阅读说明：本技术 聚球藻源富钙纳米多聚磷酸体补钙剂及其制备方法 (Calcium supplement of calcium-rich nano poly-phosphate from synechococcus and preparation method thereof ) 是由 吴浩浩 曾名湧 杨益盛 冯一农 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚球藻源富钙纳米多聚磷酸体(PPB-Ca)补钙剂及其制备方法,其制备方法,包括下列步骤：采用钙强化medium A培养基(钙浓度为300-1500 mg/L)培养聚球藻至对数后期,收集藻体,现用或冷冻保藏；将藻体置于沸水中抽提5-30 min,离心后取上清,获得藻体水提物；将藻体水提物进行葡聚糖凝胶(Sephadex G50/G75/G100/G150)柱层析,收集排阻峰组分；对排阻峰组分进行超滤(截留分子量3-10 KDa)浓缩后,冻干,即得PPB-Ca样品。本发明中PPB-Ca是粒径约为30-120 nm的球形微粒,在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运,在大鼠口服药物代谢动力学和骨质疏松模型中也表现出良好的生物可利用性,尤其在对抗植酸对钙吸收的抑制作用方面效果显著,故PPB-Ca是一种理想的微藻源补钙剂,可应用于素食习惯导致的钙缺乏人群的营养强化和营养补充。(The invention discloses a calcium supplementing agent of calcium-rich nano polyphosphate (PPB-Ca) of synechococcus source and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: culturing synechococcus pluvialis by adopting a calcium-enhanced medium A culture medium (the calcium concentration is 300-; extracting algae in boiling water for 5-30 min, centrifuging, and collecting supernatant to obtain algae water extract; subjecting the algae water extract to Sephadex G50/G75/G100/G150 column chromatography, and collecting the components with exclusion peak; and (3) performing ultrafiltration (the cut-off molecular weight is 3-10 KDa) on the exclusion peak components, concentrating, and freeze-drying to obtain the PPB-Ca sample. The PPB-Ca is spherical particles with the particle size of about 30-120nm, can be efficiently absorbed and transported in an endocytosis mode in a mouse in-vitro ligated intestinal segment, has good bioavailability in a rat oral pharmacokinetics and osteoporosis model, and particularly has a remarkable effect on resisting the inhibition effect of phytic acid on calcium absorption, so the PPB-Ca is an ideal microalgae source calcium supplement and can be applied to the nutrition strengthening and nutrition supplement of people with calcium deficiency caused by vegetarian habits.)

聚球藻源富钙纳米多聚磷酸体补钙剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚球藻源富钙纳米多聚磷酸体（PPB-Ca）补钙剂的制备方法及其用途。

背景技术

钙是人体中最丰富的必需矿物质元素，在骨骼及牙齿结构、血液凝结、神经传递、肌电生理学、内外分泌等方面具有多种生理作用，享有“生命元素”的美誉。根据年龄和生理状况，4岁以上个人的膳食推荐钙摄入量为1000至1300 mg/d。据报道，到2011年，全球仍然有约35亿人由于钙摄入不足（684 ± 211 mg/d）而面临钙缺乏的风险，尤其是在非洲和亚洲。除了钙摄入量不足之外，饮食中的钙吸收抑制剂（尤其是植酸）引起的钙吸收不良也是造成钙缺乏重要原因。钙缺乏会导致继发性甲状旁腺功能亢进，与骨质疏松症的发病机理和低骨量密切相关。因此，开发出一款能够耐受植酸等抑制剂的钙营养强化剂显得尤为迫切。纳米钙具有良好的“溶解性”（即能够形成稳定的胶体溶液），且相对于离子钙而言，较为耐受植酸等抑制剂的不利影响，故纳米钙是一类较为理想的补钙剂。

多聚磷酸盐是一种无毒的大分子聚合物，适合作为“软模板”在温和条件下生物矿化合成矿物质纳米微粒。生物矿化合成的纳米粒具有更好的胶体稳定性，故非常适合于纳米矿物质营养补充剂或强化剂的生产。多聚磷酸盐在生物细胞中由多聚磷酸盐激酶催化合成，常以一种纳米或亚微米尺度（15-200 nm）的包涵体——多聚磷酸体（PPB）的形态存在于细胞中。PPB中的阳离子种类通常以钙为主，因此PPB作为矿物质营养元素钙的载体，具有开发成为一种天然纳米钙营养补充剂或强化剂的潜力，但目前国内外还没有相关的研究报道。

