阅读说明：本技术 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用 (Method for reducing tandem connection of double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) fragments in CRISPR-Cas9 gene editing and application thereof ) 是由 官敏 朱石磊 林梓凡 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。所述方法包括如下步骤：在双链DNA的5′端连接自杀基因,3′端连接自杀基因的启动子,再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合,转入待编辑的细胞中完成CRISPR-Cas9基因编辑。将自杀基因元件及其启动子元件分别连接在dsDNA的两端,当发生DNA串联时,启动子和自杀基因串联在一起,诱导自杀基因表达,从而杀死宿主细胞,使宿主细胞死亡从而消除DNA串联现象。(The invention provides a method for reducing tandem connection of double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) fragments in CRISPR-Cas9 gene editing and application thereof. The method comprises the following steps: connecting a suicide gene at the 5 'end of the double-stranded DNA, connecting a suicide gene promoter at the 3' end, mixing the double-stranded DNA with a CRISPR-Cas9 reaction system, and transferring the double-stranded DNA into a cell to be edited to finish CRISPR-Cas9 gene editing. The suicide gene element and the promoter element thereof are respectively connected to two ends of dsDNA, when the DNA tandem connection occurs, the promoter and the suicide gene are connected in series to induce the suicide gene to express, thereby killing host cells, leading the host cells to die and eliminating the DNA tandem connection phenomenon.)

一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及 其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，涉及一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法。

背景技术

***基因（suicide gene），是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的产物为毒性物质或可催化无毒的前体转变为毒性物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为***基因。DTA和TK是真核细胞中常用的两种***基因，其中DTA无需添加底物即可产生毒性物质，TK需要添加底物才会起到***作用。目前***基因常用来***、感染性疾病，基因工程中也常作为负筛选。

随着人们对非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组（Homologous recombination，HR）这两种修复方式的深入研究和解读，DNA修复机制被逐渐应用于基因编辑技术，用于定向改造基因。研究者采用核酸酶技术使DNA双链有目的性的产生断裂，利用这一机制调控目的基因表达或引入选择性标记。

CRISPR-Cas9介导的同源定向DNA修复是在包括小鼠和人类在内的多种模式生物中进行精确基因编辑的首选方法。Cas9蛋白剪切DNA双链形成DNA双链断裂（Double strandbreaks，DSBs），利用NHEJ修复机制，随机缺失或***碱基造成移码突变，目的基因实现敲除；在剪切同时引入一段外源基因，NHEJ会将其接入DSBs位点，实现基因***；或者在两端分别设置剪切位点，中间片段游离，两端通过NHEJ机制连接形成大片段基因敲除。同时，在剪切的同时加入带外源基因及同源序列，HR机制作用下可实现基因定点精确的敲进和替换。目前生物医学界广泛使用了这种方法，使其编辑更加高效和序列更加特异型。

尽管如此，该技术仍然存在缺陷。有研究发现，在六种不同条件敲除小鼠模型的建立过程中，供体DNA模板出现多次不必要的头尾串联现象。在大多数情况下，传统的PCR分析未能识别出这些多重整合事件，这严重影响了该技术的精确性（详见Skryabin BV, et al.Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events. Sci Adv. 2020;6(7):eaax2941.）。

在CRISPR-Cas9基因打靶过程中，重组DNA片段存在头对尾的串联现象，串联导致基因打靶失败。本领域通常用Southern、qPCR、PCR等方法检测是否有串联，但是尚未见有效的减少串联的方法。

因此，利用***基因来降低CRISPR-Cas9基因打靶中重组DNA片段的串联率，对CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展和完善具有重要的意义。

发明内容

***基因（suicide gene），是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的产物为毒性物质或可催化无毒的前体转变为毒性物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为***基因。DTA和TK是真核细胞中常用的两种***基因，其中DTA无需添加底物即可产生毒性物质，TK需要添加底物才会起到***作用。目前***基因常用来***、感染性疾病，基因工程中也常作为负筛选。

随着人们对非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组（Homologous recombination，HR）这两种修复方式的深入研究和解读，DNA修复机制被逐渐应用于基因编辑技术，用于定向改造基因。研究者采用核酸酶技术使DNA双链有目的性的产生断裂，利用这一机制调控目的基因表达或引入选择性标记。

