和下调的基因连同心脏标志物和氧化磷酸化基因进行了评估(图3N)。其次，检查已鉴定簇中的体内人心脏成熟标记物(图3O)。发现簇2具有高度上调的与肌原纤维结构蛋白相关的基因以及下调的核糖体和ECM粘附基因(图3N)。与其他簇相比，簇2中体内成熟标记基因的平均表达水平显著更高(图3O；P<2x10-16，使用线性混合效应模型)。这些相同的分析也基于实验组进行。如一系列tSNE图和热图(未显示)所示，还发现用MiMaC处理的细胞最成熟。基于这些发现，将每个簇从最不成熟到最成熟按簇排序为：0<1<3<2。簇2，富集了MiMaC处理的CM的最成熟的CM簇，显示了最高的HOPX表达，该基因在成熟中被上调，并且是MiMaC中miR下调的预测靶标(未显示)。重要的是，这些数据指示观察到的转录成熟反映了正常的体内心肌细胞成熟(图3O)。
最后，评估了向MiMaC配方中添加脂肪酸以增加心肌细胞的成熟。将三种长链脂肪酸棕榈酸酯，亚油酸和油酸添加到所用的基础心脏培养基中。我们发现MiMaC+FA细胞富集于簇2中。尽管一些研究显示了特定FA的脂毒性，但对经过仔细优化的FA处理程序的分析显示指示凋亡的转录物没有增加，表明该测定法的脂毒性最小化(未显示)。这些数据指示，MiMaC对实现我们的hiPSC-CM的强大转录成熟至关重要，并且有必要将所有四个microRNA在一起以实现这种强大的成熟反应。
scRNA-Seq揭示了一个中间的心肌细胞成熟阶段
在对经过miR处理的CM进行无偏倚分析之后，很明显，每种miR组合都会导致不同状态的CM成熟的富集。有趣的是，富含Let7i和miR-452OE的心肌细胞簇1显示了OXPHOS和Myc靶基因的强大上调，但在大多数心肌细胞成熟标记物中尚未显著增加(图3N和3O)。因此，Let7i和miR-452OE的处理产生了中间成熟度CM，其中代谢成熟为主导。这些数据表明，可能的中间阶段是胎儿样CM到更成熟CM之间的必要过渡阶段，这需要OXPHOS基因的瞬时上调。
MTP/HADHA缺陷型CM展示降低的线粒体功能
MiMaC工具的产生允许研究HADHA CM疾病病因。由于未成熟的hPSC-CM不能氧化脂肪酸，因此必须用MiMaC使HADHA Mut和KO CM成熟，其导致WT CM中的脂肪酸氧化。首先，评估了WT，HADHA Mut和KO CM的最大OCR。与对照细胞相比，经MiMaC处理的WT CM的最大OCR(变化2.2倍)具有统计学上的显著增加(图4A和4B)。有趣的是，对照和经MiMaC处理的HADHAMut CM具有与对照WT-CM相似的最大OCR，而HADHA KO CM具有降低的最大OCR。这些数据表明在Mut和KO CM中，HADHA的线粒体活性存在缺陷。
接下来，评估用MiMaC处理的HADHA Mut和KO CM是否可以利用脂肪酸棕榈酸酯生产ATP。由于添加了棕榈酸酯，只有MiMaC处理的WT CM的耗氧量有统计上的显著增加(图4C)。WT对照CM连同对照和经MiMaC处理的HADHA Mut和KO CM不能利用FA。这些数据显示经MiMaC处理的CM具有利用长链FA的能力。然而，用MiMaC处理的HADHA Mut和KO CM无法做到这一点。MiMaC对于评估HADHA Mut和KO CM的FAO限制至关重要。
HADHA Mut CM的异常钙处理
MTP缺乏的婴儿出生后可能会出现突然的、最初无法解释的死亡。有人提出，脂质(母亲母乳中发现的ATP产生的主要底物)的压力是造成因MTP缺乏而导致早期婴儿死亡的原因。为了解决这个假设，将三种长链脂肪酸的组合补充到含有葡萄糖的基础心脏培养基(Glc+FA培养基)中：棕榈酸盐/酯，油酸和亚油酸，因为这些FA在母乳喂养的人类婴儿血清中最丰富。棕榈酸盐/酯作为脂肪酸的底物，是新生儿期间循环的最丰富的脂肪酸之一，代表所有长链游离脂肪酸的36％。尽管用FA攻击CM可能导致脂毒性，还是小心研发了不会导致脂毒性的三种脂肪酸的浓度和组合(图3L)。
为了更好地理解缺乏MTP的CM可能造成导致SIDS的心律失常状态的方式，在WT和HADHA Mut CM中测量了钙瞬变(例如参见图4D)。与钙上升速率未改变(未显示)的HADHAMut CM(WT CM：2.03，Mut CM：1.55，P<0.001)(图4E)相比，WT CM中循环的钙的倍数变化明显更高(图4E)显示)。这表明钙是从细胞质中循环出来的，并以异常方式储存在HADHA MutCM中。检查tau-decay常数时，发现HADHA Mut CM具有较高的平均值(WT CM：0.63s，Mut CM：0.76s)(图4F)。这表明在HADHA Mut CM中，将钙泵回肌/内质网的速度较慢。
HADHA Mut CM中延迟的复极化和搏动率异常
因为在Glc+FA培养基中培养的HADHA Mut CM表现出异常的钙循环，所以评估了这些CM是否也表现出异常的电生理学。使用电压敏感的荧光染料Fluovolt确定膜电位的变化。发现虽然HADHA Mut CM在电压幅度的最大变化，达到最大去极化的时间或去极化速率方面没有变化(图4G和4H)，但在检查复极化速率时观察到了显著差异。发现HADHA Mut CM中达到波时限(WD)50％(WD50)和90％(WD90)的时间显著更长于WT CM(WD50见图4I；WD90观察到相似的结果，未显示)。这些数据表明HAHDA Mut CM的复极化受损。这种表型可能是由于观察到的钙动力学异常引起的，这是由于钙循环回肌浆网的受损所致。
因为HADHA Mut CM表现出钙处理和电生理缺陷，所以评估了这些CM是否表现出搏动率异常。在存在FA的情况下跟踪HADHA Mut CM的自发搏动，以量化搏动率异常。HADHAMut CM由于搏动之间的时间不均匀而展示出异常的搏动率变化(例如，参见图4J)。量化这些发现后，发现HADHA Mut CM的搏动间隔显著较高(未显示)，搏动间隔(ΔBI)的变化显著更大(图4K)。这些数据表明HADHA Mut CM的搏动平均较慢，搏动之间的时间变化更大。此外，对大于250ms的ΔBI百分比进行了定量，与在Glc培养基中的Mut CM(10％)相比，在Glc+FA培养基中12D后的HADHA Mut CM平均具有更高百分比的潜在心律失常ΔBI(-30％)。ΔBI大于250ms的细胞数目的这种定量分析提示不稳定地跳动的细胞。最后，在每个组的心跳间隔数据周围，用拟合的椭圆(95％置信区间)生成一个Poincare图(图4L)。较窄和细长的椭圆形表示均匀的心跳间隔，而较圆的椭圆形表示心跳速率异常。取每个椭圆的长轴与短轴之比，我们发现HADHA MutGlcGlc条件具有4.36的比率，而HADHA Mut Glc+FA条件具有3.12的比率，表明HADHA Mut Glc+FA条件具有更圆形的椭圆，意味着这些CM中的搏动间差异更大。
单细胞RNA测序鉴定HADHA Mut CM亚群
进行单细胞RNA测序以更好地了解当用FA挑战时HADHA Mut CM群体的行为。详细描述每个测序细胞组的tSNE图显示了WT和HADHA Mut CM之间的明显区别，有很小但显著的重叠(图5A)。在进行无偏倚聚簇时，发现了6个簇：0个HADHA Mut CM未复制，1个WT和Mut CM的中间成熟种群，2个HADHA Mut CM复制，3个健康CM，4个成纤维细胞样种群，5个心外膜样种群(图5B和5C)。
为了评估成熟度和疾病状态，基于上述关键类别对每个簇进行了分类(图3N)。簇3中的上调基因与肌原纤维组装和横纹肌细胞发育有关，而簇3中的下调基因与核糖体蛋白和ECM相关蛋白有关。有趣的是，如上所述，在中间CM成熟簇(簇1)中鉴定到了WT和HADHAMut CM二者的子集(图3L和5D)。该心脏种群具有较高的OXPHOS和Myc靶基因(诸如FABP3，COX6C，ATP5E，UQZRQ，NDUFA1和COX7B)上调。从这个中间状态进一步发育的WT细胞被鉴定为处于更成熟的CM状态(簇3)。但是，HADHA Mut细胞进入了两种不同的疾病病理状态。据推测，首先，HADHA Mut细胞连同细胞周期抑制剂CDKN1A一起失去许多高度表达和抑制的心脏标志物，如簇0所示(补充图5C)。最后，簇2中患病严重的HADHA Mut CM上调在成熟CM中应被高度抑制的基因，并激活细胞周期基因(图5D)。例如，tSNE图显示HADHA Mut CM失去细胞周期阻遏物CDKN1A，并且一部分HADHA Mut CM获得增殖标记物：MKI67和RRM2(未显示)。这些成熟和疾病发展阶段是根据体内小鼠和人类成熟标志物进行基准测试的，成熟度、疾病发展和心脏特性的丧失也发现了类似的趋势(图5E)。
检查HADHA Mut CM簇和WT CM簇之间的显著改变的标志性途径，发现OXHPOS，心脏过程和肌发生在突变细胞中被抑制。此外，尽管WT CM显示出细胞周期阻遏物CDKN1A的强表达，但两个HADHA Mut CM群体均失去了该表达。复制的HADHA Mut CM的簇2具有上调的DNA复制，G2M检查点和有丝***纺锤体基因。此外，在复制和/或内吞细胞中表达的基因诸如MKI67和RRM2仅在簇2HADHA Mut CM中表达。为了解决异常细胞周期标记物增加的潜在病理后果，分析了HADHA突变体CM中每个细胞的核数目。重要的是，我们观察到与WT CM相比，HAHDA Mut CM中每个细胞的细胞核显著增加(卡方检验P<0.001)(图5F和5G)。大多数WT CM是单核或双核的，这是关于CM中的核数目的体内发现的健康状态。然而，单核HADHA Mut CM的数目显著减少，而双核和多核HADHA Mut CM的数目增加，提示HADHA Mut CM中的病理状态。这些数据支持在HADHA Mut CM亚群(簇2)中显示的令人惊讶的高细胞周期转录物表达。这些数据提示HADHA突变体CM中疾病状态的多个阶段。
为了确保细胞周期不是所有簇之间的根本差异，在每个簇中检查了细胞周期基因。不像以前的研究发现对簇差异的偏倚是由细胞处于哪种细胞周期状态决定的，发现只有簇2(图5B)显示出上调的细胞周期基因。还通过去除细胞周期基因重新处理了聚簇数据，除最初的聚类2(高细胞周期HADHA Mut CM)外，所有簇均保留。这些发现提示细胞周期是簇2而非其余细胞种群的根本原因(图5A和5B)。
基于此数据，在受到FA挑战的HADHA Mut CM中假设了三种不同的病理状态：中间状态：：非复制CM状态：：复制CM状态。簇1显示出CM成熟的中间状态，其特征在于OXPHOS和Myc靶基因升高。重要的是，WT和HADHA CM二者均在簇1中发现，提示HADHA CM仅表现出病理表型，在成熟期间发育后期将其与野生型细胞分开，类似于在人类发育中看到的。然而，簇0仅包含HADHA突变体CM，并显示出具有抑制的细胞周期抑制因子连同抑制的代谢和心脏结构基因的病理状态。最后，簇2是具有抑制的代谢和心脏基因以及上调的细胞周期基因的最病理状态。
