阅读说明：本技术 一种高产脂肪酸的制备方法及破囊壶菌培养基 (Preparation method of high-yield fatty acid and thraustochytrid culture medium ) 是由 汪光义 温帅 叶会科 谢云轩 何耀东 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种高产脂肪酸的破囊壶菌培养基,成分及比例如下所示：Glycerol 35-65g/l,Peptone 2-8g/l,磷酸二氢钾0.2-1g/l,海盐25-35g/l。还公开高产脂肪酸的制备方法,主要步骤包括：液体培养基MPqd的制备；破囊壶菌液体培养基MP的制备；破囊壶菌固体培养基MP的制备；活化；破囊壶菌种子液的制备；破囊壶菌发酵培养基的制备；最后破囊壶菌生物量的测定和脂肪酸的测定。本发明培养基配方简单,能源利用高,绿色无污染,降低成本,提高脂肪酸的产量,利于工业化生产。(The invention discloses a thraustochytrid culture medium for high yield of fatty acid, which comprises the following components in percentage by weight: 35-65g/l of glycol, 2-8g/l of Peptone, 0.2-1g/l of monopotassium phosphate and 25-35g/l of sea salt. Also discloses a preparation method of the high-yield fatty acid, which mainly comprises the following steps: preparing a liquid culture medium MPqd; preparing a thraustochytrid liquid culture medium MP; preparing a thraustochytrid solid culture medium MP; activating; preparing a thraustochytrid seed solution; preparing a thraustochytrid fermentation culture medium; and finally, measuring the biomass of the thraustochytrid and measuring the fatty acid. The culture medium has the advantages of simple formula, high energy utilization, greenness, no pollution, cost reduction, fatty acid yield improvement and contribution to industrial production.)

一种高产脂肪酸的制备方法及破囊壶菌培养基

技术领域

本发明涉及微生物脂肪酸制备领域，特别是涉及一种高产脂肪酸的制备方法及破囊壶菌培养基。

背景技术

破囊壶菌是海洋中一种单细胞异养原生生物，于1936年首次被人们发现。它分布范围较广，在温带、热带、亚热带甚至极地冰川等地都有被分离的报道。

目前主要包括Aurantiochytrium,Thraustochytrium,Botryochytrium,Parietichytrium,Aplanochytrium,Labyrinthuloides,Oblongichytrium,Sicyoidochytrium,Japonochytrium,Schizochytrium和Ulkenia在内的11个属。大多数破囊壶菌能寄生在腐烂的植物残渣及高等植物身上生存，少数能寄生鲍鱼、文蛤等无脊椎动物身上生存。

由于其细胞内含有大量的脂肪酸，破囊壶菌被人们广泛认知。其胞内含有的脂肪酸主要包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。破囊壶菌细胞内的脂肪酸含量能占到干重的30％-50％，而且胆固醇含量低。脂肪酸成分主要以ω-3不饱和脂肪酸—DHA(Docosahexaenoic acid，C22:6)和饱和脂肪酸棕榈酸(C16:0)为主，两者能占到总脂肪酸的80％以上其他脂肪酸成分含量较少。

DHA对婴幼儿的视觉发育、大脑发育等起着不可替代的作用，同时对于成人而言，在预防高血压、动脉硬化、关节炎以及癌症等疾病方面具有显著功效。但人体并不能直接产生DHA，只能靠从外界获取。传统的DHA来源是深海鱼油，然而，由于其含有的鱼腥味、可能潜在的污染等问题，让其DHA的获取收到了诸多限制，而使用破囊壶菌生产DHA不仅仅可以克服上述缺陷，还能不受时间地点的限制，因此使用破囊壶菌生产DHA越来越受到学者们的关注。

由于目前地球上化石燃料的逐渐枯竭，且人类在利用化石燃料过程中产生了大量的污染，因此寻找持续可替代的绿色能源是实现经济社会可持续发展和生态环境保护的重要途径。

与传统的石化石油相比，生物柴油具有安全、无污染、热能利用充分等特点。而破囊壶菌中的饱和脂肪酸(棕榈酸)和一些单不饱和脂肪酸是合成绿色能源-生物柴油的重要原料。

随着目前人类利用破囊壶菌等微生物生产各种脂肪酸的市场被人们打开，通过优化培养基寻找合适的培养条件，从而获得高产量的脂肪酸是充分利用破囊壶菌为人类社会发展和进步做贡献的重要手段之一。

本发明在于克服现有技术的不足，提供一种高产脂肪酸的制备方法及破囊壶菌培养基。

本发明的第一个目的是提供一种高产脂肪酸的破囊壶菌培养基，成分及比例如下所示：Glycerol 35-65g/l，Peptone 2-8g/l，磷酸二氢钾0.2-1g/l，海盐25-35g/l。

