阅读说明：本技术 一种富集深海鱼油中epa和dha的方法 (Method for enriching EPA and DHA in deep sea fish oil ) 是由 曹茜 廖琳萌 包清彬 袁永俊 刘庆庆 潘亚瑜 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法,包括如下步骤:(1)将sn-1,3位选择性脂肪酶溶解在Tris-HCl缓冲液中,再加入酰基迁移促进剂二氧化硅颗粒；(2)添加深海鱼油,反应过程中不断磁力搅拌；(3)添加氢氧化钾溶液和正己烷,充分震荡后离心,转移收集上层溶液并利用氮吹去除正己烷,除去正己烷后的余液即为富含EPA和DHA的脂质。其优点在于,在利用脂肪酶与酰基迁移促进剂二氧化硅的协同催化后,鱼油中EPA的富集得到显著改善,甚至在达到最高含量后不再下降而进入平台期,由于DHA较难被脂肪酶水解,酶催化富集DHA一般存在平台期,因此,当EPA保持高含量的时间延长之后,就非常容易选择到合适的反应时间,使得EPA和DHA实现同步富集。(The invention provides a method for enriching EPA and DHA in deep sea fish oil, which comprises the following steps of (1) dissolving sn-1,3 site selective lipase in Tris-HCl buffer solution, and then adding acyl migration promoter silica particles; (2) adding deep sea fish oil, and continuously stirring by magnetic force in the reaction process; (3) adding potassium hydroxide solution and n-hexane, shaking fully, centrifuging, transferring and collecting upper layer solution, removing n-hexane by nitrogen blowing, and obtaining residual liquid which is lipid rich in EPA and DHA after n-hexane is removed. The method has the advantages that after the synergistic catalysis of the lipase and the acyl migration promoter silicon dioxide is utilized, the enrichment of EPA in the fish oil is obviously improved, even the EPA does not decline any more after reaching the highest content and enters the plateau phase, and as DHA is difficult to be hydrolyzed by the lipase, the DHA enriched by the enzyme catalysis generally exists in the plateau phase, so that after the time for keeping the high content of the EPA is prolonged, the proper reaction time is very easy to select, and the EPA and the DHA are synchronously enriched.)

一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法

技术领域

本发明属于油脂中特定脂肪酸的富集方法技术领域，具体为一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法。

背景技术

许多研究已证实，两种ω-3长链多不饱和脂肪酸EPA和DHA对人体健康有诸多益处，随着与其相关的功能性食品和保健品的市场不断扩大，对富含EPA和DHA的油脂的需求日益增加。然而，作为EPA和DHA主要来源的深海鱼油的质量和数量都急剧下降，因此深海鱼油中EPA和DHA的富集受到关注。在富集的方法当中，脂肪酶催化因为条件温和以及对环境友好，成为最有前景的方法。脂肪酶通常具有脂肪酸选择性，不易水解长链多不饱和脂肪酸EPA和DHA使其保留在甘油骨架上，而其他(链较短、不饱和键较少的)脂肪酸则被水解下去，从而实现甘油酯中EPA和DHA的富集。由于甘油酯sn-2位的空间位阻大于sn-1,3位，因此大部分的脂肪酶具有sn-1,3位选择性，但鱼油中EPA和DHA的位置分布显著不同，EPA主要位于sn-1,3位而DHA主要位于sn-2位，这使得EPA被水解的风险大于DHA；另一方面，由于EPA的碳链短于DHA且不饱和键数也少于DHA，使得EPA本身就比DHA更易被酶水解。以上两个原因造成EPA的富集难度大于DHA，使得EPA和DHA的富集不同步，当DHA富集到最大浓度时，EPA的含量已开始下降甚至低于富集前浓度，或者为了使EPA的含量较为可观，只能提前终止反应使得DHA未能达到最大浓度。因此，需要一种新的方法来改善现有酶催化富集EPA和DHA时存在的问题。

发明内容

为解决现有技术中深海鱼油中EPA和DHA难以同时高浓度富集的技术问题，本发明提供了一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法，其实现的目的为，改善EPA的富集情况，使EPA和DHA的富集同步，从而能够同时获得高浓度的EPA和DHA。

为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法，包括如下步骤：

(1)将sn-1,3位选择性脂肪酶溶解在Tris-HCl缓冲液中，再加入酰基迁移促进剂二氧化硅颗粒，磁力搅拌后得到含有脂肪酶和二氧化硅的分散体；

(2)向步骤(1)制备好的分散体中添加深海鱼油，将所述催化剂和底物的混合物放入反应容器中，反应容器中充入氮气后密封，反应过程中不断磁力搅拌；

(3)反应结束后，向反应溶液中添加氢氧化钾溶液和正己烷，充分震荡后离心，转移收集上层溶液并利用氮吹去除正己烷，除去正己烷后的余液即为富含EPA和DHA的脂质。

EPA在深海鱼油的sn-2位含量相对较低，有较大的富集潜力。Sn-1,3位脂肪酶水解甘油三酯后会生成初级产物1,2-甘油二酯和次级产物2-甘油单酯，若体系中存在酰基迁移促进剂，将两种产物分别异构化为1,3-甘油二酯和1-甘油单酯，则能继续被sn-1,3位选择性脂肪酶水解，使得原本位于sn-2位的其他(链较短、不饱和键较少的)脂肪酸也能被水解，这便有利于实现sn-2位EPA的富集潜力。本方法利用二氧化硅来达到促进sn-2位酰基迁移的目的。