聚球藻7002是一种单细胞海洋蓝细菌，有多种适用于生物技术和食品工业应用的优良特征，例如，能够以多种方式（包括光合自养、异养和混合培养）进行生长，具有广盐性和耐高光性，倍增时间非常短（< 4 h），未被发现分泌任何蓝藻毒素或具有相关的同源基因，利用廉价海水作为培养基的光合发酵不侵占耕地、粮食、淡水和化石能源等。PPB在聚球藻7002中以纳米颗粒的形态存在。因此，聚球藻7002是一种理想的生产新型纳米PPB矿物质营养补充剂或强化剂的细胞工厂。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的聚球藻源PPB-Ca补钙剂及其制备方法。

本发明所要解决的技术问题是：利用聚球藻7002制备一种纳米钙补钙剂，成分为PPB-Ca。

实现本发明目的采取的技术方案如下：

采用钙强化medium A培养基培养聚球藻7002至对数后期，收集藻体；通过热水抽提得到藻体水提物，并利用葡聚糖凝胶柱层析对其进行分离，收集排阻峰组分；对排阻峰组分进行超滤浓缩后，冻干，即得PPB-Ca样品。

聚球藻源PPB-Ca补钙剂的制备方法，具体包括下列步骤：

（1）采用钙强化medium A培养基（钙浓度为300-1500 mg/L）培养聚球藻，至对数后期时采收藻体。

（2）通过热水抽提法获得藻体水提物，即将藻体置于沸水中抽提5-30 min，冷却至室温，离心后收集上清即为藻体水提物。

（3）使用葡聚糖凝胶柱层析（Sephadex G50/G75/G100/G150）对藻体水提物进行分离，收集排阻峰组分；

（4）对步骤（3）排阻峰组分进行超滤浓缩后，冻干，即得PPB-Ca样品。

优选的，本发明步骤（1）钙强化medium A培养基中钙浓度为0.81g/L，培养至对数后期时，聚球藻生物量和PPB-Ca产量为最佳水平。

进一步的，本发明步骤（2）的热水抽提时间最佳范围为10-15 min。时间较短，对PPB提取不够充分；时间太长，会一定程度上破坏其多聚磷酸盐长链结构，降低PPB-Ca的得率。

进一步的，本发明步骤（3）的葡聚糖凝胶最佳规格型号为Sephadex G100。Sephadex G50/G75去除小分子杂质的效果略差，Sephadex G150的实验效率略低。

优选的，本发明步骤（4）的超滤膜截留分子量范围为3-10 KDa。截留分子量小于3KDa的超滤膜，浓缩效率较低；截留分子量大于10 KDa的超滤膜，会有部分粒径较小的PPB穿过，降低PPB-Ca的得率。

本发明的有益效果：

本发明中PPB-Ca是粒径约为30-120 nm 的球形微粒，在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运，在大鼠口服药物代谢动力学和骨质疏松模型中也表现出良好的生物可利用性，尤其在对抗植酸对钙吸收的抑制作用方面效果显著，故PPB-Ca是一种较为理想的微藻源补钙剂，可应用于素食习惯导致的钙缺乏人群的营养强化和营养补充。

附图说明

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

和有益效果作进一步详细的说明。

图1 PPB-Ca的结构表征。a）动态光散射计数率；b）多分散指数；c）水合粒径分布；d）Zeta电位；e）透射电镜图；f）扫描电镜图；g）能谱图。

图2 体外结扎小鼠肠段对PPB-Ca的吸收转运效果。a）PPB-Ca在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的效果；b）内吞抑制剂对PPB-Ca在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的影响。不同上标字母（a-e）表示具有统计学意义的显著差异（P < 0.05）。注：2-APB：2-氨基乙基二苯硼酸盐。

图3 口服不同种类钙源的大鼠药代动力学曲线。

图4 灌胃不同种类钙源对骨质疏松大鼠a）血清钙、b）血清磷、c）血清骨钙素（OCN）和d）骨源性碱性磷酸酶（BALP）水平的影响。不同上标字母（a-d）表示具有统计学意义的显著差异（P < 0.05）。

图5 口服不同种类钙源的骨质疏松大鼠的a）骨矿物质含量（BMC）和b）骨矿物质密度（BMD）的定量分析。不同上标字母（a-d）表示具有统计学意义的显著差异（P < 0.05）。

