阅读说明：本技术 一种荧光有机硅纳米粒子的制备方法 (Preparation method of fluorescent organic silicon nano particles ) 是由 滕士勇 王吨卫 刘玲玲 王敏 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明的一种荧光有机硅纳米粒子的制备方法属于荧光纳米材料和生物成像纳米材料领域,具体步骤有提取植物有效成分、将植物提取与带有氨基的有机硅烷偶联剂反应、透析提纯等。本发明的方法步骤简单,原料易得、成本低,反应条件温和、能耗低,得到的有机硅纳米粒子具有荧光色彩丰富、发光稳定、抗光漂白、生物相融性好毒性低等优点。制备的荧光纳米粒子在生物成像领域具有良好的应用价值。(The invention discloses a preparation method of fluorescent organic silicon nano particles, belongs to the field of fluorescent nano materials and biological imaging nano materials, and specifically comprises the steps of extracting effective components of plants, reacting the extracted components with an amino-containing organic silane coupling agent, dialyzing, purifying and the like. The method has the advantages of simple steps, easily obtained raw materials, low cost, mild reaction conditions and low energy consumption, and the obtained organic silicon nano particles have the advantages of rich fluorescence colors, stable luminescence, photobleaching resistance, good biological compatibility, low toxicity and the like. The prepared fluorescent nanoparticles have good application value in the field of biological imaging.)

一种荧光有机硅纳米粒子的制备方法

技术领域

本发明属于荧光纳米材料和生物成像纳米材料领域，具体涉及一种荧光有机硅纳米材料的制备方法及其在生物成像领域中的应用。

背景技术

荧光生物成像是生物研究和临床诊断中应用最广泛、最强大的可视化技术之一，具有选择性、可视性和可调节性。为了更好地标记和追踪分子、细胞和组织的多级结构，需要引入具有强荧光、水分散性好、生物相容性好、低毒性、特别是抗光漂白特性的荧光探针。迄今为止，有机染料和荧光蛋白是荧光成像中应用最广泛的探针。但是荧光染料和蛋白在应用时最大的问题是在长时间光照时会经过光氧化漂白过程，进而发生荧光淬灭。这一问题限制了它们在长时间观测生物动力学行为的应用。合成具有发光稳定抗光漂白性能的荧光材料具有重大意义。

荧光有机硅纳米粒子作为一种新型的荧光纳米材料在生物成像领域具有广阔的前景。有机硅荧光纳米粒子具有发光量子产率高，抗光漂白，尺寸小，生物毒性低等优点。目前，这种新型材料的发光颜色较为单一，合成方法能耗高，材料成本较高。如Chen小组通过水热法合成的绿色荧光有机硅纳米粒子，水热法能耗较高，并且合成的粒子发光仅在绿色区域，不能满足生物成像对多色荧光探针的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服背景技术存在的不足，提供一种工艺简单，原料便宜易得，材料发光稳定性高，且荧光色彩丰富的荧光成像有机硅纳米材料的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种荧光有机硅纳米粒子的制备方法，有以下步骤：

(1)提取植物有效成分，所述的提取过程为将植物原料进行切碎、研磨、萃取、过滤、烘干，所述的植物有效成分为花青素、原花青素或酚类物质；

(2)将步骤(1)中提取的植物提取物配制成浓度为10～1000mg/mL的水溶液，并与带有氨基的有机硅烷偶联剂在50～100℃反应2～10小时，得到具有荧光的有机硅纳米粒子溶液；

(3)将步骤(2)中的有机硅纳米粒子溶液在透析袋中透析，得到纯净的荧光有机硅纳米粒子。

步骤(1)更具体的是，将植物原料充分切碎和研磨，用乙醇充分萃取3～5次、过滤3～5次、60℃～80℃真空干燥12～24小时，所述的植物原料可以为葡萄籽，玫瑰花瓣，黑枸杞，蓝莓表皮等。

在步骤(2)中，所述的有机硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS),(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES),N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO),二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(AEEA)等。

