阅读说明：本技术 线粒体移植在治疗原发性扩心病中的应用 (Application of mitochondria transplantation in treating primary dilated cardiomyopathy ) 是由 葛均波 孙爱军 孙晓垒 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于原发性扩心病治疗领域,具体涉及线粒体移植在治疗原发性扩心病中的应用。本发明获得人源诱导多功能干细胞,体外分化诱导成跳动的心肌细胞,分离获得人源心肌细胞线粒体,同时分离小鼠心肌线粒体,分别获得人源和鼠源线粒体备用。本发明通过腹腔注射阿霉素构建小鼠扩心病模型,并在小鼠左心室心肌表层多点移植人源和鼠源线粒体,6天后超声心动图检测小鼠心脏功能,组织病理学检测小鼠心肌结构变化。研究结果显示,阿霉素诱导的小鼠扩心病模型构建过程中,移植人源或鼠源心肌细胞线粒体能够显著增强心肌收缩和舒张功能,抑制心脏双室心腔扩张。(The invention belongs to the field of primary dilated cardiomyopathy treatment, and particularly relates to application of mitochondrial transplantation in treatment of primary dilated cardiomyopathy. The invention obtains human-derived induced multifunctional stem cells, differentiates and induces the stem cells into beating myocardial cells in vitro, separates and obtains human-derived myocardial cell mitochondria, and simultaneously separates mouse myocardial mitochondria to respectively obtain human-derived mitochondria and mouse-derived mitochondria for later use. The invention constructs a mouse heart disease model by injecting adriamycin into abdominal cavity, transplants human and mouse mitochondria on the surface layer of the cardiac muscle of the left ventricle of the mouse at multiple points, detects the cardiac function of the mouse by echocardiogram after 6 days, and detects the structural change of the cardiac muscle of the mouse by histopathology. Research results show that in the process of constructing a mouse heart enlargement disease model induced by adriamycin, human or mouse myocardial cell mitochondria are transplanted to remarkably enhance the myocardial contraction and relaxation functions and inhibit the expansion of the heart double-chamber heart cavity.)

线粒体移植在治疗原发性扩心病中的应用

技术领域

本发明属于原发性扩心病治疗领域，具体涉及线粒体移植在治疗原发性扩心病中的应用。

背景技术

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一种原发性心肌疾病，主要表现为心室腔扩大，收缩功能下降引起的充血性心力衰竭。据统计扩张型心肌病一年内的死亡率占20％，四年内的死亡率占56％。由于扩心病的致病因素复杂，大多数情况下，没有明确的治疗措施，临床上使用ACE抑制剂，利尿剂，β受体阻滞剂，洋地黄和抗凝血剂等药物只能通过缓解症状延缓心力衰竭，延长病人寿命，两年内仍有40％的心衰发生率，需要心脏移植。基因或非基因引起的线粒体功能障碍是左心室收缩功能异常主要原因，是导致扩心病发生发展的重要因素。由于扩心病致病因素不详，导致目前扩张型心肌的治疗策略不成熟。

线粒体移植是一种干预治疗方式，具体是从患者其他部位得到正常的线粒体然后直接注入线粒体异常的组织部位，就可以代替损伤线粒体，损伤细胞得到救治，器官功能恢复正常。现有证据表明，线粒体移植在多种线粒体缺陷以及功能障碍有关疾病治疗中已经崭露头角，这种治疗手段为神经保护开辟了新的途径。此外，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、肌营养不良、与衰老相关的神经病变、创伤性神经症及脑震荡等多种病理过程也与线粒体功能障碍有关。线粒体移植在临床中的应用将会越来越普遍，其独特的治疗方案符合“用自身物质治疗自身疾病”的精准医学理念。但目前为止，并未有通过线粒体移植治疗原发性扩心病的相关记载。

发明内容

本发明分离获得了人源心肌细胞线粒体，同时分离小鼠心肌线粒体，分别获得人源和鼠源线粒体备用。通过腹腔注射阿霉素构建小鼠扩心病模型，并在小鼠左心室心肌表层多点移植人源和鼠源线粒体，6天后超声心动图检测小鼠心脏功能，组织病理学检测小鼠心肌结构变化。

