发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种D-阿洛酮糖晶体，基于整个晶体的100％(w/w)，其包含98％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖以及0.001％(w/w)至0.05％(w/w)的乙醇。

本发明的另一个目的是提供一种制备D-阿洛酮糖晶体的方法，其包括第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合；以及第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。

技术方案

以下将更详尽地描述本发明内容。

同时，本发明公开的每一个描述和实施方案也可以适用于每一个其他的描述和实施方案。即，本发明公开的各种要素的所有的组合都属于本发明的范围。此外，以下具体描述不得限制本发明的范围。

另外，本领域技术人员可以只用通常的实验来认识和确定本发明所公开的具体实施方案的多个等同物。此外，本发明意图包括这些等同物。

作为本发明解决目标的一个方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖晶体，基于整个晶体的100％(w/w)，其包含98％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖和0.001％(w/w)至0.05％(w/w)的乙醇。

在本发明中，“D-阿洛酮糖”是一种低热量含量的单糖，具有C₆H₁₂O₆的分子式和如下的结构式。除了链状结构，α(alpha)型和β(beta)型的六角环状结构也包括在D-阿洛酮糖的范围内。

在本发明中，“D-阿洛酮糖晶体”是一种固体，其中D-阿洛酮糖分子以有规律的重复结构排列，这与没有重复结构的无定形固体块状物不同。本发明的D-阿洛酮糖晶体的纯度可以为98％(w/w)或更高，特别地，为98.5％(w/w)或更高，更特别地，为99％(w/w)或更高。

在制备本发明的D-阿洛酮糖晶体时，由于加入了乙醇，D-阿洛酮糖晶体可以含有微量的乙醇。乙醇的含量可以为0.05％(w/w)或更低、特别地，为0.04％(w/w)或更低、更特别地，为0.03％(w/w)或更低。乙醇的含量可以是，例如0.001％(w/w)至0.05％(w/w)、0.001％(w/w)至0.04％(w/w)、0.001％(w/w)至0.03％(w/w)、0.005％(w/w)至0.05％(w/w)、0.005％(w/w)至0.04％(w/w)、0.005％(w/w)至0.03％(w/w)、0.01％(w/w)至0.05％(w/w)、0.01％(w/w)至0.04％(w/w)、0.01％(w/w)至0.03％(w/w)、0.02％(w/w)至0.05％(w/w)、0.02％(w/w)至0.04％(w/w)或0.02％(w/w)至0.03％(w/w)。根据本发明的一个非限性制的实施方案，当乙醇含量为上述含量时，不会出现不良味道/气味，因此，D-阿洛酮糖晶体可以等同于没有添加乙醇的D-阿洛酮糖晶体(测试例2)而使用。由于含有微量的乙醇，D-阿洛酮糖晶体的表面可以是光滑的，并且相比未添加乙醇的D-阿洛酮糖晶体(测试例3)，所述D-阿洛酮糖晶体可以是光亮的或有光泽的。此外，当含有微量的乙醇时，D-阿洛酮糖晶体的流动性增强，并且在晶种分散时可以获得高产率和结晶度的结晶。晶体的流动性可以通过测量流度和休止角来确认，其中休止角是指在斜坡上沉积时，尚未凝结的沉积物可以沉积并不流下的最大倾斜角。在D-阿洛酮糖晶体组合物以预定的速度通过安装在水平面上的漏斗后，可以使用分度器测量组合物上表面的角度来获得休止角(图6)。

％(w/w)可与wt％组合使用。％(w/w)可以指基于整个晶体的100重量份，所述晶体的重量，或基于含有晶体的溶液的100重量份，所述晶体的重量。特别地，％(w/w)可以指基于整个晶体的100重量份，D-阿洛酮糖晶体的重量，或基于含有晶体的溶液的100重量份，D-阿洛酮糖晶体的重量。晶体可以含有干燥固体(Dry solid，DS)。