本发明提供的第二个目的是提供一种高产脂肪酸的制备方法，采用上述培养基：破囊壶菌培养基，成分及比例如下所示：Glycerol 35-65g/l，Peptone 2-8g/l，磷酸二氢钾0.2-1g/l，海盐25-35g/l，

主要步骤如下：

1)破囊壶菌高产脂肪酸液体培养基MPqd的制备:在自然pH条件下，加超纯水1L，超声5-10min，用玻璃棒搅拌均匀，分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，于高压蒸汽灭菌锅中115℃，灭菌21分钟，冷却即得所需培养液。

2)破囊壶菌常用液体培养基MP的制备：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extractpowder 1-2g/l，Peptone 1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，冷却后即得所需液体培养基。

3)破囊壶菌固体培养基MP的制备：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extractpowder 1-2g/l，Peptone 1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l，琼脂粉15-20g，自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，将灭过菌的培养基倒入无菌培养皿，待到冷却之后即可得到所需固体培养基。

4)破囊壶菌的活化：在无菌条件下，用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于MP固体培养基中，然后在培养基中三区划线，培养箱中26±2℃培养1-3天即可。

5)破囊壶菌种子液的制备：将纯化好的破囊壶菌固体培养基从培养箱中取出，在无菌操作台中用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于制备好的上述MW液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养1-2天，即得所需种子液。

6)破囊壶菌发酵培养基的制备：在超净工作台中用移液枪吸取上述破囊壶菌种子液2.5-5ml(1)中的MVqd破囊壶菌液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养4天，即得所需的破囊壶菌发酵液。

7)破囊壶菌生物量的测定

吸取10-30ml的破囊壶菌菌液于50ml的离心管中，4℃，8000rpm离心10-20min，将上层液体倒掉，下层菌体用10-30ml的无菌蒸馏水清洗3次，于冻干机中冷冻干燥36h，称重后即可计算生物量。

8)破囊壶菌脂肪酸的测定

取冻干的菌体(确保无水分)，然后加入2ml 4％的硫酸甲醇溶液，再加入100μ1g/l的十九烷酸，震荡30s-60s后，在水浴锅中经80℃水浴1h后，冷却至室温，然后向离心管中加入1ml ddH₂O，1ml正己烷，震荡1-2min使其充分溶解28℃，6000rpm离心5-10min，溶液分层后，上层液体即为含有脂肪酸甲酯的正己烷溶液，用0.45μm的有机滤头过滤脂肪酸甲酯的正己烷溶液，然后用气象色谱仪测定滤液中各脂肪酸成分的含量，根据标液量计算各脂肪酸成分的含量。

本发明的有益效果是：培养基配方简单，能源利用高，绿色无污染，降低成本，提高脂肪酸的产量，利于工业化生产。

1、将传统的固态葡萄糖换成液态的甘油，提高原料的利用率，节约成本，有利于提高脂肪酸的产量。

2、将氮源换成了单一的氮源即蛋白胨，简化培养基的配方，节约时间，降低成本，有利于提高能源利用率。

附图说明

图1为破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4(CGMCC 8091 2014.04.09)使用常用液体培养基(MP)与高产脂肪酸液体培养基(MPqd)的总脂肪酸、棕榈酸、DHA含量。

图2为破囊壶菌Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16(CGMCC 8095 2014.04.09)使用通用培养基(MP)与高产脂肪酸液体培养基(MPqd)的总脂肪酸、棕榈酸、DHA含量。

具体的实施方式

下面通过具体的实施例和附图来对本发明作进一步的说明。本发明的所列举的实施例是为了相关领域内的研究人员更好的理解本发明，并不对本发明做任何限制。

本发明提供一种高产脂肪酸的破囊壶菌的液体培养基：Glycerol 35-65g/l，Peptone 2-8g/l，磷酸二氢钾0.2-1g/l，海盐25-35g/l。

一种采用上述培养基的培养方法，具体步骤如下：

1)破囊壶菌高产脂肪酸液体培养基MPqd的制备:称取Glycerol 35-65g/l，Peptone 2-8g/l，磷酸二氢钾0.2-1g/l，海盐25-35g/l，在自然pH条件下，加超纯水1L，超声5-10min，用玻璃棒搅拌均匀，分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，于高压蒸汽灭菌锅中115℃，灭菌21分钟，冷却即得所需培养液。

2)破囊壶菌常用液体培养基MP的制备：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extractpowder 1-2g/l，Peptone 1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，冷却后即得所需液体培养基。