CRISPR-Cas9介导的同源定向DNA修复是在包括小鼠和人类在内的多种模式生物中进行精确基因编辑的首选方法。Cas9蛋白剪切DNA双链形成DNA双链断裂（Double strandbreaks，DSBs），利用NHEJ修复机制，随机缺失或***碱基造成移码突变，目的基因实现敲除；在剪切同时引入一段外源基因，NHEJ会将其接入DSBs位点，实现基因***；或者在两端分别设置剪切位点，中间片段游离，两端通过NHEJ机制连接形成大片段基因敲除。同时，在剪切的同时加入带外源基因及同源序列，HR机制作用下可实现基因定点精确的敲进和替换。目前生物医学界广泛使用了这种方法，使其编辑更加高效和序列更加特异型。

尽管如此，该技术仍然存在缺陷。有研究发现，在六种不同条件敲除小鼠模型的建立过程中，供体DNA模板出现多次不必要的头尾串联现象。在大多数情况下，传统的PCR分析未能识别出这些多重整合事件，这严重影响了该技术的精确性（详见Skryabin BV, et al.Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events. Sci Adv. 2020;6(7):eaax2941.）。

在CRISPR-Cas9基因打靶过程中，重组DNA片段存在头对尾的串联现象，串联导致基因打靶失败。本领域通常用Southern、qPCR、PCR等方法检测是否有串联，但是尚未见有效的减少串联的方法。

因此，利用***基因来降低CRISPR-Cas9基因打靶中重组DNA片段的串联率，对CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展和完善具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA（dsDNA）片段串联的方法，所述方法包括如下步骤：在双链DNA的5′端连接***基因，3′端连接***基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞，完成CRISPR-Cas9基因编辑。

为了减少CRISPR-Cas9基因编辑过程中出现的串联现象，本发明中通过将启动子与***基因分别加在dsDNA的两侧，即将***基因连接在dsDNA的5′端，***基因的启动子连接在dsDNA的3′端。若两个dsDNA串联，则位于3′端的启动子与5′端的***基因会连接，从而表达***基因，导致细胞将无法存活，从而降低CRISPR-Cas9基因编辑过程中的串联率。

作为本发明优选的技术方案，所述***基因包括DTA或TK。

优选地，所述***基因的启动子包括CAG、CMV、EF1a或PGK中的任意一种。

优选地，所述***基因为DTA，所述***基因的启动子为CMV。

本发明中，对于***基因与***基因的启动子的种类并不作具体的限制。凡是能够产生杀死受体细胞的作用的***基因与***基因的启动子都可以使用。优选地，所述***基因的核苷酸序列（DTA基因）如SEQ ID NO.1所示，所述***基因的启动子（CMV基因）的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，SEQ ID NO.1为：

ATGGATCCTGATGATGTTGTTATTCTTCTAATCTTTTGTATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCTCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAA；

SEQ ID NO.2为：

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC。

本发明中，以DTA基因作为***基因，以CMV作为启动子时，所得基因编辑方法的串联效率较低，能够有效地启动并杀死受体细胞。

作为本发明优选的技术方案，所述dsDNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10 ng/μL，例如可以是2 ng/μL、3 ng/μL、4 ng/μL、5 ng/μL、6 ng/μL、7 ng/μL、8 ng/μL、9 ng/μL或10 ng/μL等。

优选地，所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和Cas9 mRNA。

作为本发明优选的技术方案，所述sgRNA的工作浓度为2~8 ng/μL，例如可以是2ng/μL、3 ng/μL、4 ng/μL、5 ng/μL、6 ng/μL、7 ng/μL或8 ng/μL等。

优选地，所述Cas9 mRNA的工作浓度为5~15 ng/μL，例如可以是5 ng/μL、6 ng/μL、8 ng/μL、10 ng/μL、12 ng/μL、14 ng/μL或15 ng/μL等。