此外，本发明的术语“平均晶体粒径”是代表晶体平均粒径的量度。测量D-阿洛酮糖晶体粒径的方法不受限制，并且可以使用本领域内常规使用的方法。作为测量晶体粒径的非限制的实例，包括比较法(FGC)、切割法(FGI)、平坦能力法(FGP)等。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的平均粒径(MA:面积分布的平均直径)可以为60μm或更高、100μm或更高、150μm或更高、200μm或更高、230μm或更高、250μm或更高、300μm或更高或320μm或更高。例如，平均粒径可以为100μm至500μm、150μm至450μm、200μm至400μm、230μm至400μm、300μm至400μm、320μm至400μm或320μm至390μm。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的d10是对应于较低的10％的晶体分布的数值，其可以为100μm或更高、110μm或更高、130μm或更高、或150μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d10可以为100μm至200μm、100μm至180μm、110μm至180μm、110μm至160μm、130μm至180μm、130μm至160μm、150μm至180μm或150μm至160μm。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的d50是对应于较低的50％的晶体分布的数值，其可与中位数组合使用，可以为100μm或更高、150μm或更高、200μm或更高、230μm或更高、250μm或更高、300μm或更高、或310μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d50可以为100μm至500μm、150μm至450μm、200μm至400μm、230μm至400μm、300μm至400μm、320μm至400μm或310μm至390μm。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的d90是对应于较低的90％的晶体分布的数值，其可以为200μm或更高、250μm或更高、300μm或更高、330μm或更高、350μm或更高、400μm或更高或500μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d90可以是200μm至800μm、250μm至700μm、300μm至650μm、330μm至600μm、350μm至600μm、400μm至600μm或500μm至590μm。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的粒径分布可以通过相对标准偏差或相对粒径分布来确定。

相对标准偏差是由标准偏差除以平均粒径得到的百分比数值，其可以是30％至60％、35％至55％、37％至50％、38％至48％或40％至46％。

相对粒径分布是由d50除以d90与d10之差得到的数值，可以是0.8至1.5、0.9至1.4或1.0至1.3。

结果，在晶体离心设备中，与母液一起损失的D-阿洛酮糖晶体的量降低可以减少晶体间的聚集。因此，本发明的具有所述粒径的D-阿洛酮糖晶体适用于大规模生产。

作为本发明解决目标的另一个方面，本发明提供了一种制备D-阿洛酮糖晶体的方法，其包括第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合；第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以得到含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。

“含有D-阿洛酮糖的溶液”是没有限制的，其可以为任何溶液，只要D-阿洛酮糖可以溶解或分散在其中。含有D-阿洛酮糖的溶液可以是这样的溶液，其纯度为90％(w/w)或更高，特别地，为91％(w/w)或更高、92％(w/w)或更高、93％(w/w)或更高、94％(w/w)或更高、或95％(w/w)或更高，但本发明不限于此。

含有D-阿洛酮糖的溶液可以是通过用酶处理生产D-阿洛酮糖的底物进行差向异构化反应获得的溶液，或者可以是通过分离和纯化所述溶液获得的。底物和酶的实例包括但不限于果糖和D-阿洛酮糖差向异构酶，以及果糖-6-磷酸、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶和D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。特别地，含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过纯化溶液来获得，所属溶液通过果糖与D-阿洛酮糖的差向异构化反应获得。特别地，果糖可以溶于水并在水中使用，在30℃至40℃的温度下，其浓度为30白利糖度(％)至50白利糖度(％)，其中果糖用作差向异构化反应的底物。在本发明中，白利糖度(％)指基于整个溶液的重量，D-阿洛酮糖或果糖的重量百分比。本文中，可以随后将果糖与通过色谱法分离的含有果糖的溶液混合，并且可以在30℃至40℃的温度下，以30白利糖度(％)至50白利糖度(％)的浓度使用。本文中，通过色谱法分离的含有果糖的溶液可以使用含有果糖的部分，其纯度为70％(w/w)或更高，特别地，为75％(w/w)。

在阿洛酮糖差向异构酶、其变体、产生所述酶的菌株或其培养物的存在下，D-阿洛酮糖的差向异构化反应可以是通过差向异构化果糖产生D-阿洛酮糖。可用于本发明的D-阿洛酮糖差向异构酶可以是衍生自各种供体微生物的酶或变体，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、Flavonifractorplauti和Clostridium hylemonae。用于转化的菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和曲霉(Aspergillus)，但不仅限于这几种菌株。转化到大肠杆菌的菌株包括，例如，BL21(DE3)/pET24-ATPE[韩国专利公开号10-211-0035805]，BL21(DE3)/pET24-ATPE-2[韩国专利注册号10-1203856]等。棒状杆菌菌株包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032/pCJ-1-ATPE[登记号KCCM11046，韩国专利公开号10-2011-0035805]，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032/pFIS-1-ATPE-2[登记号KCCM11204P，韩国专利注册号10-1203856]、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CJ KY[登记号KCCM11403P，韩国专利注册号10-1455759]，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032/pFIS-2-ATPE-2[登记号KCCM11678P，韩国专利申请号10-2015-0047111]等，但本发明不限于此。

