阅读说明：本技术 Nfe2l1的截短蛋白及其应用 (Truncated protein of NFE2L1 and application thereof ) 是由 邱露 高艳锋 祁元明 于 2020-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及对转录因子NFE2L1的截短蛋白的原创性发现及应用。本发明中发现的截短蛋白序列如SEQ ID NO.1所示,其具有抑制肿瘤生长的作用。(The invention relates to the original discovery and application of a truncated protein of a transcription factor NFE2L 1. The truncated protein sequence found in the invention is shown in SEQ ID NO.1, and has the function of inhibiting tumor growth.)

NFE2L1的截短蛋白及其应用

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种NFE2L1的不依赖其转录因子活性的截短蛋白及其在肿瘤等相关疾病方面的应用等。

背景技术：

氧化应激与抗氧化系统构成的氧化还原稳态是维持正常生理稳态的必要前提，氧化还原稳态失衡造成的长期氧化损伤是导致多种慢性系统性疾病(如慢性炎症、糖尿病、肥胖、神经退行性疾病、衰老、肿瘤等)发生的原因。帽-环-碱性亮氨酸拉链(cap’n’collarbasic-leucine zipper，CNC-bZIP)转录因子家族是目前已知的真核生物中功能最强的调控细胞内氧化还原稳态的转录因子群；哺乳动物CNC-bZIP转录因子的6个成员中，核因子红细胞因子2相似因子1(NFE2L1/Nrf1)是蛋白亚型最多、调控方式最复杂的成员，并且是在小鼠中敲除会致死的抗氧化转录激活因子。

人类NFE2L1基因包含7个外显子、23个转录本，其蛋白主要有亚型TCF11、Nrf1α等，全长NFE2L1蛋白约120-140kDa，氨基酸共772个。分析NFE2L1蛋白分子结构与功能特征，NFE2L1蛋白含有DNA结合区域(DBD)、C端区域(CTD)等主要的功能结构区域。

人NFE2L1的DBD结构域是其进入细胞核和与DNA结合的必须结构域，是NFE2L1蛋白执行转录因子功能的必要前提，包含CNC结构和bZIP结构，是NFE2L1蛋白与sMAF蛋白形成异源二聚体相互结合的区域，通过小MAF蛋白间接的结合在DNA上执行转录因子功能，bZIP结构域是bZIP家族特有的氨基酸特征序列，bZIP家族蛋白可以通过bZIP结构域形成同源或异源二聚体，并且是蛋白进入细胞核所必须的结构；CTD结构域是NFE2L1蛋白的C末端跨膜结构域，CTD结构域缺失的NFE2L1蛋白转录活性增强表明其可能对NFE2L1具有负调控作用。

NFE2L1基因在人类各组织器官中普遍表达且对环境因素十分敏感，辐射、营养、代谢产物、各种药物或重金属的氧化刺激乃至环境温度都能引起NFE2L1基因的差异表达。NFE2L1的分子功能涉及调控氧化还原稳态、糖脂代谢稳态、蛋白质周转，生理功能涉及抗氧化解毒、细胞增殖与凋亡、组织器官发育与功能特化、癌症发生、炎症反应和免疫应答等，其在慢性系统性疾病如慢性炎症、癌症、糖尿病、肥胖、神经退行性疾病等疾病中的功能提示该蛋白具有潜在的临床应用价值。然而由于转录因子直接调控大量下游基因表达，涉及到的生物学功能广泛，往往不能作为临床应用研究的靶标分子。同样，单纯对NFE2L1的过表达或敲低(激活或抑制)都会引起系统性疾病的发生，如组织器官发育不良、神经退行性疾病、糖尿病等。

已有的NFE2L1蛋白修饰切割调控理论、多亚型模型等分子理论模型都基于其抗氧化转录因子功能，在可查阅范围未见对NFE2L1可能存在的非转录因子功能的研究。

发明内容

：

在本专利中，我们独辟蹊径，通过构建无转录因子活性的NFE2L1^1-620蛋白(序列如SEQ NO.1所示，等同于NFE2L1蛋白的第1-620氨基酸区域，即NFE2L1全长蛋白缺失C端152个氨基酸残基而失去DBD结构域并得到NFE2L1^1-620蛋白)，并通过蛋白质免疫印迹方法验证了NFE2L1^1-620蛋白能够正常表达，进而原始创新性发现了NFE2L1的非转录因子功能-抗癌。我们将NFE2L1^1-620稳定过表达的HepG2细胞系进行免疫缺陷小鼠荷瘤实验，以验证其是否具有抑制肿瘤进展的作用，结果发现无转录因子活性的NFE2L1^1-620具有显著抑制肿瘤生长的作用，从而完成本发明。