3)破囊壶菌固体培养基MP的制备：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extractpowder 1-2g/l，Peptone 1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l，琼脂粉15-20g，自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，将灭过菌的培养基倒入无菌培养皿，待到冷却之后即可得到所需固体培养基。

4)破囊壶菌的活化：在无菌条件下，用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于MP固体培养基中，然后在培养基中三区划线，培养箱中26±2℃培养1-3天即可。

5)破囊壶菌种子液的制备：将纯化好的破囊壶菌固体培养基从培养箱中取出，在无菌操作台中用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于制备好的上述MW液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养1-2天，即得所需种子液。

6)破囊壶菌发酵培养基的制备：在超净工作台中用移液枪吸取上述破囊壶菌种子液2.5-5ml(1)中的MVqd破囊壶菌液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养4天，即得所需的破囊壶菌发酵液。

7)破囊壶菌生物量的测定

吸取10-30ml的破囊壶菌菌液于50ml的离心管中，4℃，8000rpm离心10-20min，将上层液体倒掉，下层菌体用10-30ml的无菌蒸馏水清洗3次，于冻干机中冷冻干燥36h，称重后即可计算生物量。

8)破囊壶菌脂肪酸的测定

取冻干的菌体(确保无水分)，然后加入2ml 4％的硫酸甲醇溶液，再加入100μl十九烷酸(1g/l)，震荡30s-60s后，在水浴锅中经80℃水浴1h后，冷却至室温，然后向离心管中加入1ml ddH₂O，1ml正己烷，震荡1-2min使其充分溶解28℃，6000rpm离心5-10min，溶液分层后，上层液体即为含有脂肪酸甲酯的正己烷溶液，用0.45μm的有机滤头过滤脂肪酸甲酯的正己烷溶液，然后用气象色谱仪测定滤液中各脂肪酸成分的含量，根据标液量计算总脂肪酸、棕榈酸、DHA含量。

实施例1：

1、所用菌株为：破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4(拉丁文:Schizochytriumsp.PKU#Mn4，保藏日期：2014-4-9，保藏单位:CGMCC，编号:CGMCC 8091)进行MP培养基与MPqd培养基进行培养：

2、破囊壶菌高产脂肪酸液体培养基MPqd的制备:称取Glycerol 45g/l，Peptone8g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，海盐30g/l，在自然pH条件下，加超纯水1L，超声10min，用玻璃棒搅拌均匀，分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，于高压蒸汽灭菌锅中115℃，灭菌21分钟，冷却即得所需培养液。

3、破囊壶菌常用液体培养基MP的制备：利用Glucose 20g/l，Yeast extractpowder 2g/l，Peptone 1.5g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，海盐30g/l自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，冷却后即得所需液体培养基。

4、破囊壶菌固体培养基MP的制备：利用Glucose 10g/l，Yeast extract powder1.5g/l，Peptone 1.5g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，海盐33g/l，琼脂粉20g，自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，将灭过菌的培养基倒入无菌培养皿，待到冷却之后即可得到所需固体培养基。

5、破囊壶菌的活化：在无菌条件下，用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于MP固体培养基中，然后在培养基中三区划线，培养箱中26±2℃培养1-3天即可。

6、破囊壶菌种子液的制备：将纯化好的破囊壶菌固体培养基从培养箱中取出，在无菌操作台中用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于制备好的上述MP液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养1-2天，即得所需种子液。

7、破囊壶菌发酵培养基的制备：在超净工作台中用移液枪吸取上述破囊壶菌种子液2.5-5ml置于步骤(1)中的MPqd破囊壶菌液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养4天，即得所需的破囊壶菌发酵液。

8、破囊壶菌生物量的测定：吸取30ml的破囊壶菌菌液于50ml的离心管中，4℃，8000rpm离心10-20min，将上层液体倒掉，下层菌体用30ml的无菌蒸馏水清洗3次，于冻干机中冷冻干燥36h，称重后即可计算生物量。

9、破囊壶菌脂肪酸的测定：取冻干的菌体(确保无水分)，然后加入2ml 4％的硫酸甲醇溶液，再加入100μl十九烷酸(1g/l)，震荡30s-60s后，在水浴锅中经80℃水浴1h后，冷却至室温，然后向离心管中加入1ml ddH2O，1ml正己烷，震荡1-2min使其充分溶解28℃，6000rpm离心5-10min，溶液分层后，上层液体即为含有脂肪酸甲酯的正己烷溶液，用0.45μm的有机滤头过滤脂肪酸甲酯的正己烷溶液，然后用气象色谱仪测定滤液中各脂肪酸成分的含量，根据标液量计算总脂肪酸、棕榈酸、DHA含量。