进行了无偏性代谢途径分析，筛选了68条代谢途径，发现与WT CM簇3相比，HADHAMut CM簇0和2显示出减少的代谢途径基因表达(图5H和5I)。具体而言，OXPHOS是胆固醇代谢和脂肪酸氧化紧随其后的最下调途径之一。有趣的是，在簇2中，有两个高度上调的代谢途径：核苷酸相互转化和叶酸代谢，这是DNA合成中涉及的两个关键代谢过程(图5J)。由于HADHA Mut CM显示出包括脂肪酸和OXPHOS基因在内的许多代谢途径的下调，因此检查这些细胞的线粒体和肌原纤维。
HADHA Mut和KO CM的肌小节降解和线粒体异常活性
当仅在葡萄糖培养基中培养HADHA Mut和KO CM时，与WT CM相比，在HADHA Mut和KO中没有观察到明显的缺陷(未显示；共聚焦图像是D24和D30 WT的，在葡萄糖培养基中培养HADHA Mut和HADHA KO hiPSC-CM，α辅肌动蛋白和肌动蛋白(phalloidin)的肌原纤维染色未显示异常；ATP合酶β亚基的线粒体染色和经由线粒体示踪染色显示的线粒体电位梯度未显示线粒体异常。然而，当在FA培养基中培养6-12天时，HADHA Mut和KO CM中显现肌节和线粒体缺陷，而WT CM则表现正常(图6A；未显示：在6D葡萄糖和脂肪酸培养基处理后，HADHAMut和KO hiPSC-CM展示出肌节蛋白破坏的迹象，如较少定义的α辅肌动蛋白染色所见，以及线粒体质子梯度损失的开始，如突变体中线粒体示踪染色所见；ATP合酶β亚基在WT和HADHAMuthiPSC-CM二者中均显示正常的线粒体网络而在HADHA KO hiPSC-CM中出现线粒体网络丧失的开始)。在Glc+FA培养基处理12天后，WT CM具有健康的肌原纤维，而HADHA Mut CM则显示出肌节溶解，因为α辅肌动蛋白染色呈点状且肌动蛋白丝难以检测(图6A)。接下来评估线粒体健康，因为HADHA Mut和KO CM不能加工长链FA。使用ATP合酶β亚基对线粒体进行染色以评估线粒体网络的存在。WT和HADHA Mut CM二者都具有许多相连的线粒体，而KO CM在6D FA时已经失去线粒体网络成为较小的更圆形的线粒体。为了评估这些线粒体的功能性，经由线粒体示踪橙染色分析了线粒体质子梯度。在富含Glc+FA的培养基12天后，HADHA MutCM具有高度降低的线粒体膜质子梯度(图6A和6B)。
为了更好地评估肌节和线粒体疾病的表型，在Glc+FA暴露12天后，对WT和HADHAMut CM进行了透射电子显微镜(TEM)(图6C)。WT CM显示丰富的肌原纤维，清晰的Z带，但不清晰的A带和I带，没有M线，指示CM肌原纤维形成处于中间的正常阶段。此外，WT CM显示具有良好的内嵴形成的健康线粒体。相比之下，HADHA Mut CM显示出不良的肌原纤维，其具有Z盘结构中断被点状Z体所取代和在细胞质中分散的肌丝。有趣的是，HADHA Mut CM线粒体小而肿胀，具有非常基本的线粒体嵴形态(图6C)。WT和HADHA Mut CM线粒体的量化显示，与WT线粒体相比，HADHA Mut线粒体面积更小，更圆润(图6D和6E)。最后，检查复杂的I-V蛋白的蛋白质印迹分析显示在Glc+FA条件下，HADHA Mut CM的复合I-IV蛋白表达降低(未显示)。这些数据显示当暴露于FA时，HADHA CM会丧失肌小节结构、线粒体膜电位和形态。
SS-31挽救了长期暴露于FA的HADHA Mut CM中的异常质子泄漏
为了更好地了解暴露于慢性FA的HADHA Mut和KO CM的病理状态，对它们的线粒体进行了功能上的评估。与WT细胞相比，经Glc+FA处理的HADHA Mut和KO CM的最大OCR显著降低(Mut CM：190pmoles/min/cell，KO CM：125pmoles/min/cell，WT CM：359pmoles/min/cell，P<0.05)(图6F)。此外，HADHA Mut CM显示出降低的氧依赖性ATP产生(Mut CM：51pmoles/min/cell，KO CM：43pmoles/min/cell，WT CM：93pmoles/min/cell，P<0.05)(图6G)和HADHA Mut CM显示出降低的糖酵解能力(Mut CM：14mpH/min/cell，KO CM：18mpH/min/cell，WT CM：23mpH/min/cell，Mut Vs WT P<0 05)(未显示：经由线粒体压力测定法观察，并计算为寡霉素和2-脱氧-D-葡萄糖后的细胞外酸化率之间的差异。由于暴露于FA导致线粒体膜电位降低和ATP生成减少，因此推测这可能部分是由于质子泄漏增加所致。通过测试抑制ATP合酶(寡霉素处理)和抑制电子传输链(抗霉素，鱼藤酮)之间的OCR差异，证明HADHA Mut和KO CM的质子泄漏明显高于WT CM(Mut CM：7.66pmoles)/min/cell，KO CM：10.52pmoles/min/cell，WT CM：3.64pmoles/min/cell，P＜0.05)。先前的研究表明，线粒体靶向肽elamipretide(SS-31)可以防止线粒体去极化和质子泄漏。有趣的是，用elamipretide(SS-31)对HADHA Mut心肌细胞进行1nM处理挽救了Glc+FA挑战的Mut CM中质子泄漏的增加(图6H)。这些数据提示暴露于FA的HADHA Mut和KO CM造成部分由于质子泄漏增加导致的线粒体能力降低，。
HADHA功能丧失导致长链脂肪酸积累
在脂肪酸β-氧化的第一步中，酰基辅酶A脱氢酶在α和β碳之间生成双键。因此，第一步后，HADHA的破坏应导致FA中间体的积累(图7A)。为了评估HADHA Mut和KO CM中长链脂肪酸氧化的破坏，进行了非靶向脂质组分析以表征整体脂质组变化。
与WT CM相比，HADHA Mut和KO CM中的长链酰基肉碱有所增加，而中链酰基肉碱水平无明显变化(图7B；中链酰基肉碱水平的结果未显示)。这些数据表明，在没有HADHA的情况下，HADHA中的突变导致线粒体中长链脂肪酸的积累。在长链FAO的第一步中，饱和脂肪酸被加工成具有单个双键的脂肪酸，例如：14:0→14:1,16:0→16:1和18:0→18:1，而在羧基端的不饱和脂肪酸则经历了FAO的第一步并获得了另一个双键，例如：18:1→18:2and 18:2→18:3。因此，发现HADHA Mut和KO CM中饱和脂肪酸：14：0、16：0和18：0的水平变化最小(未显示)，但是14：1、16：1、18：1的丰度大大增加，连同HADHA KO CM中的18：2和18：3略有增加(图7C-7E；未显示HADHA KO CM中18：2和18：3的结果)。这些数据表明，HADHA的破坏和KO导致特定的长链FA中间体积累。然而，观察到的惊人表型之一是线粒体变圆和塌陷，而不是由于潜在的脂肪酸过载而破裂的线粒体。因此，下一步是检查另一类调节线粒体结构的磷脂，即心磷脂。
HADHA和TAZ系列作用造成成熟的心磷脂重塑
心磷脂(CL)是对于最佳线粒体功能和体内稳态所必需的磷脂，因为它与其他线粒体功能一起维持电子传输链功能。CL是线粒体内膜的主要磷脂，在线粒体中合成，并在产后发育和疾病期间动态重塑[参见，例如Kiebish,M.A.等,Myocardial regulation oflipidomic flux by cardiolipin synthase:setting the beat for bioenergeticefficiency.J Biol Chem,2012.287(30):p.25086-97；以及He,Q.和X.Han,Cardiolipinremodeling in diabetic heart.Chem Phys Lipids,2014.179:p.75-81]。人心脏中最丰富的CL种类是四亚油酰基-CL(tetra[18：2]-CL)。在诸如糖尿病，局部缺血/再灌注和心衰之类的心脏病中，或者由于心磷脂重塑酶他扎平(TAZ；导致Barth综合征)的特定突变，tetra[18：2]-CL水平异常。在出生后的早期小鼠心脏中观察到特定的心磷脂成熟。发明人已经使用成熟范例来达到iPSC衍生的心肌细胞(CM)的成熟步骤，该步骤允许利用脂肪酸作为能源。确定了各种成熟范例，这些范例不仅可以模仿FAO的步骤，而且可以模仿出生后早期的心磷脂(CL)重构过程(图8)。使用靶向质谱脂质组学分析，野生型(WT)CM中的成熟显示出tetra[18：2]-CL的显著增加，类似于先前在体内心肌细胞出生后成熟期间观察到的发现。这些数据表明，可以在体外诱导心肌细胞中的CL成熟。此外，如产后早期体内发育所示，WT CM通过以[14：0]，[14：1]，[16：1]和[16：0]减少大多数CL和增加带有大于18个碳原子的酰基链的CL包括中间体[18：1][1 8：2][1 8：2][20：2](图8)来改变其CL概况。虽然这种CL成熟还没有达到成人CL重塑阶段，但观察到的产后成熟可以作为一种有用的测定法用于查询，目的是最终了解和操纵在正常和病理性突变体12-2l的情况下CM中CL成熟的第一步。使用靶向脂质组学，对补充有和没有FA的WT CM进行了分析。经FA处理的WT CM导致tetra[18：2]-CL显著增加(图7F)，类似于先前在体内心肌细胞出生后成熟期间观察到的发现[参见Kiebish,M.A.等,J Biol Chem,2012.287(30):p.25086-97；以及He,Q.和X.Han,Chem PhysLipids,2014.179:p.75-81,同上]。这些数据表明，可以在体外诱导心肌细胞中CL的成熟。然而，与WT FA处理的CM相比，FA处理后的HADHA KO CM不能增加tetra[18：2]-CL的量。此外，如产后体内发育所示，WT CM将其CL概况移至更成熟的CL概况，显示[16：1]的CL显著下降，而大于18个碳的CL则增加，包括中间体[18：1][18：2][18：2][20：2][参见，Kiebish，MA等，J Biol Chem，2012.287(30)：p.25086-97]。然而，HADHA KO CM不能像WT CM一样有效地重塑其CL概况(图7G)。这些数据令人惊讶地表明，除了其在长链FAO中的作用外，HADHA对于心肌细胞CL重塑过程也是必需的。
由于HADHA KO CM表现为CL重塑缺陷，因此接下来使用完整的脂质组学在WT、HADHA Mut和KO CM中对心磷脂种类进行更详细的分析。通过加强我们的靶向脂质组学结果，我们发现受到FA挑战的HADHA Mut和KO CM显示出较轻链CL的丰度增加和较重链CL的消耗(图7H)。三种CL种类，tetra[18：1]，[18：1][18：1][18：1][18：2]和[18：1][18：1][18：2][18：2]显著富集于HADHA Mut和KO CM中(图7H)。有趣的是，[18：1][l 8：1][l 8：2][l 8：2]CL在具有TAZ突变的Barth综合征患者中特别耗竭。
