阅读说明：本技术 春桑叶水提取物在制备治疗亨廷顿病药物中的应用 (Application of spring mulberry leaf water extract in preparation of medicine for treating Huntington disease ) 是由 支德娟 徐帅帅 崔伟薇 张响 汤杨婧 张瑞 付献瑶 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,具体涉及春桑叶水提取物在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。本发明发现初春采摘的春桑叶水提取物,能够显著抑制突变多聚谷氨酰胺蛋白(PolyQ蛋白)的聚集,这表明春桑叶水提取物显著减轻了亨廷顿病样病理特征,可被用于制备治疗亨廷顿病药物。(The invention belongs to the field of medicines, and particularly relates to an application of a spring mulberry leaf water extract in preparation of a medicine for treating Huntington disease. The invention discovers that the water extract of the mulberry leaves picked in early spring can obviously inhibit the aggregation of mutant polyglutamine protein (PolyQ protein), which indicates that the water extract of the mulberry leaves in spring obviously relieves the pathological characteristics of Huntington diseases and can be used for preparing the medicine for treating the Huntington diseases.)

春桑叶水提取物在制备治疗亨廷顿病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及春桑叶水提取物在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。

背景技术

亨廷顿病(Huntington's disease,HD)是一种常染色体单基因突变的全外显性遗传病。该病为突变的亨廷顿蛋白(Htt)聚集引发细胞毒性，主要损害基底节和大脑皮层，属迟发型神经退行性疾病。它的临床症状繁杂，主要包括三类，即运动症状，认知功能障碍和精神障碍。患者通常40岁左右发病，病情随时间恶化，约15-20年后死亡(朱姝等，2017；Jean-MarcBurgunder等，2015)。

现公认HD的发生是由Htt氨基末端重复的谷氨酰胺序列过度扩张引起的，但突变Htt的具体致病机制有待继续探究。Htt基因位于人的第四号染色体上，负责Htt蛋白的编码，其氨基端存在一个由重复的密码子CAG编码的多聚谷氨酰胺(Poly Q)片段。正常的重复序列为6-35，当重复序列异常大于36时将引发HD。在患者脑中会发现突变的Htt的N端片段聚集所产生的不溶性蛋白，毒性影响大脑神经系统的发育和神经组织的功能。突变蛋白存在聚合体和核内包涵体的聚集形态，两者的组织形态和组织化学特性相同，仅区别于发生部位，蛋白的氨基末端Poly Q片段为聚合物的主要组成部分。突变Htt对核内基因表达产生干扰，影响神经发育和诱导细胞死亡，它还与线粒体功能异常有关，另外清除障碍所导致的蛋白积聚也导致了毒性发生(陈韦洁等，2019；秦正红等，2004)。

目前针对HD仍没有显著阻止或逆转病程有效的治疗方法，主要开发药物用于缓解临床症状。临床上可用于HD治疗的药物有减轻兴奋性毒性的药物，如利血平、金刚烷胺；抑制Caspases(一类半胱氨酸蛋白酶，能剪切突变的Htt形成毒性更大的Htt片段)活性的药物，如米诺环素；减少聚集物的药物，如雷帕霉素；改善线粒体功能的药物，如辅酶Q10；调节基因转录异常的药物，如辛二酰苯胺异羟肟酸等(严雅萍等，2011)。这些药物仅能一定程度上改善各类症状，但均有不足，临床上仍然缺乏有效的治疗药物。研究显示Htt突变蛋白的Poly Q片段是发病重要因素，因此，抗亨廷顿病药物的研发应从降低Poly Q蛋白的表达入手。

桑叶来源于桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶，是中国传统中药之一，最早记录于《神农本草经》中。现代药理学实验研究证明桑叶具有降血糖、降血压、调血脂、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种药理作用。此外，桑叶还具有类似人参的补益、稳定神经系统作用，促进神经细胞生长因子，可保护神经细胞，防止神经细胞的损害，其中的活性成分有黄酮及黄酮苷类、生物碱类、多糖类、甾醇类、挥发油类、氨基酸类、维生素类及微量元素(欧阳臻等，2003)。人们一般将桑叶分为春桑，霜桑和介于两者之间采摘的桑叶。目前，春桑大多用来食用，采摘后用来养殖蚕，而霜桑为初霜后采收入药。霜桑采摘后除去杂质，晒干而得，是一种发散风热药，既可内服，也可外敷。它味甘，性平、寒，具有疏散风热，清肺润燥，益肝通气，滋阴补血等功效，为药食两用物品(赵丽珺等，2004)。而本发明提供的是一种春桑叶在制备治疗亨廷顿病药物中的应用，大量文献记载显示，虽然桑叶经霜后为霜桑，霜桑入药为最佳，但在亨廷顿病的治疗中，春初采摘的春桑叶具有显著的治疗效果，提示春桑叶具有治疗亨廷顿病的潜力，可在制备治疗亨廷顿病药物中应用。