作为示例，差向异构化反应可以通过如下进行，将阿洛酮糖差向异构酶、其变体、产生所述酶的菌株或其培养物固定在载体(例如，海藻酸钠)上，用固定化酶填充异构化反应设备(例如色谱柱)，然后将含有果糖的溶液供给到填充的色谱柱。设备中的温度可以保持在40℃至70℃，例如，40℃至55℃，以进行差向异构化反应。这时，通过热交换器，含有所供给的果糖的溶液的温度以例如每小时5℃至20℃的速度上升，温度达到40℃至60℃的温度，例如50℃，并且溶液以0.5至3的空速(SV)[流速(L)/时间(Hr)/树脂量(L)]通过。通过差向异构化反应产生的D-阿洛酮糖的纯度可以为约15％(w/w)至约35％(w/w)，例如，约20％(w/w)至约30％(w/w)。

含有差向异构化D-阿洛酮糖的溶液可以被冷却。溶液温度或环境温度在25℃至45℃的温度范围内进行冷却，特别是30℃至40℃。特别地，可以以每小时1℃至10℃的速度缓慢进行冷却，并且可以在冷却中使用热交换器。

含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过分离和/或纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液获得。即，本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法可以包括在第一步之前，分离和/或纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液。

含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液获得。特别地，纯化可以通过以下中的至少一种进行：通过填充有脱色剂的色谱柱进行脱色、通过离子交换树脂色谱法进行脱盐以及连续色谱法。

特别地，含有差向异构化D-阿洛酮糖的溶液可以被冷却，然后通过填充有脱色剂的色谱柱进行脱色，并通过填充有强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的色谱柱进行纯化。在使用强碱性阴离子交换树脂的情况下，即使在25℃至45℃的低温下，D-阿洛酮糖也会变性，因此纯度可能会下降。因此，为了制备高产率的D-阿洛酮糖，可以使用弱碱性阴离子交换树脂，更特别地，可以使用100％的弱碱性阴离子交换树脂。为了有效去除离子成份，可以同时使用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。在这种情况下，阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的比例可以为1:0.5至1:3。在离子纯化过程中，保持温度为25℃至45℃，特别地，为30℃至40℃，以防止D-阿洛酮糖变性。因此，含有D-阿洛酮糖的溶液中的杂质离子成分可以被去除。离子纯化后，离子成分的含量可以为20微西门子或更低，特别是用电导系统测量时，为10微西门子/单位厘米或更低。离子纯化溶液中的D-阿洛酮糖的纯度可以为约10％(w/w)至约35％(w/w)。本文中，在冷却和离子纯化过程中，通过蒸馏将乙醇从的母液中去除，然后母液可以被重新使用，所述母液在随后的D-阿洛酮糖的结晶步骤中产生。纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以被浓缩和冷却。

浓缩是这样的过程，将离子纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液浓缩至D-阿洛酮糖浓度在50白利糖度(％)至70白利糖度(％)的范围内，例如，55白利糖度(％)至65白利糖度(％)。特别地，可以在50℃至80℃的温度下进行浓缩，例如，55℃至70℃。这时，在浓缩过程中，可使用低温蒸发器来防止D-阿洛酮糖的变性。浓缩以后，可以进行冷却。进行冷却时，可以进行浓缩以使溶液或环境温度达到比浓缩时的温度低至少10℃的温度。例如，冷却温度可以在40℃至60℃的范围内。可以以每小时5℃至25℃的冷却速率缓慢进行冷却，冷却中可以使用热交换器。本文中，在浓缩和冷却过程中，通过蒸馏将乙醇从母液中去除，然后母液可以被重新使用，所述母液在随后的D-阿洛酮糖的结晶步骤中产生。

