阅读说明：本技术 一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法 (Method for asymmetric synthesis of (S) -1-Boc-3-aminopiperidine by continuous flow of packed bed ) 是由 魏东芝 王华磊 汪湘湘 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法,所述方法包括：将一定量的固定化转氨酶填充于填充床中构成反应器,所述反应器水浴保温,自所述反应器的一端将反应液以一定流速泵入所述反应器中,在所述反应器的另一端收集流出物,实现(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的合成；其中,所述固定化转氨酶通过将ω-转氨酶固定在氨基-环氧树脂上制得,所述反应液包含：N-Boc-3-哌啶酮、异丙胺以及磷酸吡哆醛。根据本发明,采用的连续流催化模式能够原位去除产物,有效降低产物抑制的影响,提高催化效率,具有高时空产率、可持续等特点,反应条件温和,操作简便,延长固定化酶使用寿命,具有良好的应用前景。(The invention provides a method for asymmetric synthesis of (S) -1-Boc-3-aminopiperidine by continuous flow of a packed bed, which comprises the following steps: filling a certain amount of immobilized transaminase into a packed bed to form a reactor, keeping the temperature of the reactor in a water bath, pumping reaction liquid into the reactor from one end of the reactor at a certain flow rate, and collecting the effluent from the other end of the reactor to realize the synthesis of (S) -1-Boc-3-aminopiperidine; wherein the immobilized transaminase is produced by immobilizing ω -transaminase on an amino-epoxy resin, and the reaction solution contains: N-Boc-3-piperidone, isopropylamine and pyridoxal phosphate. According to the invention, the adopted continuous flow catalysis mode can remove the product in situ, effectively reduce the influence of product inhibition, improve the catalysis efficiency, has the characteristics of high space-time yield, sustainability and the like, is mild in reaction conditions, simple and convenient to operate, prolongs the service life of the immobilized enzyme, and has good application prospect.)

一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体而言，涉及一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法。

背景技术

对映体纯的手性胺包括伯胺、仲胺和叔胺，是合成多种生物活性化合物(如农用化学品和药物)的重要组成部分，已广泛应用于制药行业、农业化工及材料等领域(MathewS.，et al，2012，ACS Catalysis；Koszelewski D.，et al，2010，Trends inBiotechnology)。

具有光学活性的3-氨基哌啶(3APi)及其衍生物是一类非常重要的医药中间体，例如可以用于合成阿格列汀、利拉利汀等治疗Ⅱ型糖尿病的药物。目前主要通过化学法合成3-氨基哌啶(Decosta B R，et al.，1992，Journal ofMedicinal Chemistry)，然而化学合成方法不仅操作繁杂，具有较低的产率和产物光学纯度，而且后期的处理包括拆分剂的循环利用和对映体的回收等过程也费时费力，所以通过生物催化转化法制备3-氨基哌啶具有良好的研究价值。

随着生物催化剂被越来越多地用于原料药的工业规模合成，许多创新技术已被视为开发集约化和与工业相关的生物催化工艺的补充工具。特别地，在连续流反应器中进行生物催化转化的兴趣日益增长，连续流生物催化具有以下优点：(1)通过连续去除产物降低酶的抑制作用；(2)使用固定化生物催化剂时，易于进行下游处理(便于分离)；(3)提升了总转换数(totalturnover numbers，TTNs)。Luckarift H.R.等人在微流控装置中以连续流方式通过三个步骤从硝基苯合成2-氨基苯恶嗪-3-酮(2-aminophenoxazin-3-one，APO)，然而底物浓度(1mM)、总产率(19％)和生产能力需要进一步提高(Luckarift H R，et al.，2007，Biotechnology and Bioengineering)。在某种程度上，实现生物催化在连续流中应用的基础是酶固定化技术的持续发展。

固定化酶(immobilized enzymes)是指通过物理或化学的手段，将酶束缚于水不溶性的载体上，或限制在一定空间内，但仍保留其催化活性，能连续地进行反应，并且能够回收重复使用的生物催化剂。

固定化酶可以通过全活细胞、死细胞、粗酶或纯化酶来制备获得，这取决于酶的类型和应用。传统的固定化方法分为吸附法、交联法、包埋法和共价结合法，其中共价结合法获得的固定化酶酶分子与载体之间的连接十分牢固，反应过程中不易发生蛋白脱落的情况，具有优良的稳定性和重复使用性能，但是共价作用会影响酶的蛋白结构，甚至破坏生物催化剂的活性中心，最终导致酶活的显著降低，一般酶活回收率仅有30％～50％左右。

在用于共价结合法的载体中，环氧基活化的载体几乎是理想的固定化材料，可以在实验室和工业规模上轻松进行蛋白质和酶的固定化。环氧基载体具有十分良好的稳定性，可长时间储存于低温干燥的条件下，在中性潮湿的环境中也能保持稳定，这是保证获得性质稳定的固定化酶的重要前提。此外，在非常温和的实验条件(例如pH 7.0)下，环氧活化的载体能够与不同的蛋白质基团(例如氨基、硫醇及酚类等)直接形成非常稳定的共价键。例如2016年，De Souza等人将来源于Vibrio fluvialis的ω-TAVf固定于环氧基活化的纤维素中，用于(S)-苯乙胺的不对称合成，在30至60℃的温度范围内均具有活性，但仅能够重复使用4个批次(De Souza,et al.，2016，RSC Advances)。