图6 大鼠股骨的扫描电镜（SEM）观察，每组图片都是通过表面形貌来定义骨骼的代谢状态：a）空白对照组；b）钙离子组；c）钙离子+植酸组；d）PPB-Ca组；e）PB-Ca+植酸组；f）碳酸钙组。

具体实施方式

实施例1本实施例提供一种基于聚球藻源纳米多聚磷酸体的补钙剂及其制备过程。

具体技术方案步骤如下：

（1）采用钙强化medium A培养基（钙浓度为0.81g/L）培养聚球藻，至对数后期时采收藻体。

（2）通过热水抽提法获得藻体水提物，即将藻体置于沸水中抽提10 min，冷却至室温，离心后收集上清即为藻体水提物。

（3）使用Sephadex G100葡聚糖凝胶柱层析对藻体水提物进行分离，收集排阻峰组分。

（4）对步骤（3）排阻峰组分进行超滤（截留分子量3 KDa）浓缩后，冻干，即得PPB-Ca样品。

实施例2 实施例1制备的聚球藻源纳米钙补钙剂的实验结果

本实施例的相关实验是以实施例1中聚球藻源PPB-Ca补钙剂为基础进行的。具体为：

（一） PPB-Ca的结构表征，具体实验过程和实验结论如下：

图1中，a）是动态光散射计数率；b）是多分散指数；c）是水合粒径分布；d）是Zeta电位；e）是透射电镜图；f）是扫描电镜图；g）是能谱图。

动态光散射的分析使用激光粒度分析仪(Malvern Nano ZS)，633 nm He-Ne激光器，在25±0.1 ℃下，恒定散射角为90°。结果显示，PPB-Ca浓缩液具有明显的散射光信号（见图1a）、相对较小的多分散指数（见图1b）和较稳定的电位分布（见图1d）。水合粒径分布显示，PPB-Ca的粒径多集中在80 nm左右处（见图1c）。将PPB-Ca溶液滴加到碳涂层铜网上，风干，然后使用JEM-2100Plus透射电镜设备在200 kV下进行观察发现，它们是大约30-120nm球形纳米颗粒。对PPB-Ca粉末进行喷金处理，并使用TESCAN VEGA3设备在20 kV下进行检查，整个区域的扫描电镜图像显示这些纳米颗粒为近似球形（见图1e、图1f）。选定区域的EDS分析揭示了这些纳米粒子中主要的元素信号为钠、钾、镁、钙、氧、磷和碳（见图1g）。其中钙磷比约为0.45。

（二）体外结扎小鼠肠段对PPB-Ca的吸收转运效果，具体实验过程和实验结论如下：

结果见图2，a）是PPB-Ca在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的效果；b）是内吞抑制剂对PPB-Ca在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的影响。注：2-APB：2-氨基乙基二苯硼酸盐。NaN₃：叠氮钠。

7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，并饲养在有空调的温度为20-24 ℃，湿度为55-65％，12h/12h亮/暗循环的动物房内，给动物投喂AIN-93G标准饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司），超纯水自由饮用，实验前适应7 d。获得中国海洋大学动物实验伦理委员会批准(批准号:SPXY20180929)。

实验前将小鼠食物取出，禁食12 h。颈部脱臼使小鼠安乐死，剪开腹部后在距回盲连接点14和20 cm处切下一块回肠，用HBSS冲洗掉肠道内容物后放入37 ℃的HBSS培养基中预热一段时间。用HBSS冲洗掉肠道内容物后放入37 ℃的HBSS培养基中预热一段时间。在一端结扎后，将0.35 mL溶于HBSS的PPB-Ca中性溶液灌入肠段，使用化工合成的短链polyPs-Ca作为对照。然后结扎另一端，将回肠放入含有2 mL HBSS的24孔细胞培养板中于温度37°C、振荡频率为50 rpm/min的培养箱中孵育1 h。孵育完成后，取肠外培养基稀释相应倍数过0.22 μm滤膜后，使用火焰原子吸收光谱法测定钙浓度。另外在PPB-Ca基础上分别添加植酸（0 或1 mM），阿米洛利（0或2 mM），叠氮钠（0或10 mM），2-APB（0或100 μM），氯喹啉（0或100μM）和渥曼青霉素（0或1 μM），考察在植酸存在条件下PPB-Ca中钙的吸收效果以及内吞抑制剂对PPB-Ca吸收转运的影响。