第一方面，本发明提供了线粒体制剂在制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用。

采用上述技术方案的效果是：在阿霉素诱导的小鼠扩心病模型构建过程中，移植人源或鼠源心肌细胞线粒体能够显著增强心肌收缩和舒张功能，抑制心脏双室心腔扩张。

在上述方案的基础上还可以进一步改进，具体改进如下：

进一步地，所述线粒体为自体来源的线粒体。采用自体来源的线粒体进行移植可以避免来自同种异体的线粒体产生的排斥。

进一步地，所述线粒体制剂含有生理盐水。

进一步地，所述心衰是由扩心病心肌功能障碍引起的。本发明提供的线粒体制剂可以有效的改善扩心病心肌功能障碍。同时，提供了

进一步地，所述扩心病心肌功能障碍是由注射阿霉素引起的。

进一步地，所述心肌功能障碍是指心肌收缩和舒张功能障碍。本发明提供的线粒体制剂可以显著的增强心肌收缩和舒张功能。

第二方面，本发明还提供了一种将线粒体试剂递送至组织靶点的方法，具体地，将治疗有效剂量的线粒体试剂施用至所述组织的靶点。

采用上述技术方案的效果是：通过外源补给线粒体，可以有效的缓解由于线粒体功能障碍而导致的能量相关的收缩功功能障碍。

在上述方案的基础上还可以进一步改进，具体改进如下：

进一步地，所述组织为心脏；优选地，所述组织为心肌表层。

进一步地，所述线粒体为自体来源的线粒体，所述线粒体制剂含有生理盐水。

进一步地，所述线粒体制剂的浓度为每100微升中含有10⁵个线粒体。

本发明相对于现有技术，具有的技术效果：

(1)本发明着眼于扩心病心肌细胞供能相关的收缩功能障碍这一共同点，实施线粒体移植，能够有效改善扩张型心肌病相关的心功能障碍，保障心肌功能供能，显著增强心肌收缩和舒张功能，抑制心脏双室心腔扩张，抑制心衰发生，改善扩心病病人生命质量。

(2)本发明分离并获得了人源诱导多功能干细胞分化成的心肌细胞线粒体，按每100微升含有10⁵个线粒体溶于生理盐水的线粒体悬液注射于左心室心肌层表面，同时按15mg/kg腹腔注射阿霉素构建小鼠扩心病模型，进行小鼠扩心病模型移植验证，有效推广了线粒体移植的临床应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1本申请的技术路线图

图2小鼠心肌细胞来源的线粒体移植对扩心病治疗效果的评估

A线粒体移植显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏左室射血分数；

B线粒体移植显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏短轴缩短率；

C和D不同处理组小鼠收缩和舒张期的室间隔厚度；

E和F线粒体移植显著降低阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏收缩和舒张期左室内径；

G和H不同处理组小鼠收缩和舒张期左室室壁厚度。

CON:对照组，DOX：阿霉素处理组，DOX+MITO：阿霉素处理合并线粒体移植。S:收缩期，d:舒张期，IVS:室间隔厚度，LVID:左室内径，LVPW:左室室壁厚度。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。

图3人源心肌细胞线粒体移植有效改善扩张型心肌病小鼠心功能

A线粒体移植显著增加阿霉素有道德扩心病小鼠心脏左室射血分数；

B线粒体移植显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏短轴缩短率；

C和D不同处理组小鼠收缩和舒张期的室间隔厚度；

E和F不同处理组小鼠收缩和舒张期左室内径；

G和H不同处理组小鼠收缩和舒张期左室室壁厚度。CON:对照组，DOX：阿霉素处理组，DOX+MITO：阿霉素处理合并线粒体移植。S:收缩期，d:舒张期，IVS:室间隔厚度，LVID:左室内径，LVPW:左室室壁厚度。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的描述。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

根据本发明的实验路程图，见图1，按照如下步骤操作：

Matrigel包被培养皿

1.1 Matrigel(BD，bioscience)分装放-20℃/-80℃，使用前将分装的Matrigel放4℃过夜解冻。

1.2将Matrigel和DMEM+F12培养基在4℃预冷，按照800μl/50ml比例稀释后立即混匀，该过程操作要快，防止胶凝固，6孔板每孔加入1ml培养基。

1.3用封口膜封好培养皿，防止蒸发，放入37℃细胞培养箱至少2小时后用于后续实验，若暂不使用，放入4℃保存。

1.4 Matrigel包被的6孔板使用前去掉孔板中养基，加入待用的培养基即可。

2.IPS细胞的培养及传代

2.1细胞密度达到80-90％时即可传代，按照1：4-1：6的比例传代。

2.2准备含有10μM Y试剂的mTESR培养基，待用。

2.3去掉IPS细胞培养皿内培养基，D-PBS轻轻清洗一遍细胞，去掉D-PBS,加入0.5ml accutase消化液，放入37℃细胞培养箱内约1-2min，镜下观察消化状态，大部分细胞变透亮后去掉accutase，留一点继续37℃消化，约1min后镜下观察，消化程度。

2.4加入1ml mTESR培养基，动作轻柔，边加边消下细胞，禁吹打。

2.5将消化下的细胞分别加入Matrigel包被的培养皿内，轻轻混匀，镜下观察细胞形态后放入37℃细胞培养箱内。

2.6细胞孵育2小时后去掉培养液，换成不含Y试剂的mTESR培养基，根据细胞状态可以每4天传代一次。

3.IPS细胞向心肌细胞分化

3.1提前配好培养基：RPMI1640培养基+B27 minus insulin(按照10mlB27+500mlRPMI1640的比例配制)。取部分RPMI1640培养基+B27minus insulin加入CHIR至于终浓度12μM。