进一步的，所述步骤(1)中sn-1,3位选择性脂肪酶为米根霉脂肪酶。

进一步的，所述步骤(1)中sn-1,3位选择性脂肪酶为3重量份，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH值为7.0，重量份数为50，二氧化硅的重量份数为5，二氧化硅的粒径为1nm-100μm，磁力搅拌时间为5min。

进一步的，所述步骤(2)中深海鱼油的重量份数为100，反应温度为40℃，反应时间为1-10h。

进一步的，所述步骤(3)中氢氧化钾溶液的浓度为2mol/L，氢氧化钾溶液的重量份数为400，正己烷的重量份数为300，离心条件为5000g离心30min。

本发明的有益效果是：本方法创新性地将sn-1,3位选择性脂肪酶的水解产物为1,2-甘油二酯和2-甘油单酯，以及甘油酯的sn-2位酰基易迁移两个现象相结合，利用酶与酰基迁移促进剂的协同催化来改善sn-1,3位选择性脂肪酶富集深海鱼油中EPA和DHA时存在的问题。在利用酶与酰基迁移促进剂二氧化硅的协同催化后，鱼油中EPA的富集得到显著改善，甚至在达到最高含量后不再下降而进入平台期，由于DHA较难被脂肪酶水解，酶催化富集DHA一般存在平台期，因此，当EPA保持高含量的时间延长之后，就非常容易选择到合适的反应时间，使得EPA和DHA实现同步富集。

附图说明

图1为米根霉脂肪酶与45μm二氧化硅协同催化时EPA的含量变化；

图2为米根霉脂肪酶独立催化时EPA的含量变化；

图3为米根霉脂肪酶(ROL)独立或与45μm二氧化硅协同催化时EPA与DHA的比值变化；

图4为米根霉脂肪酶与10-20nm二氧化硅协同催化时EPA的含量变化；

图5为米根霉脂肪酶(ROL)独立或与10-20nm二氧化硅协同催化时EPA与DHA的比值变化。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例一：本发明提供的一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法，将3重量份的米根霉脂肪酶溶解在50重量份的Tris-HCl缓冲液(0.2mol/L，pH＝7.0)中，再加入5重量份的二氧化硅颗粒，颗粒的粒径为45μm，磁力搅拌5min后制备成含有脂肪酶和二氧化硅的分散体。向分散体中加入100重量份的深海鱼油，反应容器中充入氮气后密封，反应温度40℃，反应过程中不断磁力搅拌，反应时间为1-10h，反应结束后加入400重量份的氢氧化钾溶液(2mol/L)和300重量份的正己烷，充分震荡后，5000g离心30min，转移上层溶液至新容器，氮吹去除正己烷，剩余的脂质即为富集了EPA和DHA的产品。

将未反应的原油和不同反应时间获得的产品，采用GB 5009.168-2016(食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定)中的甲酯化方法和气相色谱分析方法，测得产品中EPA的含量变化如图1所示，反应1h后达到20.0％，之后则开始出现下降，反应3h以内时，EPA的含量均高于富集前含量。图2为米根霉脂肪酶独立催化时的结果，反应开始后EPA的含量便不断下降，未能实现富集。由图3可知，脂肪酶与45μm二氧化硅协同催化后，EPA与DHA比值的下降速度显著变缓，说明EPA的富集得到改善，反应4h以内时，EPA和DHA的同步富集情况优于酶独立催化时的情况。

实施例二：本发明提供的一种富集深海鱼油中EPA和DHA的方法，将3重量份的米根霉脂肪酶溶解在50重量份的Tris-HCl缓冲液(0.2mol/L，pH＝7.0)中，再加入5重量份的二氧化硅颗粒，颗粒的粒径为10-20nm，磁力搅拌5min后制备成含有脂肪酶和二氧化硅的分散体。向分散体中加入100重量份的深海鱼油，反应容器中充入氮气后密封，反应温度40℃，反应过程中不断磁力搅拌，反应时间为1-10h，反应结束后加入400重量份的氢氧化钾溶液(2mol/L)和300重量份的正己烷，充分震荡后，5000g离心30min，转移上层溶液至新容器，氮吹去除正己烷，剩余的脂质即为富集了EPA和DHA的产品。

将未反应的原油和不同反应时间获得的产品，采用GB 5009.168-2016(食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定)中的甲酯化方法和气相色谱分析方法，测得产品中EPA的含量变化如图4所示，EPA在前1h快速富集，之后则富集速度减慢，3h时达到20.5％，并且在整个反应过程中均未出现明显下降，与图2中米根霉脂肪酶独立催化的结果相比，脂肪酶与10-20nm二氧化硅协同催化后，EPA的富集情况得到显著改善，在整个10h中均保持高含量。EPA与DHA比值变化如图5所示，酶与10-20nm二氧化硅协同催化后，比值保持在1.2至1.3之间，1h后则未再出现显著下降，实现了EPA和DHA的同步富集，在整个反应过程中(10h)均显著优于独立催化时的情况。

需要说明的是，二氧化硅的粒径可以为1nm、100μm，也可以是1nm-100μm之间任意的粒径，由于富集效果都是一致的，故不再一一列举。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。