第一方面，本发明提供了一种全新的蛋白NFE2L1^1-620，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

第二方面，本发明提供了编码前述NFE2L1^1-620的核酸分子，其序列可如SEQ NO.2所示。

第三方面，本发明提供了含前述核酸分子的重组载体。

第四方面，本发明提供了转有前述核酸分子或重组载体的宿主细胞。

第五方面，本发明提供了含前述蛋白NFE2L1^1-620的药物组合物，药物组合物可包括该蛋白及其药学上可接受的载体或赋形剂，可为注射剂，如粉针剂或注射液。

第六方面，本发明发现了前述蛋白NFE2L1^1-620可抗肝癌。

本发明独辟蹊径，发现了NFE2L1具有不依赖其转录因子活性的尚未为人所知的新功能，并经过动物实验证明了NFE2L1的该截短蛋白具有抑制肿瘤的作用。

另需注意的是，本专利的截短型蛋白抗癌，可能是整体的功能，也可能是其中部分氨基酸区域起作用，可以直接起作用，也可能通过间接的方式起作用，基于本专利思路的简单变形，均构成对本专利的等同侵权。

附图说明：

图1NFE2L1^1-620蛋白表达效果检测。

图2NFE2L1^1-620稳定过表达对肿瘤细胞皮下成瘤能力的影响，其中图2A表示荷瘤体积对比，图2B表示荷瘤小鼠体重对比；图2C是荷瘤30天时取出荷瘤组织并拍照对比，图中标尺为0.5cm；图2D表示荷瘤30天时皮下肿瘤质量统计；各图所涉“*”表示p＜0.01。

具体实施方式

：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品。

发明人对NFE2L1^1-620的功能及抗肿瘤作用的发现过程简要说明如下：

1.NFE2L1^1-620表达质粒构建及表达验证：

a)使用总RNA提取试剂盒提取人源细胞系总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA作为PCR反应的模板。

b)使用NFE2L1基因扩增引物(NFE2L1-F:5'-CTCGAGGAATTCATGCTTTCTCTGAAGAAATAC-3'；NFE2L1-R:5'-GGCCGCTCTAGATCACTTTCTCCGGTCCTTT-3')扩增出NFE2L1基因CDS区域，并***pLVX-puro载体中，得到NFE2L1过表达质粒pNFE2L1。

c)以pNFE2L1质粒为模板，使用引物对(NFE2L1^1-620-F:5'-CTCGAGGAATTCATGCTTTCTCTGAAGAAATAC-3',NFE2L1^1-620-R:5'-GAAAGGTCTAGATCAGGCTCGGGCTCGG TGCTCAT-3')扩增出NFE2L1^1-620蛋白的核苷酸序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，***pLVX-puro载体中，得到NFE2L1^1-620过表达质粒pNFE2L1^1-620。

d)将pLVX-puro、pNFE2L1、pNFE2L1^1-620质粒转染入HepG2细胞中，24小时后收取总蛋白，使用蛋白质免疫印迹方法检测发现NFE2L1和NFE2L1^1-620蛋白都能正常表达(图1)。

2.NFE2L1^1-620过表达对肿瘤细胞裸鼠皮下荷瘤的影响：

a)使用慢病毒包装系统包装出NFE2L1、NFE2L1^1-620过表达慢病毒及空载体慢病毒，并感染HepG2细胞，通过使用含嘌呤霉素培养基培养，筛选出对照组细胞系(pLVX)、NFE2L1过表达细胞系(NFE2L1)、NFE2L1^1-620过表达细胞系(NFE2L1^1-620)。

b)将pLVX、NFE2L1、NFE2L1^1-620细胞系消化后用PBS洗2次，再用PBS重悬至500万细胞每毫升的密度。

c)将7周龄裸鼠随机分为三组，每组5只，每只裸鼠皮下注射100万上步所得细胞。皮下荷瘤后第4天开始隔天记录皮下荷瘤长度和宽度，按照公式V＝1/2×a(长)×b²(宽²)计算并记录小鼠肿瘤体积变化(如图2A)，荷瘤小鼠体重变化(如图2B所示)。

d)待最大的肿瘤的体积达到1cm³左右时，处死荷瘤小鼠，取出肿瘤拍照(如图2C所示)并称取重量(如图2D所示)。结果发现失去转录因子活性的NFE2L1^1-620过表达后依然具有显著的肿瘤抑制作用。实验期间三组小鼠的体重无显著差异，并且精神状态良好。