如图2a所示，在体外结扎的小鼠肠段中，采用HBSS体系时，PPB-Ca的跨膜转运速率稍慢于CaCl₂，但当HBSS中添加植酸盐（1 mM）时（钙与植酸的摩尔比参照人们经常食用的全麦面包中比例）， CaCl₂的吸收受到了显著抑制，而PPB-Ca的吸收速率则高于CaCl₂，表明PPB-Ca较易被肠道吸收转运，特别是存在植酸抑制剂时，能够比离子钙更容易被吸收和转运。化学合成的链长为25的多聚磷酸盐合成的纳米多聚磷酸钙，称为PolyP-Ca，在HBSS体系中，吸收速率与PPB-Ca相当，但当HBSS中添加植酸盐时，吸收速率显著小于PPB-Ca，表明聚球藻源PPB-Ca比化学合成的PolyP-Ca对抗植酸的效果更好，可能与聚球藻源PPB中多聚磷酸盐的链长更长，且包覆一定的蛋白或多糖等有机成分有关。

瞬时受体阳离子通道亚家族V成员6（transient receptor potential cationchannel, subfamily V, member 6, TRPV6）为瞬时性受体电位通道的亚家族成员，是高选择性的Ca²⁺跨膜转运通道，主要负责Ca²⁺由细胞外向细胞内的主动跨膜运输。据文献报道，在瞬时和稳定转染的HEK293细胞中，使用荧光成像、膜片钳和放射性示踪技术可以通过2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-APB）抑制人上皮钙通道TRPV6。本研究中，2-APB的加入显著地降低了肠道对钙的摄取效率（P < 0.05），同时典型的三磷酸腺苷水解抑制剂叠氮钠（NaN₃）也显著地降低了PPB-Ca中钙吸收的有效性（P < 0.05，见图2b）。这说明少量PPB-Ca会在小肠上皮表面发生降解，释放出钙离子，通过TRPV6通道以主动运输的方式进入细胞内，这也是个能量消耗的过程，而叠氮钠的部分抑制也说明PPB-Ca存在着另外一种内吞的途径。

（三）口服PPB-Ca的大鼠药代动力学实验，具体实验过程和实验结论如下：

4-5周龄、体重130 -150 g的雄性SD大鼠购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养在有空调的温度为20-24 °C，湿度为55-65％，12h/12h亮/暗循环的动物房内，每2只一笼。给动物喂食粒状食物，饲料为AIN-93G标准饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司），超纯水随意饮用，实验前适应7 d。大鼠根据体重被随机分为6组，每组8只。实验前将大鼠食物取出，禁食12 h，各组大鼠灌胃现制的生理盐水、氯化钙、氯化钙+植酸、PPB-Ca、PPB-Ca+植酸、碳酸钙五组样品。于0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h等7个时间点尾部静脉取血20μL，稀释到1.5 mL后使用原子吸收光谱法测定血浆钙含量。期间禁食，超纯水自由摄取，并保证适宜温度和湿度。利用软件绘制药物代谢动力学曲线，分析最大达峰时间、最高浓度、曲线下面积等参数。结果如表1所示。

表1. 口服不同种类钙源的大鼠药代动力学的相关参数

钙源	钙摄入剂量 (mg/kg 体重)	最大达峰时间 (h)	最高浓度 (μmol/L)	曲线下面积(μmol/L.h)
					CaCl<sub>2</sub>	200	30	70.03±3.6	170.447±2.6
CaCl<sub>2</sub>+PA	200	30	60.09±2.2	161.525±2.2
					PPB	200	45	66.59±2.8	169.825±2.9
PPB+PA	200	45	63.12±3.4	165.675±1.8
					CaCO<sub>3</sub>	200	60	59.41±2.7	160.575±2.5

注：PA为植酸盐缩写。

这些结果表明，PPB-Ca与CaCl₂具有相当的肠道钙吸收效果，当植酸存在时，CaCl₂的肠道钙吸收受到显著抑制，而PPB-Ca的钙吸收效果则显著高于CaCl₂，表明PPB-Ca比离子钙更耐受植酸对钙吸收的抑制作用。

（四）灌胃不同种类钙源对骨质疏松模型大鼠a）血清钙、b）血清磷、c）血清骨钙素（OCN）和d）骨源性碱性磷酸酶（BALP）水平的影响，具体实验过程和实验结论如下。