先前已经证明，HADHA蛋白具有与单糖基心磷脂酰转移酶(MLCL AT)类似的酶功能。MLCL AT主要将不饱和脂肪酰基链转移至溶血CL。因此，似乎合理的是，HADHA在重构心磷脂以在心肌细胞中产生成熟的tetra[18：2]–CL种类中具有直接作用。如果TAZ和HADHA并行作用以产生重构的CL，则它们都应同等地消耗MLCL池。当TAZ被敲除时，MLCL急剧增加，这表明TAZ直接使用MLCL生成成熟的CL。但是，在此处观察到，当对HADHA被敲除时，MLCL池中没有变化(未显示)。这提示HADHA不会重塑MLCL而是重塑CL。如果TAZ和HADHA平行作用，则每个KO均不应导致与特定CL中间体的逆累积关系。例如，TAZ KO导致[18：1][18：1][18：2][18：2]CL降低。然而，在当前的HADHA KO中，观察到相同种类的积累。因此，推测TAZ首先将MLCL重塑为CL的中间体，诸如[18：1][18：1][18：2][18：2]，然后HADHA继续将该CL种类重塑为tetra[18：2]-CL。
HADHA功能的丧失不会增大ALCAT1功能
为了更好地了解由于缺乏HADHA而导致的心磷脂概况如何变化，研究了哪些新的CL种类在HADHA Mut和KO CM中富集。具有饱和脂肪酸的脂肪酸酰基链(诸如14：0和16：0)的CL种类在HADHA Mut和KO CM中富集(图7I，J)。没有鉴定出具有18：0的CL酰基链。通常，已经从心磷脂合酶(CLS)合成具有多个饱和脂肪酸酰基链的新生CL(CLSat)(参见例如图7K)。在CLsat的重塑过程中，饱和脂肪酸酰基链被不饱和脂肪酸酰基链取代。这些数据提示在HADHA突变体中新生CLsat的积累。
接下来，我们检查了ALCAT1，将其作为HADHA Mut和KO CM用于CL重塑的一种方法。由于ALCAT1对脂肪酰基底物没有偏爱，因此它应利用存在的任何脂肪酰基CoA底物。ALCAT1活性的标志是掺入CL的多不饱和脂肪酸酰基链的增加。但是，当检查具有碳长度为20或更长的脂肪酸的酰基链的CL种类时，与WT CM相比，大多数HADHA Mut和KO CM实际上具有较少的种类(图7H)。此外，在任何组中，具有碳长度为20或更大的脂肪酸的多条酰基链的CL种类没有增加。因此，这些数据提示ALCAT1没有参与HADHA Mut和KO CM来补偿HADHA的损失。
讨论
这项研究涉及利用MiMaC成熟的hiPSC-CM在体外开发第一个人类MTP缺陷心脏模型，并导致发现长链FAO和CL重塑中的TFPα/HADHA缺陷会造成类似暗示心律失常状态的不稳定博动的疾病。此外，还证实了一种作用机制；由于HADHA的酰基辅酶A转移酶活性，其突变导致突出的磷脂心磷脂的异常成分。CL组成异常导致线粒体内嵴缺陷和线粒体质子梯度大大降低。这些线粒体缺陷表现为肌节溶解，钙处理和电生理缺陷。钙的储存和复极化延迟造成心肌细胞跳动模式不均匀，继而可加剧在MTP缺陷型SIDS新生儿中看到的组织水平心律失常。
使用多能干细胞衍生的心肌细胞进行MTP缺乏症的研究，需要产生一种工具，该工具可以在体外快速有效地使心肌细胞成熟到呈现出生后心脏FAO疾病的阶段。已经产生了许多使hPSC-CM成熟的工具，包括：电和/或机械刺激，细胞微环境和培养时间。但是，这些方法均未直接影响允许分析FA代谢的成熟方面。在研究了Let-7在hPSC-CM成熟中的作用的发明人的初步工作基础上，开发了一种能够成熟hPSC-CM大小，收缩力和新陈代谢的microRNA成熟鸡尾酒混合物(MiMaC)。MiMaC方便了hPSC-CMs中MTP缺乏的研究，并且是可用于成熟hPSC-CM用于研究FAO紊乱的有效工具。此外，MiMaC系统用于更好地了解后期开发，成熟过程。重要的是，发现了常见的microRNA靶标HOPX作为心肌细胞成熟的新的关键调节因子。
先前的研究表明，当心肌细胞从胎儿发育到成年阶段代谢重塑时，代谢基因表达增加。OXPHOS基因表达的增加可能表明线粒体拷贝数增加或更成熟的线粒体的生物合成，或两者都有。这些scRNA-seq研究发现了一个新颖的、中间的心肌细胞亚群，对于OXHPOS和Myc靶标具有高代谢基因表达。这些数据提示从胎儿样CM到更成熟CM的可能中间阶段，其需要OXPHOS基因的瞬时上调。由于帕金(Parkin)在此阶段也被上调，因此这些数据支持以下假设：胎儿阶段线粒体的质控型线粒体自噬和成熟线粒体的生物合成发生在MiMaC诱导的心肌成熟中。这类似于先前显示的围产期小鼠心脏发育期间经由帕金蛋白的线粒体自噬介导的应答。重要的是，在病理状态发展之前，在MTP/HADHA突变型心肌细胞中也观察到成熟的中间阶段。对这一阶段的进一步解剖将使人们对正常和疾病状态下该过程的调节有机制上的了解。
我们使用多能干细胞衍生的心肌细胞搜索了在具有HADHA突变(引起MTP缺乏)的患者中观察到的心律不齐的病因。重要的是，hiPSC衍生的HADHA突变型心肌细胞概括了在患者中观察到的心律失常表型，强调了hiPSC-CM在建模人类疾病中的实用性。为了更好地了解心律不齐的原因，使用脂肪酸挑战的HADHA心肌细胞评估表型，并鉴定疾病进展的潜在线索心磷脂。一种挽救部分HADHA突变表型的新颖治疗干预是SS-31。SS-31是一种已显示可结合心磷脂并在压力(例如过氧化)下防止心磷脂构象变化的线粒体靶向肽[Birk,A.V.等,The mitochondrial-targeted compound SS-31re-energizes ischemic mitochondriaby interacting with cardiolipin.J Am Soc Nephrol,2013.24(8):p.1250-61]。已显示SS-31抑制心肌细胞和胰岛的线粒体去极化和肿胀，并挽救心肌细胞中的心磷脂缺陷。由于在这项研究中发现SS-31挽救了线粒体病理的一个方面，即增加了质子泄漏，并且由于在HADHA Mut CM中观察到了异常的CL种类，因此提出了心磷脂缺陷会导致观察到的线粒体功能障碍。
心磷脂是线粒体内膜的重要组分。CL是由四个(而不是两个)与甘油部分连接的酰基链构成的非典型磷脂。心磷脂的这种非典型结构导致圆锥形，据认为这对于内部线粒体膜的结构和功能至关重要。特别地，心磷脂已显示出在组织对ETC活性重要的电子传输链(ETC)高阶结构中起作用，并充当线粒体内膜外小叶上的质子陷阱。因此，CL的成熟形式的减少导致诸如质子梯度损失、ETC降低等线粒体异常，从而导致ATP生成降低和线粒体结构异常。
CL的病理重塑牵涉糖尿病、心衰、神经变性和衰老中观察到的线粒体功能障碍。但是，在HADHA Mut和KO CM案例中，异常CL种类的模式和组成比以前在心力衰竭或糖尿病中看到的更为特异性，这表明HADHA可能直接涉及CL加工。有趣的是，以前使用HeLa细胞进行的研究提示HADHA在MLCL上展现酰基辅酶A转移酶活性，因其重塑为心磷脂。因此，这些数据提示HADHA中的缺陷直接引起导致无法生成并可能维持成熟心磷脂的酰基链组成的心磷脂重构受损。但是，这种酰基转移酶对生理性CL重塑的确切贡献尚不清楚。现在据此报道，在所述FA挑战的人HADHA Mut和KO心肌细胞中，成熟的tetra[18：2]-CL减少，线粒体活性受损。这与先前在导致Barth综合征(一种X连锁的心脏和骨骼肌线粒体肌病)的TAZ突变体中看到的发现相似。这些数据首次确立了HADHA酰基转移酶对人心肌细胞中生理CL重塑的确切贡献。
TAZ是一种对于将MLCL重塑为成熟的心磷脂至关重要的转酰化酶。HADHA和TAZ二者均在生成成熟心磷脂中起关键作用，并且两种疾病具有相似的病理表型，包括由于室性心律失常而导致的不明原因猝死。在TAZ突变体中特异性丰度降低的心磷脂种类[18：1][18：1][18：2][18：2]在所述HAHDA Mut和KO CM中显示出增加的丰度。此外，在HADHA Mut和KO CM中没有观察到MLCL的积累，这通常在TAZ中有突变时发生。这些数据表明，CL重塑是首先由TAZ处理，然后由HADHA处理以在人心肌细胞中生成tetra[18：2]-CL的结果(图7K)。
HADHA中的突变显然导致CM不能生成大量的tetra[18：2]-CL。从文献中也很清楚，一旦tetra[18：2]–CL种类开始耗尽，CM可陷入线粒体紊乱的病理状态。关于本发现的有趣之处在于，只要HAADHA Mut和KO CM不受到FA的挑战，即使它们具有较少的tetra[18：2]-CL，它们也不进入疾病状态。在此还证明，将FA添加到HADHA Mut和KO CM确实导致长链FA积累。但是，这种FA积累不会导致线粒体肿胀和最终破裂。取而代之的是，发现HADHA突变体中的线粒体塌陷已经变圆了。这些数据表明，仅靠FAO的表型可能无法解释在HADHA Mut和KOCM中观察到的缺陷，而且，CL重塑在CM成熟过程中尤其重要。
当在CM中检查全部CL种类时，很明显，通过在CM成熟期间将CL侧链正确重塑为[18：2]，HADHA Mut和KO CM无法获得成熟的CL概况。此外，20个碳的或更大的长碳基团未在CL中多次强行掺入，表明ALCAT1没有补偿。显而易见的是，在CL中存在饱和的FA侧链14：0和16：0。可能是在具有饱和侧链的HADHA Mut和KO中CL种类的积累导致线粒体结构的崩溃和随后的心脏病理。因此，这些数据提示在CM成熟期间HADHA酶的突变导致未成熟的CL饱和种类的过度积累，这可能是造成HADHA CM中观察到的线粒体缺陷和病理的原因(图7K)。
在此证实了长链脂肪酸，在产后和成年CM中用于产生能量和磷脂的正常底物，会促使CM中的MTP缺乏的病理，从而导致心磷脂模式异常，造成严重的线粒体缺陷和钙异常，在HADHA Mut CM中诱使CM处于不稳定的跳动。将SS-31鉴定为一种新的疗法，可以挽救FA挑战的HADHA Mut CM的质子泄漏表型。这表明SS-31或其他影响心磷脂的化合物可用作潜在疗法，用于缓解MTP缺乏症中的线粒体功能障碍方面。
实施例
阐述以下方法以便向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用所公开的发明的实施方案的完整公开和描述，并且无意于限制发明人认为是其发明范围的范围，也不旨在表示以下实验是全部或仅有的被实施的实验。
方法
hESC和hiPSC与心脏分化