本发明采用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为模式生物，秀丽隐杆线虫是一个多功能药物筛选和药物作用机制研究工具。它廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；与高等生物在基因和分子信号通路方面高度保守(蔡外娇等，2008)，因此被广泛应用于神经退行性疾病的分子机制和相关药物初期筛选研究中。将polyQ同黄色荧光蛋白(YFP)融合表达于线虫体壁肌肉细胞中，高度重复的polyQ在线虫体壁呈现密集的荧光亮点，采用受试药物处理该HD线虫，观察体壁肌肉细胞内polyQ荧光聚集度变化判断受试药物是否有治疗HD作用(Kaletta and Hengartner,2006)。

参考文献

[1]朱姝,唐铁山.DNA损伤修复与亨廷顿病的发生机制[J].生物化学与生物物理进展,2017,44:727-736.

[2]Jean-MarcBurgunder,冯璐扬.亨廷顿舞蹈病:教学性综述[J].中国神经精神疾病杂志,2015,41:577-591.

[3]陈韦洁,叶民.亨廷顿病的早期诊治临床研究进展[J].重庆医科大学学报,2019,44:531-533.

[4]秦正红,顾振纶,林芳.亨廷顿舞蹈病的分子病理研究进展[J].中国药理学通报,2004,4:378-382.

[5]严雅萍,张宝荣.亨廷顿病的发病机制和治疗进展[J].中国现代神经疾病杂志,2011,11:30-35.

[6]赵丽珺,齐凤兰,瞿晓华,陈有容.桑叶的营养保健作用及综合利用[J].中国食物与营养,2004,2:23-26.

[7]欧阳臻,陈钧.桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J].江苏大学学报(自然科学版),2003,6:39-44.

[8]蔡外娇,张新民,黄建华,沈自尹.淫羊霍总黄酮延缓秀丽隐杆线虫衰老的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2008,28:522-525.

[9]Kaletta T,Hengartner MO.Finding function in novel targers:C.elegans as a model organism.Nature Reviews Drug Discovery,2006,5:387-399.

[10]张强,孙长波,张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业,2011,3:73-74.

发明内容

本发明目的是提供一种春桑叶水提取物在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。

进一步地，所述春桑叶水提取物的制备方法是：取春桑叶加7.5体积沸水，浸泡30min，滤纸过滤得春桑叶水提取物。

进一步地，所述春桑叶水提取物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、糖浆剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、合剂、滴丸剂及药学上可实现的任一剂型。

本发明目的是提供春桑叶水提取物在制备抑制突变Poly Q蛋白聚集的药物中的应用。

进一步地，所述春桑叶水提取物的制备方法是：取春桑叶加7.5体积沸水，浸泡30min，滤纸过滤得春桑叶水提取物。

进一步地，所述春桑叶水提取物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、糖浆剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、合剂、滴丸剂及药学上可实现的任一剂型。

本发明采用的春桑叶为春初采摘的春桑叶，由南充尚好茶叶有限公司提供。春桑叶水提取物的制备：4g春桑叶加30mL沸水，浸泡30min，滤纸过滤得10mL春桑叶水提取物。春桑叶水提取物的大量制备可根据上述比例放大，使用相应加热、过滤设备获得春桑叶水提取物，这是同领域技术人员可以理解的。桑叶总黄酮作为春桑叶水提取物的标志性成分，其含量采用亚硝酸钠-硝酸铝测定法测定。

本发明以秀丽隐杆线虫作为模式生物，将Poly Q片段通过基因重组技术在线虫肌肉细胞内与YFP融合表达作为秀丽隐杆线虫HD病理模型，在荧光显微镜下可观察到密集的荧光亮点，而具有抗HD活性的药物侯选物处理HD线虫可显著降低荧光亮点的数量。

本发明的有益效果是采用春桑叶水提取物处理受试秀丽隐杆线虫，结果表明：春桑叶水提取物对罹患亨廷顿病的秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用，表现在对HD秀丽隐杆线虫肌肉内Poly Q蛋白过度聚集引起的荧光聚集有显著的抑制作用，这提示春桑叶水提取物具有治疗亨廷顿病的潜力，可在制备治疗亨廷顿病的药物中应用。