序列表

<110> 郑州大学

<120> NFE2L1的截短蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 620

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Leu Thr Glu Gly Leu Leu Gln Phe Thr

1 5 10 15

Ile Leu Leu Ser Leu Ile Gly Val Arg Val Asp Val Asp Thr Tyr Leu

20 25 30

Thr Ser Gln Leu Pro Pro Leu Arg Glu Ile Ile Leu Gly Pro Ser Ser

35 40 45

Ala Tyr Thr Gln Thr Gln Phe His Asn Leu Arg Asn Thr Leu Asp Gly

50 55 60

Tyr Gly Ile His Pro Lys Ser Ile Asp Leu Asp Asn Tyr Phe Thr Ala

65 70 75 80

Arg Arg Leu Leu Ser Gln Val Arg Ala Leu Asp Arg Phe Gln Val Pro

85 90 95

Thr Thr Glu Val Asn Ala Trp Leu Val His Arg Asp Pro Glu Gly Ser

100 105 110

Val Ser Gly Ser Gln Pro Asn Ser Gly Leu Ala Leu Glu Ser Ser Ser

115 120 125

Gly Leu Gln Asp Val Thr Gly Pro Asp Asn Gly Val Arg Glu Ser Glu

130 135 140

Thr Glu Gln Gly Phe Gly Glu Asp Leu Glu Asp Leu Gly Ala Val Ala

145 150 155 160

Pro Pro Val Ser Gly Asp Leu Thr Lys Glu Asp Ile Asp Leu Ile Asp

165 170 175

Ile Leu Trp Arg Gln Asp Ile Asp Leu Gly Ala Gly Arg Glu Val Phe

180 185 190

Asp Tyr Ser His Arg Gln Lys Glu Gln Asp Val Glu Lys Glu Leu Arg

195 200 205

Asp Gly Gly Glu Gln Asp Thr Trp Ala Gly Glu Gly Ala Glu Ala Leu

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Leu Val Asp Gly Glu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Ala

225 230 235 240

Gln Val Pro Ser Gly Glu Asp Gln Thr Ala Leu Ser Leu Glu Glu Cys

245 250 255

Leu Arg Leu Leu Glu Ala Thr Cys Pro Phe Gly Glu Asn Ala Glu Phe

260 265 270

Pro Ala Asp Ile Ser Ser Ile Thr Glu Ala Val Pro Ser Glu Ser Glu

275 280 285

Pro Pro Ala Leu Gln Asn Asn Leu Leu Ser Pro Leu Leu Thr Gly Thr

290 295 300

Glu Ser Pro Phe Asp Leu Glu Gln Gln Trp Gln Asp Leu Met Ser Ile

305 310 315 320

Met Glu Met Gln Ala Met Glu Val Asn Thr Ser Ala Ser Glu Ile Leu

325 330 335

Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Leu Ser Thr Asn Tyr Ser Leu Ala

340 345 350

Pro Asn Thr Pro Ile Asn Gln Asn Val Ser Leu His Gln Ala Ser Leu

355 360 365

Gly Gly Cys Ser Gln Asp Phe Leu Leu Phe Ser Pro Glu Val Glu Ser

370 375 380

Leu Pro Val Ala Ser Ser Ser Thr Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ser Asn

385 390 395 400

Ser Thr Ser Leu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Thr Asn Leu Thr Gly Leu

405 410 415

Phe Phe Pro Pro Gln Leu Asn Gly Thr Ala Asn Asp Thr Ala Gly Pro

420 425 430

Glu Leu Pro Asp Pro Leu Gly Gly Leu Leu Asp Glu Ala Met Leu Asp

435 440 445

Glu Ile Ser Leu Met Asp Leu Ala Ile Glu Glu Gly Phe Asn Pro Val

450 455 460

Gln Ala Ser Gln Leu Glu Glu Glu Phe Asp Ser Asp Ser Gly Leu Ser

465 470 475 480

Leu Asp Ser Ser His Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ser Ser Glu Gly Ser