hESC系RUES2(NIHhESC-09-0013)和hiPSC系WTC#11，先前是在Conklin实验室中衍生的[Kreitzer,F.R.等,A robust method to derive functional neural crest cellsfrom human pluripotent stem cells.Am J Stem Cells,2013.2(2):p.119-31]，在mTeSR培养基(StemCell Technologies)中于Matrigel生长因子降低的基底膜基质(Corning)上培养。遵循基于单层的定向分化方案以产生hESC-CM和hiPSC-CM，如先前所进行的[Palpant,N.J.等,Generating high-purity cardiac and endothelial derivativesfrom patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.Nat Protoc,2017.12(1):第15-31页]。用基于小分子单层的定向分化方案完成hiPSC-CM心磷脂测定法，如先前所做的[[Palpant,N.J.等,Generating high-purity cardiac and endothelialderivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.NatProtoc,2017.12(1):p.15-31]。分化后15天，使用乳酸选择过程对hPSC-CM富集心肌细胞群[Palpant,N.J.等,Generating high-purity cardiac and endothelial derivativesfrom patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.Nat Protoc,2017.12(1):p.15-31]。产生的心肌细胞群为40-60％，然后在乳酸富集4天后富集至75-80％的心肌细胞。
HADHA系建立
使用LentiCrisprV2质粒[Palpant,N.J.等,Generating high-purity cardiacand endothelial derivatives from patternedmesoderm using human pluripotentstem cells.Nat Protoc,2017.12(1):p.15-31](Addgene质粒#52961)使用CRISPRScan设计了靶向HADHA外显子1的两种不同的gRNA[Palpant,N.J.等,Generating high-puritycardiac and endothelial derivatives from patternedmesoderm using humanpluripotent stem cells.Nat Protoc,2017.12(1):p.15-31]。gRNA的序列见表1。使用GeneJuice(EMD Millipore)将表达gRNA和Cas9的质粒瞬时转染入WTC品系中。转染后24小时，对WTC进行嘌呤霉素选择两天，然后克隆扩增。分离克隆的DNA，PCR扩增靶向引导序列周围的区域(参见表1中的引导序列)并测序以确定CRISPR-Cas9系统在HADHA的外显子1中产生的***和缺失错误。进行Western分析以确定HADHA突变体中HADHA蛋白的水平。从gRNAl实验发送了31个克隆进行测序，其中6个克隆(19％)没有突变，而25个克隆(81％)被发现有突变。从gRNA2发送了24个克隆进行测序，其中1个克隆无突变(4％)，而23个克隆(96％)被发现具有突变。在这项研究中进一步分析突变品系中的两个。
表1：LentiCRISPRV2的gRNA(括号中为SEQ ID NOS)
CRISPR脱靶
使用Crispr-RGEN的Cas-OFFinder工具鉴定HADHA gRNA的潜在脱靶[Bae,S.,J.Park和J.S.Kim,Cas-OFFinder:a fast and versatile algorithm that searches forpotential off-target sites of Cas9RNA-guided endonucleases.Bioinformatics,2014.30(10):p.1473-5]。然后通过GoTaq PCR扩增最高的预测脱靶并测序。脱靶分析引物可在表2中找到。
表2：用于脱靶分析的引物(括号中为SEQ ID NOS)
RNA提取和qPCR分析
使用Trizol从细胞中提取RNA，并使用7300实时PCR系统(Applied Biosystems)通过SYBR green qPCR分析。表3列出了使用的引物。使用delta-delta Ct方法计算所有qPCR实验的线性表达值。
表3：用于人类基因的定量RT-qPCR引物(括号中为SEQ ID NOS)
蛋白质提取和western印迹分析
用含有20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，15％甘油，1％Triton X-100、1Mβ-甘油磷酸，0.5M NaF，0.1M焦磷酸钠，正钒酸盐，PMSF和2％SDS的裂解缓冲液将细胞直接在平板上裂解[Moody,J.D.,等,First critical repressive H3K27me3 marks in embryonicstem cells identified using designed protein inhibitor.Proc Natl Acad Sci U SA,2017]。在使用前，将25U Benzonase核酸酶(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)添加到裂解缓冲液中。通过Bradford测定法(Bio-Rad)，使用BSA(牛血清白蛋白)作为标准品，使用EnWallac Vision进行蛋白质定量。将蛋白质样品与4x Laemmli样品缓冲液合并，加热(95℃，5分钟)，并在SDS-PAGE(Protean TGX预制4％-20％梯度凝胶，Bio-Rad)上运行，然后通过半干转移(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)。将膜用5％牛奶封闭1小时，并在4℃下于一抗中孵育过夜。然后将膜与二抗(1：10000，山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG HRP缀合物(Bio-Rad)孵育1小时，使用固定化鲁米诺(immobilon-luminol)试剂测定法(EMDMillipore)进行检测。一抗如下：α微管蛋白抗体Cell Signaling Technologies(2144)1：2000，β微管蛋白Promega(G7121)抗小鼠1：4000，β肌动蛋白Cell Signaling Technologies(4970)1：4000，HADHA Abeam(ab54477抗兔1：1000，UCP3 Abcam(ab3477)抗兔1：200，SLC25A4(ANT1)Sigma(SAB2105530)抗兔1：1000，OXPHOS MitoSciences(MS604/G2830)抗小鼠1：1000，抗GFP Invitrogen(A-11122)抗兔1：1000。
microRNA过表达和敲除
LentiCrisprV2质粒(Addgene 52961)用于敲除(KO)microRNA-141，-200a，-205和-122。选择每个miR的gRNA，分别测试其与成熟microRNA相邻或位于成熟microRNA种子区中的前间隔子相邻基序(PAM)NGG切割位点。gRNA可在表1中找到。通过TaqMan RT-qPCR用特异于每种代表性miR的成熟形式的探针评估每种miR的总体减少。
将pLKO.1TRC载体(pLKO.1-TRC克隆载体(Addgene质粒#10878)用于过表达(OE)microRNA[Moffat,J.等,A lentiviral RNAi library for human and mouse genesapplied to an arrayed viral high-content screen.Cell,2006.124(6):p.1283-98]。扩增并纯化了成熟microRNA上游和下游200bp的基因组序列。表4中列出了每种microRNA的引物。扩增子克隆在pLKO.1TRC载体的Agel和EcoRI位点之间，处于人U6启动子下。
表4：用于microRNA区基因组扩增的引物(SEQ ID NOS在括号中)
病毒生产
转染前一天将HEK 293FT细胞铺板。转染当天，在1μg/μL聚乙烯亚胺(PEI)每1μgDNA存在的情况下将所选的OE或KO质粒与包装载体psPAX2(psPAX2由Didier TronoAddgene惠赠，质粒#12260)和pMD2.G(pMD2.G由Didier TronoAddgene惠赠，质粒#12259)组合。24小时后更换培养基，转染后48和72小时收获慢病毒。使用PEG-it(System Biosciences，Inc)浓缩病毒颗粒。
hiPSC-CM转导和选择
在诱导后第14天，在溴化己二甲铵(美溴铵，6μg/ml)的存在下转导hiPSC-CM。应用慢病毒17-24小时，然后将其去除。将细胞再培养两周。使用乳酸选择获得富集的心肌细胞群[Tohyama,S.等,Distinct metabolic flow enables large-scale purification ofmouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.Cell Stem Cell,2013.12(1):p.127-37]。使用嘌呤霉素选择来选择已阳性掺入载体的细胞。培养两周后，收获细胞用于终点分析。对于MiMaC组，同时用较低剂量的四种不同的慢病毒转导hiPSC-CM，而对照则是用两种对照载体：pLKO.1和LentiCRISPRv2空载体转导的。
免疫细胞化学和形态学分析
将细胞固定在4％(vol/vol)多聚甲醛中，用5％(vol/vol)正常山羊血清(NGS)封闭1小时，并与1％NGS中的一抗孵育过夜，然后在NGS中进行二抗染色。CM面积的测量是使用Image J软件进行的。使用Image J软件并按照先前发表的关于共定位定量的方法进行线粒体追踪物强度的定量[Li,Q.等,A syntaxin 1,Galpha(o),and N-type calciumchannelcomplex at a presynaptic nerve terminal:analysis by quantitativeimmunocolocalization.J Neurosci,2004.24(16):p.4070-81]。在Leica TCS-SPE共聚焦显微镜上使用40x或63x物镜和Leica软件进行了分析。使用的一抗是：α辅肌动蛋白1：250Sigma A7811抗小鼠，HADHA 1：250abcam ab54477抗兔，ATP合酶β1：250abcam ab 14730抗小鼠，Titin 1：300Myomedix TTN-9(cTerm)抗-兔，GFP 1：300Invitrogen A-11122抗兔。使用的二抗和其他试剂是：浓度为0.02μg/mL的DAPI，鬼笔环肽alexafluor 568 1：250，alexafluor 488或647缀合的山羊抗小鼠和抗兔二抗1：500(Molecular Probes)。在含有B27和胰岛素补充剂的RPMI中以300nM的最终浓度使用MitotrackerCMTMRos Life技术(M7510)，在固定之前与细胞孵育45分钟。