本发明中，所述CRISPR-Cas9反应体系用于基因编辑，包括基因***和基因敲除等，所述反应体系的工作浓度和具体成分会对基因编辑的效率产生影响。因此，本发明中以上述工作浓度配合带有***基因和启动子的dsDNA，导入待编辑的细胞后，能够更加精准的实现基因打靶，降低串联率，降低脱靶概率，提高成功率。

本发明中，为了进一步降低串联率，还可以在连接***基因和启动子的基础上，进一步连接限制性内切酶I和限制性内切酶II的酶切位点，即所述双链DNA由限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。

需要注意的是，本发明中所述的“同向突出非同尾酶”指的是，在限制性内切酶I切割双链DNA的5′端、限制性内切酶II切割双链DNA的3′端时，限制性内切酶I和II得到的粘性末端均是从5′-3′或均是从3′-5′，且粘性末端的序列无法互补配对，例如BamH1和Xba1即为一对同向突出非同尾酶；本发明中所述的“非同向突出酶”指的是，在限制性内切酶I切割双链DNA的5′端、限制性内切酶II切割双链DNA的3′端时，限制性内切酶I和II得到的粘性末端不同向，例如BamH1和Sac1即为一对非同向突出酶。

优选地，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为非同向突出酶，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为5′-3′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′；

或者，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为非同向突出酶，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为3′-5′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′。

作为本发明优选的技术方案，所述待编辑的细胞包括小鼠受精卵。

作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：

在双链DNA的5′端连接***基因，3′端连接***基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合；其中，所述CRISPR-Cas9反应体系中sgRNA的工作浓度为2~8ng/μL，Cas9 mRNA的工作浓度为5~15 ng/μL，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10 ng/μL；而后，转入小鼠受精卵中，得到基因编辑后的受精***。

示例性地，本发明提供的方法包括如下步骤：

首先，设计双链DNA的核酸序列，在双链DNA的5′端连接***基因，3′端连接***基因的启动子，同时在两端连接酶切位点；

而后将双链DNA克隆到pUC57或pBlueScript载体中，所述载体使用质粒提取试剂盒纯化，使用任意限制性内切酶将包含供体DNA模板的序列切割下来；

再用1%琼脂糖凝胶电泳分离供体dsDNA片段，使用胶回收试剂盒纯化，保存于ddH₂O中；

再将dsDNA与CRISPR-Cas9反应体系混合注射到小鼠的受精***中，本发明中，可以在M2培养基中，使用转射器和微操作器在倒置显微镜上进行细胞显微微注射；

注射存活的受***被转移到假妊娠小鼠的输卵管中，并进行足月妊娠；

用PCR分析从尾部活检组织中分离出的基因组DNA，鉴定出阳性靶向的F0动物。

第二方面，如第一方面所述的方法在构建CRISPR-Cas9基因编辑方法中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明中，将***基因元件及其启动子元件分别连接在dsDNA的两端，当发生DNA串联时，启动子和***基因串联在一起，诱导***基因表达，从而杀死宿主细胞，使宿主细胞死亡从而消除DNA串联现象。将该方法应用于CRISPR-Cas9基因编辑中时，能够明显减低串联率，同时使用该方法编辑小鼠受精卵时，并不影响其编辑的成功率，生崽率较之前未明显降低但是串联率由35.5~50%下降到6.3~15.4%，大大地降低了基因编辑过程中的串联现象。

附图说明

图1为实施例1中构建的dsDNA片段的结构示意图。

图2为实施例1中将dsDNA注射至原核时的显微图片。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，雌鼠（C57BL/6JGpt，4周龄）、雄鼠（C57BL/6JGpt，>8周龄）：均产自江苏集萃药康生物科技有限公司；

以下实施例中，所用试剂包括：透明质酸酶工作液、DPBS工作液、注射缓冲液、PMSG/HCG工作液、M16、M2、75%酒精、矿物油；所用仪器包括：倒置显微镜、显微操作系统、微型装样器、拉针仪、煅针仪、CO₂培养箱、冰箱、体视显微镜；所用耗材包括：GD-1玻璃针、微量加样器、3.5cm dish、固定管、移卵管、1mL 注射器、手术器械等；均可由常规渠道购得。