485 490 495

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser

500 505 510

Ser Ala Ser Ser Ser Phe Ser Glu Glu Gly Ala Val Gly Tyr Ser Ser

515 520 525

Asp Ser Glu Thr Leu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Val Gly Tyr

530 535 540

Gln Pro Glu Tyr Ser Lys Phe Cys Arg Met Ser Tyr Gln Asp Pro Ala

545 550 555 560

Gln Leu Ser Cys Leu Pro Tyr Leu Glu His Val Gly His Asn His Thr

565 570 575

Tyr Asn Met Ala Pro Ser Ala Leu Asp Ser Ala Asp Leu Pro Pro Pro

580 585 590

Ser Ala Leu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Gln Ala Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Lys Gln Met Ser Arg Asp Glu His Arg Ala Arg Ala

610 615 620

<210> 2

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctttctc tgaagaaata cttaacggaa ggacttctcc agttcaccat tctgctgagt 60

ttgattgggg tacgggtgga cgtggatact tacctgacct cacagcttcc cccactccgg 120

gagatcatcc tggggcccag ttctgcctat actcagaccc agttccacaa cctgaggaat 180

accttggatg gctatggtat ccaccccaag agcatagacc tggacaatta cttcactgcc 240

cggcggctcc tcagtcaggt gagggccctg gacaggttcc aggtgccaac cactgaggta 300

aatgcctggc tggttcaccg agacccagag gggtctgtct ctggcagtca gcccaactca 360

ggcctcgccc tcgagagttc cagtggcctc caagatgtga caggcccaga caacggggtg 420

cgagaaagcg aaacggagca gggattcggt gaagatttgg aggatttggg ggctgtagcc 480

cccccagtca gtggagactt aaccaaagag gacatagatc tgattgacat cctttggcga 540

caggatattg atctgggggc tgggcgtgag gtttttgact atagtcaccg ccagaaggag 600

caggatgtgg agaaggagct gcgagatgga ggcgagcagg acacctgggc aggcgagggc 660

gcggaagctc tggcacggaa cctgctagtg gatggagaga ctggggagag cttccctgca 720

caggtgccta gtggggagga ccagacggcc ctgtccctgg aagagtgcct taggctgctg 780

gaagccacct gcccctttgg ggagaatgct gagtttccag cagacatttc cagcataaca 840

gaagcagtgc ctagtgagag tgagccccct gctcttcaaa acaacctctt gtctcctctt 900

ctgaccggga cagagtcacc atttgatttg gaacagcagt ggcaagatct catgtccatc 960

atggaaatgc aggccatgga agtgaacaca tcagcaagtg aaatcctgta cagtgcccct 1020

cctggagacc cactgagcac caactacagc cttgccccca acactcccat caatcagaat 1080

gtcagcctgc atcaggcgtc cctggggggc tgcagccagg acttcttact cttcagcccc 1140

gaggtggaaa gcctgcctgt ggccagtagc tccacgctgc tcccgttggc ccccagcaat 1200

tctaccagcc tcaactccac cttcggctcc accaacctga cagggctctt ctttccaccc 1260

cagctcaatg gcacagccaa tgacacagca ggcccagagc tgcctgaccc tttggggggt 1320

ctgttagatg aagctatgtt ggatgagatc agccttatgg acctggccat tgaagaaggc 1380

tttaaccctg tgcaggcctc ccagctggag gaggaatttg actctgactc aggcctttcc 1440

ttagactcga gccatagccc ttcttcccta agcagctctg aaggcagttc ttcctcttct 1500

tcctcctcct cttcctcttc ttcctctgct tcttcctctg cctcttcctc cttttctgag 1560

gaaggtgcgg ttggctacag ctctgactct gagaccctgg atctggaaga ggccgagggt 1620

gctgtgggct accagcctga gtattccaag ttctgccgca tgagctacca ggatccagct 1680

cagctctcat gcctgcccta cctggagcac gtgggccaca accacacata caacatggca 1740

cccagtgccc tggactcagc cgacctgcca ccacccagtg ccctcaagaa aggcagcaag 1800

gagaagcagg ctgacttcct ggacaagcag atgagccggg atgagcaccg agcccgagcc 1860