微电极阵列
使用AxIS软件(Axion Biosystems)收集自发跳动的心肌细胞的电生理记录2分钟。收集原始数据后，使用Butterworth带通滤波器和90μV尖峰检测阈值对信号进行滤波。使用多项式拟合T波检测算法自动确定场势持续时间。
微柱(收缩力和搏动率)
如先前所述制造了聚二甲基硅氧烷(PDMS)微柱阵列[Beussman,K.M.等,Micropost arrays for measuring stem cell-derived cardiomyocytecontractility.Methods,2016.94:p.43-50]。用小鼠层粘连蛋白(Life Technologies)涂覆微柱的尖端，并在含B27补充剂和10％胎牛血清的RPMI培养基中以约75,000每cm2的密度将细胞接种到
海马测定法
如先前所述，使用Seahorse XF96细胞外通量分析仪评估线粒体功能[Kuppusamy,K.T.等,Let-7family of microRNA is required for maturation and adult-likemetabolism in stem cell-derived cardiomyocytes.Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2015]。用1:60稀释的Matrigel还原生长因子(Corning)预处理平板。分化后约28天，将心肌细胞以50,000个细胞每XF96孔的密度接种到平板上。接种到XF96孔板上3天后进行海马分析。测定前一小时，将培养基更换为补充丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen，1mM)和25mM葡萄糖(用于MitoStress测定)，25mM葡萄糖和0.5mM肉碱(用于棕榈酸盐/酯测定)的基础培养基(未缓冲的DMEM；Seahorse XF测定培养基)。在测量期间应用底物和抑制剂的注射以达到终浓度1μM的4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP；Seahorse Biosciences)，寡霉素(2.5μM)，抗霉素(2.5μM)和鱼藤酮(2.5μM)以进行MitoStress分析；200mM棕榈酸盐/酯或33μM BSA，以及50μM依托莫昔(ETO)用于棕榈酸盐/酯测定。将OCR值进一步标准化为每个孔中存在的细胞数量，通过在355nm激发和460nm发射下使用荧光测量的Hoechst染色(Hoechst 33342；Sigma-Aldrich)定量。最大OCR定义为与添加寡霉素后的OCR相比，响应于FCCP的OCR的变化。ATP的产生被计算为基础呼吸和寡霉素后呼吸之间的差异。质子泄漏计算为寡霉素后与抗霉素和鱼藤酮后的呼吸之间的差异。细胞利用棕榈酸盐/酯作为能源的能力计算为第二次添加棕榈酸盐/酯之后的平均OCR与第二次添加棕榈酸酯之前的最终呼吸值之间的差异。除非另有说明，否则这些试剂来自Sigma。
RNA测序
收获第30天的hiPSC-CM用于RNA制备和全基因组RNA-seq(读数超过2000万)。使用2.0.13版的Tophat比对RNA-seq样品与hg19[Trapnell,C.,L.Pachter,和S.L.Salzberg,TopHat:discovering splice junctions with RNA-Seq.Bioinformatics,2009.25(9):p.1105-11]。使用Ensembl GRCh37基因注释使用htseq-计数[Anders,S.,P.T.Pyl和W.Huber,HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencingdata.Bioinformatics,2015.31(2):p.166-9]量化基因水平读取计数。使用DESeq[Anders,S.和W.Huber,Differential expression analysis for sequence count data.GenomeBiol,2010.11(10):p.R106]将每个二元比较中RNA-seq样品中总表达高于1的标准化读数计数的基因保留下来进行差异分析。来自R的Princomp函数用于主成分分析。将TopGO R软件包[Alexa,A.,J.Rahnenfuhrer,和T.Lengauer,Improved scoring of functionalgroups from gene expression data by decorrelating GO graphstructure.Bioinformatics,2006.22(13):p.1600-7]用于基因本体论富集分析。为了评估miR扰动对心脏成熟途径的影响，将每种情况与其空载体(EV)进行比较，并鉴定出上调的基因(>1.5倍变化)和下调的基因(<-1.5倍变化)。对上调和下调的基因分开进行高几何测试以针对一组有益于心脏成熟的精选途径富集，从而产生了m by n矩阵，其中m是途径数(m＝7)，n是条件数(n＝6，包括EV)。计算出上调和下调基因的富集p值之比的负log10，以代表治疗的总体净“收益”：正值大(>0)意味着治疗导致上调更多心脏成熟途径中的基因上调比这些基因的下调更多，而更多的负值意味着治疗导致心脏成熟途径中的基因更多的下调。
单细胞RNA测序
原始单细胞RNA-seq数据通过10X Genomics的CellRanger管道进行处理。使用Seurat R软件包进一步分析CellRanger管道的输出[Satija,R.等,Spatialreconstruction of single-cell gene expression data.Nat Biotechnol,2015.33(5):p.495-502]。除去了具有超过40％的读数定位到线粒体基因，少于200个检测基因或少于2000个独特分子标识符(UMI)的细胞。剩余的细胞按UMI的数目和映射到线粒体基因的百分比缩放。用于成熟单细胞RNA-seq数据的tSNE分析的参数为前2905个可变基因，前10个主要成分，分辨率为0.5。用于HADHA突变体单细胞RNA-seq数据的tSNE分析的参数是前3375个可变基因，前10个主要成分和分辨率0.4。使用来自Kowalczyk等人[Kowalczyk,M.S.等,Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiationprograms upon aging of hematopoietic stem cells.Genome Res,2015.25(12):p.1860-72]的细胞周期基因和Seurat软件包中的细胞周期评分函数评估细胞周期对聚簇的影响。在任一簇中至少25％的细胞中检测到且错误发现率<0.1的基因被定义为差异表达。针对在热图中绘制的所有细胞中每个基因的表达值进行标准化(即Z评分)。人体内成熟标志是基于“路线图表观基因组学计划”中与胎儿心脏相比成年心脏中上调的基因[Roadmap Epigenomics,C.等,Integrative analysis of 111reference humanepigenomes.Nature,2015.518(7539):p.317-30]。小鼠体内成熟标志基于来自DeLaughter等人的体内心肌细胞单细胞RNA-seq数据上调的基因[DeLaughter,D.M.等,Single-CellResolution of Temporal Gene Expression during Heart Development.Dev Cell,2016.39(4):p.480-490]。使用DESeq选择了成人心脏中显著高于胎儿的基因(成人中高2倍，FDR<0.05)。然后，我们将这些基因与每个scRNA-seq簇中前30个最高度表达的基因相交，以获得最终基因列表用于图3O中的热图。使用TopGO软件包[Alexa,A.,J.Rahnenfuhrer,和T.Lengauer,Improved scoring of functional groups from geneexpression data by decorrelating GO graph structure.Bioinformatics,2006.22(13):p.1600-7]进行基因本体的富集。
钙瞬态分析法
将心肌细胞铺在Matrigel包被的圆形玻璃盖玻片上。将心肌细胞与1mM Fluo-4AM(Life Technologies，F14201)在Tyrode缓冲液(1.8mM CaCl2，1mM MgCl2、5.4mM KCl，140mM NaCl，0.33mM NaH2P04、10mM HEPES，5mM葡萄糖，pH值至7.4)中于37℃孵育25分钟。然后将底物转移到装有新鲜的预热Tyrode缓冲液的60mm培养皿(Petri dish)中用于成像。使用安装在Nikon Eclipse Ti立式显微镜上的Hamamatsu ORCA-Flash2.8 Scientific CMOS相机对样品成像。使用40倍水浸物镜以每秒至少20帧的帧率拍摄视频。调节荧光强度以确保在去极化过程中充分捕获荧光变化而不会变白，并且所有实验均使用相同的荧光强度。用碳电极(Ladd Research，30250)以0.5Hz或1Hz频率以5V/cm对心肌细胞进行双相刺激，并且在每个视频中捕获至少5次搏动进行分析。
视频使用自定义的MATLAB代码进行分析；获得钙瞬变，找到细胞边界并平均每个视频帧边界内的荧光。自动为每个视频帧确定背景荧光，并从钙瞬变中减去。然后分析钙瞬变以找到峰值荧光(F)，基线荧光(F0)，达到峰值的时间(Tpeak)以及达到50％和90％弛豫的时间(T50R，T90R)。通过将各自的荧光变化除以各自的时间来计算达到峰值，50％和90％弛豫的速率(Rpeak，R50R，R90R)。将指数衰减函数(e-t/τ)拟合到10％和90％松弛之间的松弛，以确定松弛系数τ。所有这些测量均在每个视频中至少获得4个搏动，并取平均值进行比较。
透射电镜(TEM)
将细胞固定在二甲胂酸鈉缓冲液中的4％戊二醛中，柱固定在四氧化锇中，在1％的乙酸铀酰中进行整体染色，通过一系列乙醇脱水，并包埋在Epon Araldite中。在LeicaEM ETC7超薄切片机上切割70nm切片，并在JEOL 1230TEM上观察。
葡萄糖和脂肪酸培养基