3.2显微镜下观察细胞，待细胞密度达到80-90％时即可进行分化。

3.3弃掉IPS细胞培养皿内培养基，D-PBS轻轻洗一遍细胞。

3.4加入提前配制好的含有CHIR的RPMI1640+B27 minus insulin培养基，连续分化IPS细胞72小时。

3.5分化72小时后，取RPMI1640+B27 minus insulin培养基加入IWR-1抑制剂至终浓度5μM,将IPS细胞分化培基换成含有IWR-1抑制剂的培养基，继续分化48小时，之后换基础RPMI1640+B27 minus insulin培养基两天，期间不用换液。

3.6分化好后，IPS细胞换RPMI1640+B27with insulin培养基。

3.7以后每天换一次液体，直至出现跳动的心肌细胞。

实施例2

动物组织和细胞线粒体制备方法分别按照使用的碧云天动物组织和细胞线粒体分离试剂盒的要求冰上操作，裂解液裂解条件保持一致，研磨棒研磨次数为40-50次。

线粒体制备完毕后，溶于PBS中，冰上保存，吸取一部分浓度线粒体溶液，稀释后计数以调整线粒体工作悬液浓度。线粒体制备完毕后立即使用，并且在1小时之内移植到动物心肌。线粒体体外存留时间越长活力越差。

实施例3

实验设置三组：Sham组，DCM组，DCM+线粒体移植组。提前对成年C57BL/6小鼠进行胸部脱毛处理，使用2％的异氟烷气体吸入麻醉小鼠，行左胸开胸手术，将胸大肌与胸小肌分离，止血钳打开胸膜和心包，挤出心脏于心肌左室表面分别多点共移植100μl(每100微升含有10⁵个线粒体)生理盐水悬液，同时腹腔注射15mg/kg阿霉素；DCM组心肌注射相同体积的PBS，腹腔注射15mg/kg阿霉素；Sham组只开胸挤出心脏，心肌注射相同体积的PBS，不实施阿霉素腹腔注射。

实施例4

针对实施例3中的三组实验组，分别在阿霉素注射和线粒体移植的第1-6天对小鼠的体重和死亡率进行实时监测，第6天时，检测小鼠心功能，分析小鼠心肌收缩舒张功能，收缩舒张时心腔大小，心肌细胞大小，心肌细胞ATP产能，ROS产生和凋亡水平。

小鼠心肌细胞来源的线粒体移植对扩心病治疗效果的评估结果如图2所示，线粒体移植后，小鼠心脏左室射血分数为70％左右，相对于阿霉素处理组显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏左室射血分数(见A图)；线粒体移植后，小鼠心脏短轴缩短率为35％左右，相对于阿霉素处理组显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏短轴缩短率(见B图)；图C和D分别代表小鼠心肌收缩和舒张期的室间隔厚度，结果显示，与对照组相比，线粒体移植能够显著增加扩心病小鼠心肌收缩期的室间隔厚度，舒张期室间隔厚度三组间无显著差异。线粒体移植显著降低阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏收缩和舒张期左室内径(见E、F图)；图G和H分别代表心肌收缩和舒张期左室后壁厚度，与对照组相比，阿霉素诱导的扩心病模型小鼠心肌左室后壁厚度变薄，代表心功能变弱，而线粒体移植能够通过增加左室后壁厚度改善小鼠心功能。

人源心肌细胞线粒体移植有效改善扩张型心肌病小鼠心功能的评估结果如图3所示，线粒体移植显著增加阿霉素诱导的扩心病小鼠心脏左室射血分数(见A图)；显著增加阿霉素诱导的扩心病心脏短轴缩短率(见B图)。图C和D分别代表小鼠心肌舒张和收缩期室间隔厚度，结果显示线粒体移植增加扩心病小鼠心肌舒张和收缩期室间隔厚度。图E和F代表小鼠心肌收缩和舒张期的左室内径，结果显示，阿霉素诱导的小鼠扩心病心肌收缩和舒张期的左室内径都显著增加，收缩期的左室内径从1.75±0.096增加到3.131±0.067，线粒体移植后收缩期的左室内径降到2.903±0.05，但是较对照组依然显著增加。阿霉素处理的小鼠舒张期的左室内径从3.205±0.10增加到3.969±0.09，线粒体移植后左室舒张期内径降到3.94±0.09，但是较对照组依然显著增加。图G和H分别代表心肌收缩和舒张期左室后壁厚度，与对照组相比，阿霉素诱导的扩心病模型小鼠心肌左室后壁厚度变薄，代表心功能变弱，而线粒体移植能够通过增加左室后壁厚度改善小鼠心功能。

因此，本发明证明了在阿霉素诱导的小鼠扩心病模型构建过程中，移植人源或鼠源心肌细胞线粒体能够显著增强心肌收缩和舒张功能，抑制心脏双室心腔扩张。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。