然而，固定在常规环氧树脂载体上需要高离子强度的环境，同时酶与载体之间的疏水作用可能会影响酶的活性和稳定性。此外，即使在弱碱性条件下，环氧基团与可溶性蛋白之间的反应也极其缓慢。因此对环氧基载体进行修饰改性，是获得具有更高性能的新型固定化载体的有效手段，能够为酶的固定化提供更多载体选择。

发明内容

本发明目的是提供一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法，从而解决现有技术中(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的化学合成方法操作繁杂，生物催化合成法酶活和稳定性又容易受到多种因素影响，因此导致产率较低的问题。

为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法，所述方法包括：将一定量的固定化转氨酶填充于填充床中构成反应器，所述反应器水浴保温，自所述反应器的一端将反应液以一定流速泵入所述反应器中，在所述反应器的另一端收集流出物，实现(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的合成；其中，所述固定化转氨酶通过将ω-转氨酶固定在氨基-环氧树脂上制得，所述反应液包含：N-Boc-3-哌啶酮、异丙胺以及磷酸吡哆醛。

根据本发明提供的方法，转氨酶不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的反应过程如图1所示，用来实现该反应的固定化转氨酶[email protected]填充床连续流反应系统如图2所示，转氨酶模式反应示意图如图3所示。

根据本发明的一个优选方案，所述填充床是长度为10～30cm，内径为10～20mm的玻璃层析柱，所述固定化转氨酶的用量为1～10g。

优选地，所述反应液中N-Boc-3-哌啶酮的浓度为20～200mM，异丙胺为N-Boc-3-哌啶酮的1～5倍当量，磷酸吡哆醛的含量为0.1～1mM。最优选地，异丙胺为N-Boc-3-哌啶酮的2倍。

优选地，所述反应液还包括助溶剂二甲基亚砜，所述助溶剂二甲基亚砜的用量为5～20％(V/V)。

优选地，所述反应液在所述反应器中的流动方向为自上而下，反应液在反应器中的平均停留时间为5～15min，优选为8～12min。

根据本发明的一个优选方案，固定化转氨酶在玻璃层析柱中的填料量为2.5g时，反应液流向为从上至下，反应液的流速为0.2～1.5mL/min。

优选地，所述反应器在20～60℃下水浴保温。

优选地，连续流反应体系所用缓冲液离子浓度为50mM～1M，pH7.0～9.0的磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液。

根据本发明的另一个优选方案，填充床采用长度为10cm，内径为10mm的玻璃层析柱，固定化转氨酶在玻璃层析柱中的填料量为2.5g，反应液流向为从上至下，反应液流速为0.4mL/min。

根据本发明提供的方法，固定化转氨酶按以下方法制备：S1：发酵培养含有重组质粒ATA-W12-pET-28a的大肠杆菌，收集湿菌体，重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，离心得到ω-转氨酶粗酶液；S2：称取一定量的氨基-环氧树脂，加入适量ω-转氨酶粗酶液以及缓冲液，摇床中处理一定时间，实现ω-转氨酶在氨基-环氧树脂上的固定化；S3：过滤抽干并用磷酸盐缓冲液洗涤除去未能固定的蛋白，加入含3M甘氨酸的50mM磷酸盐缓冲液在摇床中处理一定时间，用于封闭未反应的环氧基位点；以及S4：抽滤洗涤，制得所述固定化转氨酶，向其中加入100mM磷酸盐缓冲液，4℃冰箱保存。

优选地，步骤S2中，ω-转氨酶粗酶液的蛋白浓度为0.4～3mg/mL，ω-转氨酶粗酶液的添加量为1～6mL/1g氨基-环氧树脂。

优选地，步骤S2中，缓冲液为pH5.0～10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，这些缓冲液的离子浓度均为50mM～1M，均含有0.1～1mM磷酸吡哆醛。

优选地，步骤S2中的固定化时间为1～18h，所用氨基-环氧树脂的氨基修饰密度为1～70μmol/g。

可选地，步骤S1中的100mM磷酸钠缓冲液pH8.0，含0.1mM磷酸吡哆醛，步骤S3中的50mM磷酸盐缓冲液pH8.5，含3M甘氨酸，步骤S4中的100mM磷酸钠缓冲液pH8.0，含0.1mM磷酸吡哆醛。

根据本发明的一个优选方案，步骤S2中，称取1g氨基-环氧树脂，蛋白浓度为1.8mg/mL的粗酶液加量为4mL，采用100mM pH8.0，含0.1mM磷酸吡哆醛的磷酸钠缓冲液，固定化时间为6h，所用氨基-环氧树脂氨基修饰密度为20μmol/g。