基本培养基(我们称为葡萄糖培养基)是补充有B27和胰岛素的RPMI。脂肪酸培养基是葡萄糖培养基，其中具有与BSA缀合的油酸(Sigma O3008)：12.7μg/mL，与BSA缀合的亚油酸(Sigma L9530)：7.05μg/mL，与BSA缀合的棕榈酸钠(Sigma P9767)(Sigma A8806)：52.5μM，L-卡尼汀(carnitine)：125μM。
Elamipretide(SS-31)
SS-31来自Stealth BioTherapeutics，溶解在PBS中。实验中使用的终浓度为1nM。
箱形图
每个箱形图中的“x”表示平均值，水平条表示中位数，未显示离群值。*表示P＜0.05。
条形图
条形图显示平均值±SEM。不显示SEM的条形图是从对一两个样品进行了测序的RNA测序数据生成的。
STRING分析
使用10.5版STRING生成蛋白质关联图。在每个图中，彼此连接的基因彼此关联。有三种作用效果：箭头->正面的，--|-负面的，末端带有圆圈的线-未指定。线条颜色还表示了八种不同的作用类型：绿色-激活，蓝色-结合，青色-表型，黑色-反应，红色-抑制，紫色-催化，粉色-翻译后修饰和黄色-转录调控。Kmeans聚簇被用于识别由于MiMaC而导致的显著改变的基因，关于：肌肉结构发育和细胞外基质组织。马尔可夫聚类算法(MCL)用于鉴定MiMaC已下调以控制细胞***的基因。
统计分析
用N等于或大于3的实验进行统计分析。使用学生t检验或单向方差分析计算P值。对于学生t检验，进行了Shapiro-Wilk正态性检验。对于单向方差分析，进行了Kolmogorov-Smirnov正态性检验。为了进行多次比较，使用了Holm-Sidak方法。对于未通过正态性检验的单因素方差分析，进行了等级差异的Kruskal-Wallis单因素方差分析。为了进行多次比较，使用了Dunn方法。所有统计检验均使用α＝0.05。
使用LC-MS/MS进行靶向心磷脂分析
使用Glc+FA培养基处理12D的野生型(WT)hiPSC-CM和Glc+FA培养基处理6D和12D的HADHA Mut hiPSC-CM。临提取之前，将每个细胞团粒溶于40μL DMSO中，并通过超声处理破坏细胞膜。使用由20秒开启、10秒关闭组成的3个循环对细胞进行超声处理。在超声处理过程中要注意将细胞保持在冰上。摇动后，将悬浮液转移到2mL玻璃LC小瓶中。
对于心磷脂提取，制备由20mL氯仿/甲醇混合物(2：1v/v)和30μL内标准溶液(5mgPC(18：0/18：1(9Z))(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL)组成的提取混合物。接下来，将600μL的提取混合物添加至样品中，然后涡旋并在-20℃温育20分钟。然后将样品在冰浴中超声处理15分钟。加入纯水(100μL)，并将样品在室温下摇动30分钟。在4℃下以12,000xg离心10分钟后，将底部相转移至新的玻璃LC小瓶中并在真空下干燥。然后通过加入150μL乙腈/异丙醇/H2O(65∶30∶5，v/v/v)来重构残余物，并在4℃以20,000g离心10分钟。将上清液转移至各个玻璃小瓶中用于MS分析。所有样品均为n＝3。
为了进行有针对性的心磷脂测量，将每个制备的样品2μL注入6410AgilentTriple Quad LC-MS/MS系统中，以使用电喷雾电离源和负电离模式进行分析。在Agilent300SB-C8 RRHD色谱柱(1.8μm，2.1x50mm)上完成色谱分离。流动相A为在乙腈/H2O中的10mM乙酸铵(6：4，v/v)，流动相B为在异丙醇/乙腈/H2O(90：10：1，v/v/v)中的10mM乙酸铵。在12分钟的分离过程中，流动相的组成从60％A变为1％A，然后迅速增加至60％A并进行平衡以准备下一次进样。每次注射的总实验时间为20分钟。流速为0.26mL/min，自动进样器温度为4℃，柱温箱温度设置为55℃。使用多反应监测(MRM)模式获取靶向MS/MS数据。QQQ B.07.00(Agilent)的MassHunter工作站软件定量分析用于积分提取的MRM峰。
非靶向脂质组学分析
用225μl甲醇在-20℃下提取一百万个细胞，其中包含RE(17：0/17：0)，PG(17：0/17：0)，PC(17：0/0：0)，C17鞘氨醇，神经酰胺(d18：1/17：0)，SM(d18：0/17：0)，棕榈酸-d3，PC(12：0/13：0)，胆固醇-d7，TG(17：0/17：1/17：0)-d5，DG(12：0/12：0/0：0)，DG(18：1/2：0/0：0)，MG(17：0/0：0/0：0)，PE(17：1/0：0)，LPC(17：0)，LPE(17：1)和于-20℃含有内标胆固醇酯22：1的750μL MTBE(甲基叔丁基醚)(Sigma Aldrich)。将细胞涡旋20秒，超声处理5分钟，并在4℃下用轨道混合冷却/加热板(Torrey Pines Scientific Instruments)振荡6分钟。然后加入188μl的LC-MS级水(Fisher)。将样品涡旋，以14,000rcf(Eppendorf 5415D)离心。以两份350μL的等分试样收集上层(非极性的有机层)相并蒸发至干。将一份有机相等分试样重悬于含50ng/mL CUDA((12-[[((环己基氨基)羰基]氨基]-十二烷酸)(Cayman Chemical)的100μL甲醇：甲苯(9：1，v/v)混合物中。然后将样品涡旋，超声处理5分钟，并在16,000rcf下离心，准备进行脂质组分析。包括方法空白和合并的人血浆(BioreclamationIVT)作为质量控制样品。WT FA CM，HADHA Mut 12D FA为n＝2，HADHA KO CM为n＝3和HADHA Mut 6D FA为n＝2，6次技术上重复。
用于脂质组学RPLC-QTOF分析的色谱和质谱条件
将重悬样品对于ESI阳性和阴性模式分别以3μL和5μL注射到Waters AcquityUPLC CSH C18(100mm长x 2.1mm内径；粒径1.7μm)上，另有一个维持在65℃的WatersAcquityVanGuard CSH C18预装柱(内径5mm x 2.1mm；粒径1.7μm)与Vanquish UHPLC系统偶联。为了提高脂质覆盖率，将不同的流动相修饰剂用于阳性模式和阴性模式分析[Cajka,T.和O.Fiehn,Increasing lipidomic coverage by selecting optimal mobile-phasemodifiers in LC–MS of blood plasma.Metabolomics,2016.12(2):p.34]。对于阳性模式，使用10mM甲酸铵和0.1％甲酸，对于阴性模式，使用10mM乙酸铵(Sigma-Aldrich)。阳性模式和阴性模式二者都使用相同的流动相组成：(A)60:40v/v乙腈：水(LC-MS级)和(B)90:10v/v异丙醇：乙腈。梯度开始在0分钟以15％(B)，0-2分钟30％(B)，2-2.5分钟48％(B)，2.5-11分钟82％(B)，11-11.5分钟99％(B)，11.5-12分钟99％(B)，12-12.1分钟15％(B)和12.1-15分钟15％(B)。使用0.6mL/min的流速。为了进行数据采集，使用了Q-Exactive HFHybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪，其参数如下：质量范围m/z 100-1200；MS1分辨率为60,000：数据依赖性MS2分辨率为15,000；NCE 20、30、40；4个目标/MS1扫描；气体温度369℃，鞘气流(氮气)，60单位，辅助气流25单位，吹扫气流2单位；喷射电压3.59kV。
使用MS-DIAL和统计学进行LC-MS数据处理
使用MS-DIAL[Tsugawa,H.等,MS-DIAL:data-independent MS/MS deconvolutionfor comprehensive metabolome analysis.Nat Methods,2015.12(6):p.523-6]进行非靶向脂质组学数据处理，用于解卷积、峰拾取、对齐和识别。除了msp格式的MS/MS光谱数据库外，还使用了内部m/z和保留时间文库[Kind,T.等,LipidBlast in silico tandem massspectrometry database for lipid identification.Nat Methods,2013.10(8):p.755-8]。当每组中至少有50％样本中存在时报道特征。首先通过使用已知的总和将数据标准化或mTIC标准化进行统计分析，以缩放每个样本。然后将标准化的峰高提交给R进行统计分析。通过FDR校正和事后检测进行方差分析。
示例性实施例
仅出于说明的目的，本公开涵盖的示例性实施例的非限制性列表包括：
A1.一种诱导心肌细胞成熟的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下两种或多种：Let7i microRNA(miRNA)的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。
A2.实施方案A1的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下三种或更多种：Let7i miRNA的过表达，miR-452的过表达，miR-1222的降低表达和miR-200a的降低表达。
A3.实施方案A1或A2的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导Let7i miRNA的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。
A4.实施方案A1-A3之一的方法，其中诱导过表达包括使未成熟的心肌细胞与包含编码待过表达的miRNA的核酸的载体接触。
A5.实施方案A4的方法，其中所述载体被配置为促进编码待过表达的miRNA的核酸的瞬时表达。
A6.实施方案A4或A5的方法，其中所述载体是病毒载体，其被配置为将编码待过表达的miRNA的核酸整合入未成熟心肌细胞的基因组中。
A7.实施方案A4-A6之一的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或腺伴随病毒载体。
A8.实施方案A1-A7之一的方法，其中诱导miRNA的降低表达包括使未成熟的心肌细胞与和被靶向进行降低表达的miRNA杂交的核酸片段接触，或与包含编码与被靶向进行降低表达的miRNA杂交的转录物的核酸的载体接触。
A9.实施方案A1-A8之一的方法，其中诱导降低表达包括实施编码所述miRNA的基因的敲除。