图4显示，在骨质疏松大鼠模型中，血清中钙和磷含量的变化反映着骨钙和骨磷流失的情况，通常与骨密度呈负相关。不同种类钙源对血清钙和血清磷的影响如图4a, b所示。结果显示，PPB-Ca与CaCl₂组的大鼠血清中血清钙与血清磷含量较低，接近于空白对照组，显著低于CaCO₃组。当有植酸存在的条件下，CaCl₂组的大鼠对钙的吸收受到明显抑制，PPB-Ca则可以有效地对抗植酸的抑制作用，保持血清中钙磷的平衡，表明PPB-Ca在一定程度上阻止了骨流失，对骨质疏松大鼠具有良好的改善效果。

骨钙素（osteocalcin，OCN）是成骨细胞的一种特殊产物，是骨的维生素k依赖蛋白。其中小部分不会在骨骼中积累，而是直接分泌到血液循环中。血清骨钙素在调节骨钙代谢中起重要作用，对骨质疏松综合征、钙代谢异常等疾病诊断有重要价值。骨特异性碱性磷酸酶（BALP）是一种与骨形成和矿化相关的膜外酶，可直接反映成骨细胞的活性或功能状况。结果显示，PPB-Ca组大鼠具有相对较高的OCN和较低的BALP（见图4c,d），在存在植酸时，仍具有较好的肠道吸收效果，并有效地改善了维甲酸诱导的骨质疏松症。这些结果验证了体外肠段试验和药代动力学试验的结论，即PPB-Ca的吸收效果与CaCl₂相当，并且存在植酸时，能够比离子钙更容易被吸收和转运。另外，如表2和表3所示，股骨重量、长度及直径的结果也印证了上述结论。

表2. 各组大鼠股骨的重量和长度

表3. 各组大鼠股骨直径

（五） 口服不同种类钙源的骨质疏松大鼠的a）骨矿物质含量（BMC）和b）骨矿物质密度（BMD）的定量分析。

骨矿物质分析也显示了一致的结果。骨矿物质含量（BMC）和骨密度（BMD）是骨质疏松症诊断的重要指标，是骨流失的反映。BMD的量化结果显示（见图5），在存在植酸的条件下，CaCl₂和CaCO₃组股骨BMC和BMD明显低于其他四组（P < 0.05）。即使在高浓度植酸存在的情况下，PPB-Ca也可以大幅度恢复维甲酸诱导的骨质疏松大鼠的骨矿物质含量和密度，说明PPB-Ca在复杂的食物基质中仍然具有较好的吸收和利用。

（六） 大鼠股骨的扫描电镜（SEM）观察，每组图片都是通过表面形貌来定义骨骼的代谢状态：a）空白对照组；b）钙离子组；c）钙离子+植酸组；d）PPB-Ca组；e）PB-Ca+植酸组；f）碳酸钙组。

本研究中，采用SEM观察不同种类钙源对骨代谢活性的影响。如图6所示，对照组和阳性对照CaCl₂组骨表面光滑，说明骨稳定，未发生骨形成和再吸收，被扁平的成骨细胞所覆盖。对于CaCl₂+植酸组和阴性对照CaCO₃组，骨表面由于破骨细胞的骨吸收而成扇形和多孔结构，表面吸收腔较多。经口服PPB-Ca和PPB-Ca+植酸后，与上述两组相比，扇贝区明显减少，代谢活性得到显著改善。

以上结果表明，口服PPB-Ca显著降低了大鼠血清中钙、磷和骨特异性碱性磷酸酶的浓度，提高了血清骨钙素、股骨矿物质含量及骨密度，增加了大鼠股骨重量、长度及直径，改善了骨代谢活性，对维甲酸诱导的骨质疏松大鼠具有较好的改善效果，说明PPB-Ca可以比钙离子更有效地对抗植酸对钙吸收的抑制作用，在动物体内具有较好的生物利用率。

本发明中PPB-Ca是粒径约为30-120 nm 的球形微粒，在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运，在大鼠口服药物代谢动力学和骨质疏松模型中也表现出良好的生物可利用性，尤其在对抗植酸对钙吸收的抑制作用方面效果显著，故PPB-Ca是一种较为理想的微藻源补钙剂，可应用于素食习惯导致的钙缺乏人群的营养强化和营养补充。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。