以下实施例中，除具体说明外，其余操作步骤均可采用本领域常见的技术手段进行，例如酶切、纯化等步骤。

实施例1

本实施例中，提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法。

（1）构建dsDNA

本实施例中构建的dsDNA的结构示意图如图1所示；

将DTA正向放于dsDNA的5′端，CMV正向放于dsDNA 3′端，同时dsDNA片段两端含有EcoRV的酶切位点；

将设计好的序列构建在质粒（Plasmid）载体上，并采用EcoRV酶切并纯化，得到dsDNA；

其中，酶切体系为EcoRV 3 μL、质粒25 μL（浓度为2 μg/μL）、Buffer smart 10 μL、ddH₂O补足至100 μL；

酶切过程为：时间8 h；温度37℃；

酶切结束后纯化回收，并用TE buffer稀释dsDNA至5 ng/uL。

（2）小鼠受精卵显微注射

获取受精卵，制备固定管和注射管，准备操作皿和培养皿，再将注射样品用微量加样器加入到注射管中；

注射过程如下：

1、将注射管和固定管装入操作手臂；

2、将在M16中培养的受精卵转移入准备好的M2液滴中，并且排成一长列；

3、将注射碟子放在倒置显微镜的载物台上；

4、将注射管和固定管伸入M2液滴中，并置于视野中央；

5、打开注射器，在注射管管中产生一个恒定压力，并将显微镜调到能够清楚的看到原核；

6、用固定管吸住一个卵子，用注射管调整其位置，使原核清晰可见；

7、将注射管刺入原核，打入DNA混合体系，如图2所示；

8、用注射管将卵子推向下方或上方，并吸住一个新的卵子进行注射，如此重复直到全部卵子注射完毕；

9、注射结束后将胚胎转移至含有M16培养将存活的受精卵移植到假孕受体输卵管内；

（3）移植、繁育与鉴定

将上述培养的受精卵移植到***小鼠的输卵管中，约20天后F0小鼠出生；出生一周后剪尾，提取鼠尾基因组，进行PCR与测序鉴定，统计串联率。

实施例2

本实施例中将DTA正向放于dsDNA的5′端，CMV正向放于dsDNA 3′端，同时，dsDNA片段两端含有BamH1和Sac1的酶切位点，将设计好的序列构建在质粒载体上，并采用BamH1和Sac1酶切并纯化，得到dsDNA。

酶切体系为：BamH1 3 μL、Sac1 3 μL、质粒25 μL（浓度为2 μg/μL）、Buffer smart10 μL、ddH₂O补足至100 μL；酶切过程：时间8 h；温度37℃；

小鼠受精卵显微注射的步骤同实施例1。

对比例1

与实施例1的区别在于，所述基因的两端不含有启动子CMV和***基因DTA，其余操作步骤与实施例1相同。

对比例2

与实施例2的区别在于，所述基因的两端不含有启动子CMV和***基因DTA，其余操作步骤与实施例2相同。

串联率统计

按照上述实施例和对比例提供的方法，注射400枚小鼠受精卵，移植后培养，出生F0小鼠，对F0小鼠进行PCR检测串联。

检测原理为：在dsDNA两端设计向外侧的PCR引物，如片段不串联则无产物，如串联则会扩增出产物，此处统计的串联率为串联小鼠/阳性小鼠；

PCR及串联结果如表1所示：

表1

由上表结果可知，本发明提供的方法能够明显降低串联率，其串联率由50%下降到6.3%。虽然，从理论上而言，本发明中串联***基因表达不应该出现任何串联现象，但是，通过实验发现，细胞内酶会消化dsDNA两端的CMV和DTA，因此，在这两个表达元件不完整时，***基因就无法表达，因此导致实际实验过程中，仍然有少量的串联现象发生；同理，同向非同尾或非同向内切酶，理论上也不会串联，但在实际实验中发现细胞内酶会将突出末端抹平，然后实现串联。综上所述，本发明将***基因及其启动子分别设计在双链DNA的两端，可以明显地降低串联率，同时，若使用不同粘性末端内切酶酶切可进一步降低串联率。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司

<120> 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用

<130> 20200722

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggatcctg atgatgttgt tattcttcta atcttttgta tggaaaactt ttcttcgtac 60

cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct 120

ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac 180

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