A10.实施方案A1-A9之一的方法，其中诱导降低表达包括向未成熟的心肌细胞提供核酸酶和引导核酸，该引导核酸具有促进所述核酸酶对编码被靶向进行降低表达的所述miRNA的核酸进行特异性切割的序列。
A11.实施方案A1-A10之一的方法，其中向所述未成熟的心肌细胞提供核酸酶包括使所述未成熟的心肌细胞与所述核酸酶或编码所述核酸酶的载体接触，其中所述载体被配置为促进所述酶在心肌细胞中的表达。
A12.实施方案A10的方法，其中为未成熟的心肌细胞提供引导核酸包括使所述未成熟的心肌细胞与该引导核酸或编码该引导核酸的载体接触，其中所述载体被配置为促进该引导核酸在心肌细胞中的表达。
A13.实施方案A10或A11的方法，其中所述核酸酶是核酸内切酶，诸如Cas9或TALENS。
A14.实施方案A8-A12之一的方法，其中该载体是病毒载体。
A15.实施方案A14的方法，其中该病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒载体。
A16.实施方案A1-A15之一的方法，其中该未成熟的心肌细胞衍生自干细胞。
A17.实施方案A1-A16之一的方法，其中该未成熟的心肌细胞在体外衍生自干细胞。
A18.实施方案A16或A17的方法，其中该干细胞是胚胎干细胞、多能干细胞或诱导的多能干细胞。
A19.实施方案A1-A18之一的方法，进一步包括使该未成熟的心肌细胞与选自棕榈酸、油酸和亚油酸的两种或更多种长链脂肪酸接触。
A20.实施方案A19的方法，其中所述一种或多种长链脂肪酸包括棕榈酸酯、油酸和亚油酸。
A21.实施方案A1-A20之一的方法，其中该心肌细胞包括遗传畸变。
A22.实施方案A21的方法，其中所述遗传畸变与心脏中的代谢或病理疾病状态相关。
A23.实施方案A22的方法，其中所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。
A24.实施方案A22或A23的方法，其中该心肌细胞在编码下述之一的基因中包含突变：HADHA,FATP1,FACS1,OCTN2,L-CPTI,M-CPT I,CAT,CPT II,VLCAD,LCAD,MCAD,SCAD,LCHAD,SHYD,M/SCHAD,SKAT,MKAT,HS,HL,ETF,和ETF QO。
B1.通过实施方案A1-A24之一中所述的任何方法产生的心肌细胞。
B2.实施方案B1的心肌细胞，其中所述心肌细胞包含遗传畸变。
B3.实施方案B2的心肌细胞，其中所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。
B4.实施方案B3的心肌细胞，其中所述遗传畸变是编码HADHA的基因中的突变。
C1.一种治疗患有通过施用具有成熟心磷脂概况的心肌细胞能够治疗的病症的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的实施方案B1中所述的心肌细胞。
C2.实施方案C1的方法，其中所述受试者具有受损的心脏组织或细胞。
C2.实施方案C1或C2的方法，其中所述受试者患有糖尿病，先天性心脏病，局部缺血，肌病，线粒体疾病和/或患有梗塞。
C3.实施方案C1-C3之一的方法，其中所述线粒体疾病是脂肪酸氧化(FAO)紊乱。
C4.实施方案C1-C4之一的方法，其中所述受试者在编码HADHA的基因中具有突变。
C5.实施方案C1-C5之一的方法，其中所述受试者经历心律不齐。
C6.实施方案C1-C6之一的方法，其中所述受试者处于婴儿猝死综合症(SIDS)的升高风险中。
D1.筛选用于调节心脏功能的化合物的方法，包括：
使实施方案B1-B4之一中所述的一个或多个心肌细胞与候选药剂接触；和
测量所述一个或多个心肌细胞的心脏功能参数；
其中所述心脏功能参数的变化表明候选药剂调节心脏功能。
D2.实施方案D1的方法，其中所述成熟心肌细胞包括遗传畸变。
D3.实施方案D1或D2的方法，其中所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱相关。
D4.实施方案D1-D3之一的方法，其中所述遗传畸变是编码HADHA的基因中的突变。
D5.实施方案D1-D4之一的方法，其中心脏功能参数包括脂质概况、心磷脂概况、代谢概况、耗氧率、线粒体质子梯度、收缩力、钙转运、传导速度、葡萄糖应激和细胞死亡。
E1.一种治疗受试者中线粒体脂肪酸氧化(FAO)紊乱的方法，该方法包括施用有效量的稳定该受试者的心磷脂概况或促进该受试者线粒体中的成熟心磷脂重塑的组合物。
E2.实施方案E1的方法，其中所述FAO紊乱与糖尿病、心力衰竭、神经变性、高龄、先天性心脏病、局部缺血、肌病和/或梗塞的情况有关。
E3.实施方案E1或E2的方法，其中所述FAO紊乱是脂肪酸(FA)β-氧化紊乱。
E4.实施方案E1-E3之一的方法，其中线粒体功能障碍的表型与婴儿猝死综合症的风险增加相关。
E5.实施方案E1-E4之一的方法，其中稳定心磷脂概况包括防止心磷脂氧化。
E6.实施方案E1-E4之一的方法，其中所述组合物是或包含elamipretide。
F1.一种检测培养的心肌细胞病理状态的方法，包括：
确定心肌细胞中的心磷脂概况，其中具有大于18个碳的酰基链的心磷脂的相对增加指示和具有小于18个碳的酰基链的心磷脂的相对减少指示心肌细胞的病理状态降低。
F2.实施方案F1的方法，其中心磷脂的增加或减少是相对于野生型未成熟心肌细胞而言的。
F3.实施方案F1或F2的方法，其中所述培养的心肌细胞在体外衍生自干细胞。
F4.实施方案F3的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞、多能干细胞或诱导的多能干细胞。
F5.实施方案F1-F4之一的方法，其中所述病理状态与线粒体功能障碍有关。
F6.实施方案F5的方法，其中所述线粒体功能障碍是线粒体三功能蛋白缺乏。
F7.实施方案F1-F6之一的方法，其进一步包括使培养的心肌细胞与候选药剂接触以降低培养的心肌细胞的病理状态。
F8.实施方案F7的方法，其包括在使所述培养的心肌细胞与候选药剂接触的步骤之前、期间和/或之后多次测定培养的心肌细胞中的心磷脂概况，以确定候选药剂对培养的心肌细胞的病理状态的影响。
G1.诱导培养的心肌细胞成熟的组合物，其包含以下两种或更多种：编码Let7imicroRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体。
G2.实施方案G1的组合物，其包含以下三种或更多种：编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体。
G3.实施方案G1或G2的组合物，其包含编码Let7i microRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体。
G4.实施方案G1-G3之一的组合物，其中编码microRNA和/或编码寡聚物的核酸构建体各自可操作地连接至一个或多个启动子序列。
G5.实施方案G1-G4之一的组合物，其中将一种或多种所述构建体掺入被配置用于递送至细胞的一种或多种载体中。
G6.实施方案G5的组合物，其中所述一种或多种载体是病毒载体。
G7.实施方案G5或G660的组合物，其中至少一种病毒载体是慢病毒载体或AAV载体。
G8.实施方案G1-G7之一的组合物，其中与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物和与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物是被配置为诱导基因编辑酶分别切割miR-122和miR-200a的引导RNA分子。
G9.实施方案G8的组合物，其中所述基因编辑酶是核酸酶。
G10.实施方案G1-G9之一的组合物，其进一步包含核酸酶。
G11.实施方案G9或G10的组合物，其中所述核酸酶是Cas9。
G12.实施方案G1-G11之一的组合物，其进一步包含一种或多种长链脂肪酸。
G13.实施方案G12的组合物，其中所述一种或多种长链脂肪酸包含棕榈酸酯、油酸和亚油酸中的两种或更多种。
G14.实施方案G12或G13的组合物，其中所述一种或多种长链脂肪酸包括棕榈酸酯、油酸和亚油酸。
H1.包含实施方案G1-G14的一种或多种组合物的试剂盒。
H2.实施方案H1的试剂盒，其进一步包含细胞培养基和/或一种或多种未成熟的心肌细胞。
尽管已经图示和描述了说明性实施例，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中进行各种改变。
序列表
<110> University of Washington
Miklas, W.
Ruohola-Baker, H.
Wang, Y.
<120> 检测和促进心磷脂重塑和心肌细胞成熟的方法和
组合物以及治疗线粒体功能障碍的相关方法
<130> UWOTL167910
<150> US 62/596438
<151> 2017-12-08
<150> US 62/674978
<151> 2018-05-22
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atggtggcct gccgggcgat tggcatcctc agccgctttt ctgccttcag gatcctccgc 60
tcccgaggtg aggcctggcc gagggcatcc 90
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Met Val Ala Cys Arg Ala Ile Gly Ile Leu Ser Arg Phe Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Ile Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Leu Leu Thr Arg Thr His Ile Asn Tyr
35 40
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
atggtggcct gccgggcgat tggcatcctc agccgctttt ctgccttcag gatcctccga 60
gggcatcc 68
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Met Val Ala Cys Arg Ala Ile Gly Ile Leu Ser Arg Phe Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Ile Leu Leu Tyr Met Pro Gln Phe Tyr Arg Val Phe Cys Phe Ala
20 25 30