含有D-阿洛酮糖的溶液可以是通过将果糖从含有D-阿洛酮糖的溶液中分离而得到的溶液。特别地，含有果糖的溶液可以通过色谱法进行分离。

色谱法利用D-阿洛酮糖和附着于离子树脂上的金属离子的弱结合力的差异来分离D-阿洛酮糖，例如，可以使用连续色谱法。用于色谱法的离子树脂可以是附着K、Na、Ca和Mg残留物的强酸性阳离子交换树脂。特别地，该离子树脂可以是能够分离D-阿洛酮糖和果糖的离子树脂，例如，K、Ca或Na。含有果糖的溶液和纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过色谱法获得。纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以是含有纯度为90％(w/w)或更高，例如，95％(w/w)或更高的D-阿洛酮糖的溶液。特别地，D-阿洛酮糖的纯度可以是90％(w/w)至99％(w/w)或更高。含有果糖的溶液可以是含有纯度为70％(w/w)或更高的果糖的溶液。分离的含有果糖的溶液可以重新用于色谱法中的D-阿洛酮糖的差向异构化反应。果糖是未经分离而变性的，经色谱法分离，然后重新用于D-阿洛酮糖差向异构化反应以提高总产率。在重新使用以前，可以进一步包括在25℃至45℃，和30℃至40℃的范围内的冷却。

本发明的含有D-阿洛酮糖的溶液可以被浓缩。例如，将获得的纯度为95％(w/w)或更高的纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液进行浓缩，以使D-阿洛酮糖的浓度达到75白利糖度(％)或更高，例如，80白利糖度(％)或更高。特别地，浓缩可以在50℃至80℃的温度下进行，例如，55℃至70℃。这时，在浓缩过程中，可使用低温蒸发器来防止D-阿洛酮糖的变性。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法包括，第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合。因此，D-阿洛酮糖可能会部分析出。此外，加入晶种，以及下文所述的冷却可以特别有助于以高产率分离晶体。

第一步的混合可以在20℃至60℃下进行。特别地，第一步的混合可以在30℃至60℃下进行，更特别地，40℃至60℃。在比此更低的温度下，将变为过饱和状态，超出介稳区，这导致新晶体的成核而不是晶体的生长，因此导致晶体的生长受到抑制的问题。在更高的温度下，有机溶剂会在混合过程中挥发，结果，由于回收率的降低和蒸汽的产生，会导致安全方面的问题。

有机溶剂可以是醇，特别地，可以包括乙醇、甲醇和异丙醇中的至少一种。

有机溶剂可以为混合物，即水：有机溶剂的比例为1:0.5或更高，1:0.7或更高，或1:1或更高，例如，1:0.5至1:10、1:0.7至1:10、1:1至1:10、1:1至1:9或1:1至1:8。

本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法，第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏(massecuite)。本文中，糖膏是指D-阿洛酮糖晶种开始结晶反应时，晶体和溶液混合的浆体状态。

制备D-阿洛酮糖晶体的方法中，最困难的方面是控制晶体的大小或形状。在本发明中，这可以通过一种结晶方法来实现，其中有机溶剂混合到含有D-阿洛酮糖的溶液后，加入晶种并缓慢冷却溶液。

在本发明中，D-阿洛酮糖晶种指主要由D-阿洛酮糖组成的细小晶体，在均匀地保持D-阿洛酮糖在有机溶剂混合溶液中的介稳区的过饱和度的同时，添加D-阿洛酮糖晶种。有机溶剂混合溶液具有低粘度，并且添加的D-阿洛酮糖晶种可以容易地分散。在低粘度和高分散度的条件下，晶体可以很好地生长。D-阿洛酮糖的晶种可以是100μm或更低的晶种，特别是具有40μm至100μm尺寸的晶种。D-阿洛酮糖晶种可以以基于混合溶液的总重量，0.01％(w/w)至1％(w/w)的重量百分比加入。

在本发明的制备方法中，当不加入D-阿洛酮糖晶种时，会产生无定形的D-阿洛酮糖块，并且不会产生具有所需尺寸或形状的D-阿洛酮糖晶体。优选以分散的形式将D-阿洛酮糖晶种加入到混合溶液中。在加入晶种后，通过调整冷却条件来生长晶体。

关于冷却条件，冷却前的第一步混合温度与上述相同，第二步冷却的最终温度可以为8℃至30℃、8℃至25℃、8℃至20℃、10℃至30℃、10℃至25℃或10℃至20℃。根据这样的温度控制，新晶体的生成被抑制，从而增大了晶体的尺寸并提高了产率。当第二步冷却的最终温度高于上述范围时，D-阿洛酮糖晶体的回收率会更低。此外，当最终温度低于上述范围时，会诱发成核，从而产生大量小于100μm的颗粒，导致在干燥过程中，晶体之间的团聚，结果产品的包装体积减少或适销性受损。