附图说明

图1不同桑叶水提取物对HD秀丽隐杆线虫荧光聚集度的影响。注：C为无菌水空白对照；P为阳性对照组，200μM的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；CS为春桑叶水提取物实验组；SS为霜桑叶水提取物实验组；SF为桑粉水提取物实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例：桑叶水提取物对HD线虫荧光聚集度的影响

1.生物材料

AM141株系秀丽隐杆线虫购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)：该株系线虫为将Poly Q片段融合YFP片段通过基因重组技术表达在肌肉细胞特定部位，模拟神经毒性。这种HD线虫随着年龄的增长，可以观察到迅速形成的Poly Q蛋白聚集，成年后完全呈现Poly Q蛋白聚集表型，采用荧光显微镜可观察到高表达poly Q荧光斑点。

大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例)：

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO₄ 1mL,1M CaCl₂ 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板。静置等待培养基凝固，备用。

(2)M9液配方

(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。

3.配制含有桑叶水提取物的NGM平板

春桑叶水提取物的制备：4g春桑叶加30mL沸水，浸泡30min，滤纸过滤得10mL春桑叶水提取物。

桑粉水提取物的制备：4g桑粉加30mL沸水，浸泡30min，滤纸过滤得10mL桑粉水提取物。

霜桑叶水提取物的制备：4g霜桑叶加30mL沸水，浸泡30min，滤纸过滤得10mL霜桑叶水提取物。

供试桑产品为南充尚好桑茶有限公司提供，产地为四川南充，分别为：春初采摘的春桑；春天采过后再行采摘的桑叶，干燥，粉碎得到的桑粉；初霜后采摘的霜桑。桑叶总黄酮含量采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定法测定(张强等，2011)。具体操作步骤：配制0.3mg/ml的芦丁标准溶液，取标准品溶液0、1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL量瓶中，加水至6mL，加5％亚硝酸钠1mL，放置6min后，加10％硝酸铝1mL，放置6min，加入1mol/L氢氧化钠10mL，以甲醇定容至25mL，摇匀，静置15min，以不加标准溶液的相应溶液为空白，在波长505nm处测定吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

称取5g供试品，置索氏提取器中，加甲醇100mL，于恒温水浴锅上90℃提取3h，过滤定容于100ml量瓶中，得供试品溶液。取供试品1mL，按相同条件测定吸光度，代入标准曲线计算得到提取液总酚质量浓度，桑叶产品中总黄酮含量以干物质计，以芦丁mg/g干重表示。我们建立标准曲线y＝0.0893x+5E-05，R²＝0.9998，桑叶产品黄酮含量见表1。

表1供试桑叶产品样品总黄酮含量

配置含有受试桑叶水提取物的NGM平板：

取上述各种桑叶水提取物，分别加入NGM培养基中，倒板。

含受试物的NGM板中桑叶水提取物的终浓度均为10倍稀释，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

4.实施步骤

(1)线虫的培养：

将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2)线虫同步化：

挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在旋涡搅拌器上振荡5～7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。

(3)桑叶水提取物对HD线虫荧光聚集度的影响

将同步化后的线虫卵置于离心管中，保存至20℃恒温培养箱中孵化24h-72h，得L1期的线虫。将L1期线虫接至空白组、阳性对照组和药液组培养基，每个培养基接入约700条线虫于20℃培养，72h后进行荧光聚集度的观察。

其中，C表示无菌水空白对照；P为阳性对照组(200μM EGCG)；CS表示春桑叶水提取物实验组；SS表示霜桑叶水提取物实验组；SF表示桑粉水提取物实验组。

实验结果：与空白对照组相比，阳性对照组荧光聚集度显著降低(p＜0.01)；春桑叶组荧光蛋白聚集度显著性降低(p<0.05)；桑粉实验组、霜桑叶实验组均没有显著性差异。与阳性对照组比较，各桑叶产品实验组线虫体内荧光蛋白聚集度均没有显示显著性下降。

本发明实施例中结果表明：

1.本发明以总黄酮含量作为桑叶水提取物的质控指标，从供试桑叶产品总黄酮含量测定结果可以看出，春桑叶、桑粉和霜桑叶水提取物的总黄酮含量存在显著差异。

2.春桑叶水提取物显著抑制了亨廷顿病秀丽隐杆线虫体壁肌肉细胞内polyQ荧光亮点的数量，这提示春桑叶水提取物具有治疗亨廷顿病潜力，可在制备治疗亨廷顿病的药物中应用。