Asp Gln Asn Pro Tyr
35
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> 人
<400> 5
atggtggcct gccgggcgat tggcatcctc agccgctttt ctgccttcag gatcctccgc 60
tcccgaggtg aggcctggc 79
<210> 6
<211> 43
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Met Val Ala Cys Arg Ala Ile Gly Ile Leu Ser Arg Phe Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Ile Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Ile Cys Arg Asn Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Leu Leu Thr Arg Thr His Ile Asn Tyr
35 40
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
ccgggcgatt ggcatcctca gccgcttttc tgccttcagg atcctccgcg gaggtgaggc 60
caggtgaggc ctggc 75
<210> 8
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Met Val Ala Cys Arg Ala Ile Gly Ile Leu Ser Arg Phe Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Ile Leu Arg Gly Gly Glu Ala Arg Leu Tyr Met Pro Gln Phe Tyr
20 25 30
Arg Val Phe Cys Phe Ala Asp Gln Asn Pro Tyr
35 40
<210> 9
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gtggcctgcc gggcgattgg catcctcagc cgcttttctg ccttcaggat cctccgctcc 60
gcggaggtga ggcctggc 78
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Met Val Ala Cys Arg Ala Ile Gly Ile Leu Ser Arg Phe Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Ile Leu Arg Ser Ala Glu Val Ile Tyr Ala Ala Ile Leu Gln Gly
20 25 30
Leu Leu Leu Cys
35
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> 人
<400> 11
ctggctgagg tagtagtttg tgctgttggt cgggttgtga cattgcccgc tgtggagata 60
actgcgcaag ctactgcctt gcta 84
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
tccgcgtggt cccg 14
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
attgtcctcc gcggcgc 17
<210> 14
<211> 85
<212> DNA
<213> 人
<400> 14
gctaagcact tacaactgtt tgcagaggaa actgagactt tgtaactatg tctcagtctc 60
atctgcaaag aagtaagtgc tttgc 85
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
caccgccgga gtctgtctca taccc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
aaacgggtat gagacagact ccggc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
caccgagctt gactctaaca ctgtc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
aaacgacagt gttagagtca agctc 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
caccgagttt ccttagcaga gctg 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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aaaccagctc tgctaaggaa actc 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
caccgggcag gcctcacctc gggag 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
aaacctcccg aggtgaggcc tgccc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
caccgggaag gcagaaaagc ggctg 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
aaaccagccg cttttctgcc ttccc 25
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
cgtacgtgtt ctgcacagcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
cagcaatgtt ctgaaggccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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cctgccccct tcaaggtaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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ctggtctgat aggtggggga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gagagctagg ctttgtgcca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
cttatgtggc cccgtgttct 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
tgtccctacc ttgtctgtta gcca 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
attggaacat ggcctctgga tgga 24
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
tggttcggtg catgaaggac 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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gtcgatgtag ccatcagcat t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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ctgggctaca ctgagcacc 19
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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aagtggtcgt tgagggcaat g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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caacgcagac ctgatggatt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
agcccccgct tcttcattc 19
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
ccggtgagtt ctgagcagcc tgactt 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
aaaaaaccgg tctcacacga gctccattcc c 31
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
acccaaagtg tacaatcatt gact 24
<210> 45
<211> 90
<212> DNA
<213> 人
<400> 45
ccgggcccct gtgagcatct taccggacag tgctggattt cccagcttga ctctaacact 60
gtctggtaac gatgttcaaa ggtgacccgc 90
<210> 46
<211> 85
<212> DNA
<213> 人
<400> 46
ccttagcaga gctgtggagt gtgacaatgg tgtttgtgtc taaactatca aacgccatta 60
tcacactaaa tagctactgc taggc 85
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