在本发明中，调整冷却速率以控制D-阿洛酮糖晶体的生长速率。特别地，冷却速率可以为0.05℃/小时至1.4℃/小时、0.6℃/小时至1.4℃/小时、0.7℃/小时至1.3℃/小时、0.8℃/小时至1.2℃/小时或0.9℃/小时至1.1℃/小时。作为另一个实例，冷却速率可以调整为在介稳区范围内冷却。当冷却速率快于该范围时，混合溶液迅速进入超过介稳区的过饱和区，并导致大量的颗粒。此外，当冷却速率太低，单位时间内的生产率会降低，导致大规模生产的效率低下。

在第二步中，冷却和/或结晶可以进行20小时至70小时，或30小时至70小时。

根据本发明的一个非限制实施方案，当D-阿洛酮糖晶体通过使用有机溶剂并控制冷却速率来制备时，可能产生结构化的阿洛酮糖晶体堵塞。

本发明的制备方法进一步包括第三步，将D-阿洛酮糖晶体从糖膏中分离并干燥。特别地，含有过量有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体可以从第一步和第二步获得的糖膏中分离。

在从糖膏中分离D-阿洛酮糖晶体时，可以不受限制地使用任何能够分离晶体的方法，例如，可以使用离心脱水机。分离的晶体可以含有0.07％(w/w)或更高、0.1％(w/w)或更高和0.13％(w/w)或更高的有机溶剂，例如，基于总的晶体的100％(w/w)，0.07％(w/w)至0.5％(w/w)、0.1％(w/w)至0.3％(w/w)或0.13％(w/w)至0.2％(w/w)。

将含有过量有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体进行干燥，以获得基于总的晶体的100％(w/w)，含有98％(w/w)或更高的D-阿洛酮糖，以及0.05％(w/w)或更低的有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体。对获得的D-阿洛酮糖晶体的描述与上述相同。

本发明的制备方法可以进一步包括第四步，从分离出D-阿洛酮糖晶体的第三步的母液中回收有机溶剂，然后将回收的有机溶剂作为第一步的有机溶剂重新使用。

此外，本发明的制备方法可以进一步包括第五步，重新使用晶体母液以在第一步中制备D-阿洛酮糖溶液，其中在第四步除去晶体母液的有机溶剂。

本发明的制备方法的产率，即最终获得的D-阿洛酮糖晶体相对于第一步中的含有D-阿洛酮糖的溶液中存在的D-阿洛酮糖重量的重量百分比，可以为65％(w/w)或更高、70％(w/w)或更高、75％(w/w)或更高或80％(w/w)或更高。

即，在本发明中，产率可以用以下公式表示。

[式1]

产率(％)＝(脱水和干燥的D-阿洛酮糖晶体重量/结晶前粗制溶液中的D-阿洛酮糖重量)×100

当计算产率时，通过HPLC分析粗制溶液中的D-阿洛酮糖g/L来测定结晶前粗制溶液中D-阿洛酮糖的重量，然后根据预先测量的结晶粗制溶液的量(L)，将测得的D-阿洛酮糖g/L代入，以计算包含于特定粗制溶液量(L)的D-阿洛酮糖的重量(g)。

此外，在结晶过程中分离的母液，即，从糖膏中脱水出来的上清液，可以通过蒸馏回收有机溶剂重新用于第一步，并将回收的有机溶剂与D-阿洛酮糖溶液混合。将蒸馏除去有机溶剂的含有D-阿洛酮糖的溶液冷却至30℃，其可以在色谱柱中再循环，在所述色谱柱中，强酸性阳离子交换树脂被氢基取代，弱碱性阴离子交换树脂被羟基取代，通过连续色谱法再循环，或在第一步再循环。D-阿洛酮糖结晶产生的母液可以是含有D-阿洛酮糖的部分，其纯度为75％(w/w)或更高、85％(w/w)或更高或95％(w/w)或更高。

有益效果

在本发明的制备D-阿洛酮糖晶体的方法中，通过在含有D-阿洛酮糖的溶液中混合有机溶剂，加入晶种，然后缓慢冷却混合物的结晶方法，可以提高从D-阿洛酮糖溶液中获得D-阿洛酮糖晶体的产率，并制备用于大规模生产的具有足够大小和适当的形状的D-阿洛酮糖晶体，并且没有不良味道/气味。