分析样品后可知使用MP液体培养基培养4天后得到的样品中，总脂肪酸含量为0.81g/l，DHA含量为0.34g/l，棕榈酸含量为0.28g/l；使用MPqd液体培养基培养4天后得到的样品中总脂肪酸含量为1.2g/l，DHA含量为0.56g/l，棕榈酸含量为0.41g/l，其中总脂肪酸产量提高了48.1％，DHA产量提高了64.7％，棕榈酸产量提高了46.4％(见图1)。

实施例2:

1、所用菌株为：破囊壶菌Thraustochytriidaesp.PKU#Mnl6(拉丁文：Thraustochytriidaesp.PKU#Mn 16,保藏日期：2014-4-9，保藏单位:CGMCC,编号：CGMCC8095)，进行MP培养基与MPqd培养基培养。

2、破囊壶菌高产脂肪酸液体培养基MPqd的制备:称取Glycerol 60g/l，Peptone6g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，海盐33g/l，在自然pH条件下，加超纯水1L，超声10min，用玻璃棒搅拌均匀，分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，于高压蒸汽灭菌锅中115℃，灭菌21分钟，冷却即得所需培养液。

3、破囊壶菌常用液体培养基MP的制备：利用Glucose 18g/l，Yeast extractpowder 2g/l，Peptone 1.5g/l，磷酸二氢钾0.15g/l，海盐33g/l自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，冷却后即得所需液体培养基。

4、破囊壶菌固体培养基MP的制备：利用Glucose 10g/l，Yeast extract powder1g/l，Peptone 2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，海盐33g/l，琼脂粉20g，自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，将灭过菌的培养基倒入无菌培养皿，待到冷却之后即可得到所需固体培养基。

5、破囊壶菌的活化：在无菌条件下，用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于MP固体培养基中，然后在培养基中三区划线，培养箱中26±2℃培养1-3天即可。

6、破囊壶菌种子液的制备：将纯化好的破囊壶菌固体培养基从培养箱中取出，在无菌操作台中用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于制备好的上述MP液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养1-2天，即得所需种子液。

7、破囊壶菌发酵培养基的制备：在超净工作台中用移液枪吸取上述破囊壶菌种子液2.5-5ml置于步骤(1)中的MPqd破囊壶菌液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养4天，即得所需的破囊壶菌发酵液。

8、破囊壶菌生物量的测定：吸取30ml的破囊壶菌菌液于50ml的离心管中，4℃，8000rpm离心10-20min，将上层液体倒掉，下层菌体用30ml的无菌蒸馏水清洗3次，于冻干机中冷冻干燥36h，称重后即可计算生物量。

9、破囊壶菌脂肪酸的测定：取冻干的菌体(确保无水分)，然后加入2ml 4％的硫酸甲醇溶液，再加入100μl十九烷酸(1g/l)，震荡30s-60s后，在水浴锅中经80℃水浴1h后，冷却至室温，然后向离心管中加入1ml ddH2O，1ml正己烷，震荡1-2min使其充分溶解28℃，6000rpm离心5-10min，溶液分层后，上层液体即为含有脂肪酸甲酯的正己烷溶液，用0.45μm的有机滤头过滤脂肪酸甲酯的正己烷溶液，然后用气象色谱仪测定滤液中各脂肪酸成分的含量，根据标液量计算总脂肪酸、棕榈酸、DHA含量。

分析样品后可知使用MP液体培养基培养4天后得到的样品中，总脂肪酸含量为0.68g/l，DHA含量为0.23g/l，棕榈酸含量为0.27g/l，使用MPqd液体培养基培养4天后得到的样品中总脂肪酸含量为1.37g/l，DHA含量为0.59g/l，棕榈酸含量为0.44g/l，其中总脂肪酸产量提高了101.4％，DHA产量提高了156.5％，棕榈酸产量提高了62.9％(见图2)。

参考文献：

1、Lee Chang K J,Dumsday G,Nichols P D,et al.High cell densitycultivation of a novel Aurantiochytrium sp.strain TC 20 in a fed-batch systemusing glycerol to produce feedstock for biodiesel and omega-3 oils[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2013,97(15):6907-18.

2、Chen W,Ma L,Zhou P-p,et al.A novel feedstock for biodieselproduction:The application of palmitic acid from Schizochytrium[J].Energy,2015,86128-138.

3、Huang J,Aki T,Yokochi T,et al.Grouping newly isolateddocosahexaenoic acidproducing thraustochytrids based on their polyunsaturatedfatty acid profiles and comparative analysis of 18S rRNA genes[J].MarBiotechnol,2003,5(5):450457.