步骤(3)中，透析时使用超纯水，所用的透析袋截留分子量为500～5000，透析时间为10～30小时，每隔4～8小时换一次水。

本发明的目的还在于提供一种基于该制备方法的产物在生物细胞荧光标记中的应用，具体技术方案如下：

一种生物细胞荧光标记方法，按上述步骤(1)～(3)制备荧光有机硅纳米粒子，将制得的荧光有机硅纳米粒子与需要标记的生物细胞共同孵化，即可得到荧光有机硅纳米粒子标记的细胞，并在显微镜下观察细胞形态；所述的有机硅纳米粒子浓度为10～1000μg/mL，所述的生物细胞为哺乳动物体细胞或癌细胞，更具体地，可以是小鼠肾上腺皮质细胞、人甲状腺导管癌细胞、人组织细胞淋巴瘤细胞、***细胞等。

有益效果：

由于本发明的方法采用的是有机硅烷偶联剂与植物提取物在较低温度下加热得到的荧光纳米粒子，因此该方法步骤简单，原料易得、成本低，反应条件温和、能耗低。得到的有机硅纳米粒子具有荧光色彩丰富(具有红、橙、蓝、绿等多色)，发光稳定，抗光漂白，生物相融性好毒性低等优点。这种荧光纳米粒子能够用于观测静态细胞形态与长时间观测细胞动力学行为，在生物成像领域具有广泛的价值。

附图说明

图1是实施例1中黑枸杞提取物与APTMS反应得到红色荧光有机硅纳米粒子的荧光激发光谱和发射光谱。

图2为实施例1中红色荧光有机硅纳米粒子的高分辨透射电镜照片与粒径分布统计图。

图3是实施例2中葡萄籽提取物与APTES反应得到的蓝色-绿色荧光可调的有机硅纳米粒子的荧光激发光谱和发射光谱。

图4是实施例3中红色荧光有机硅纳米粒子标记的***细胞在不同激发时间的荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体的说明。

实施例1：红色荧光有机硅纳米粒子的制备过程

将100g黑枸杞粉碎并用研钵磨成粉末，溶解于100mL乙醇中，充分萃取2小时后，过滤去掉残渣，得到黑枸杞提取物溶液，萃取过程反复三次，将得到的溶液在真空干燥箱中烘干24小时，得到黑枸杞提取物(主要成分为花青素)。将5mL浓度为50mg/mL的黑枸杞提取物与1mL(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)混合，在50℃条件下搅拌反应5小时后，将混合液在截留分子量为1000的透析袋中透析18小时，得到红色荧光的有机硅纳米粒子。该粒子的发射峰在620nm，最佳激发波长为540nm，如图1所示。粒子的形貌和尺寸如图2所示，尺寸在3.5±0.5nm。

实施例2：蓝色-绿色荧光可调的有机硅纳米粒子制备过程

将50g葡萄籽碾碎研磨成粉末，溶解于50mL乙醇中，充分萃取5小时后，过滤去掉残渣，得到葡萄籽提取物溶液，萃取过程反复五次，将得到的溶液在真空干燥箱中烘干20小时，得到葡萄籽提取物(主要成分为酚类物质)。将10mL浓度为80mg/mL的葡萄籽提取物与1mL(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)混合，在60℃条件下搅拌反应3小时后，将混合液在截留分子量为2000的透析袋中透析24小时，得到荧光从蓝色到绿色可调的有机硅纳米粒子。该粒子的发射峰位随着激发波长的改变发生改变，当激发波长为360-420nm时，荧光颜色为蓝色(450-480nm)，当激发波长为440-500nm时，荧光颜色为绿色(500-560nm)。发射波长为460nm时的最佳激发波长为400nm。如图3所示。

实施例3：将红色荧光有机硅纳米粒子用于生物成像

首先，将***细胞(HeLa细胞)接种于12孔板中，在37℃、5％CO₂条件下于培养液中孵育12小时。用PBS缓冲溶液(0.1M)清洗细胞三次去掉培养液。用100μg/mL的红色荧光有机硅纳米粒子与细胞共同孵化30分钟。用PBS缓冲溶液(0.1M)清洗细胞三次去掉多余红色荧光探针。然后，将细胞样本放在荧光显微镜下观察。1000w汞灯作为激发光源，用带通滤光片BP510-550(绿光)激发荧光探针观察细胞荧光图像。发射通道采用带通滤光片BA575-625(红光)。经过30min的照射，细胞中的红色探针发光依旧很强，不同时间细胞的荧光照片如图4所示。