所述固定化转氨酶催化温度为20～60℃，优选为37℃。

所述固定化转氨酶催化还原pH为7.0～10.0，优选为8.0。

根据本发明提供的方法，所述氨基-环氧树脂按以下方法制备：A1：称取一定量的环氧树脂，加入去离子水洗涤至少三次，洗去杂质；A2：将洗涤后的环氧树脂与乙二胺修饰溶液按1:(8～12)(w/v)的比例混合，在摇床条件下处理一段时间；A3：反应结束后，抽滤，并用去离子水反复洗涤5次以上，除去未反应的乙二胺，抽干后于4℃冰箱保存。

优选地，步骤A2中乙二胺修饰溶液的pH为8.0～10.0，浓度为0.1～1M，反应时间为1～6h。

根据本发明的一个优选方案，步骤A2中乙二胺修饰溶液pH为8.5，乙二胺浓度为0.3M，洗涤后的环氧树脂与乙二胺修饰溶液按1:10(w/v)的比例混合，在20℃，200rpm条件下处理1h。

本发明的创造性主要在于，1)通过对环氧树脂进行修饰改性，从而获得一种具有更高性能的氨基-环氧树脂，进而使得固定在该氨基-环氧树脂上的ω-转氨酶具有显著提高的酶活和稳定性；2)通过提供一种使用固定化转氨酶以连续流模式不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的工艺方法，首次实现了(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的高效以及低成本的生物催化合成，具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种使用固定化转氨酶以连续流模式不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的工艺方法，其中转氨酶固定化于经乙二胺修饰后的氨基-环氧树脂上，酶活回收率为75％，具有良好的稳定性，于4℃冰箱保存30天后没有明显酶活损失，连续重复使用20次后，保留了85％的活性，在5～10的pH范围内均表现出比游离酶更强的耐受性。连续流反应体系催化效率为间歇反应的6倍，系统持续工作24h未见明显酶活损失，时空产率为930.73g·L^-1·d^-1，说明以连续流方式进行(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的不对称生产具有非常高的可行性，并且理论上该系统可应用于其他更多重要药物中间体的合成，具有非常高的研究价值和良好的应用前景。

综上所述，根据本发明提供的一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法，其中涉及环氧树脂的氨基化修饰及固定化转氨酶的制备方法，本发明通过采用固定化酶[email protected]为催化剂，酶活损失少，稳定性强，连续流催化模式能够原位去除产物，有效降低产物抑制的影响，提高催化效率，具有高时空产率、可持续等特点，反应条件温和，操作简便，延长固定化酶使用寿命，降低经济成本，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为转氨酶ATA-W12不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶反应过程图；

图2为固定化转氨酶[email protected]填充床连续流反应系统示意图；

图3为转氨酶模式反应示意图；

图4为环氧载体氨基修饰密度随EDA反应时间的变化；

图5为ATA-W12粗酶液的蛋白凝胶电泳图；

图6为载体氨基修饰密度对固定化转氨酶酶活的影响；

图7为载体蛋白负载量的优化结果；

图8为固定化时间的优化结果；

图9为反应pH对游离酶和固定化酶酶活的影响；

图10为反应温度对固定化酶酶活的影响；

图11为游离酶和固定化酶存储稳定性的比较结果；

图12为游离酶和固定化酶pH稳定性的比较结果；

图13为固定化酶的操作稳定性结果；

图14为连续流系统反应液流向的优化结果；

图15为连续流系统固定化酶填料量的优化结果；

图16为连续流系统反应液流速的优化结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1：环氧树脂的氨基化修饰

(1)称取一定量的环氧树脂107s(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，加入去离子水洗涤至少三次，抽滤取滤饼，4℃保存待用；

(2)将洗涤后的环氧树脂与pH8.5的0.3M乙二胺修饰溶液按1:10(w/v)的比例混合，在20℃，200rpm条件下处理一段时间；

(3)反应结束后，抽滤，并用去离子水反复洗涤5次以上，除去未反应的EDA，抽干后于4℃冰箱保存，所得氨基-环氧树脂(EDA-Epoxy Supports)缩写为EES。

实施例2：环氧树脂氨基修饰密度的测定

滴定法测定氨基修饰密度：量取40mL 10mM HCl标准液，称取1g EES与其混合，在25℃恒温条件下，缓慢摇晃15～20h以确保充分反应。抽滤后使用10mM NaOH标准液对滤液进行滴定，氨基修饰密度(amino group density)的计算方法如下：

其中，c₁为初始HCl浓度(10mM)，c₂为最终HCl浓度(通过NaOH滴定结果计算)，V为滤液总体积(40mL)，m为树脂总质量(1g)。

绘制载体氨基修饰密度随EDA处理时间的变化，如图4所示。已知环氧树脂107s的环氧基密度为80μmol/g，结果显示随着反应时间的延长，载体上氨基修饰密度随之增加，直到反应时间为4h及以上时，载体的氨基修饰密度达到最大并趋于稳定，保持在70μmol/g左右，此时修饰反应可能已达到平衡状态。

实施例3：转氨酶ATA-W12粗酶液的制备

(1)将保存于甘油中含有重组质粒ATA-W12-pET-28a(专利公开号：CN106520719B)的大肠杆菌(E.coli)接种于3～5mL液体LB培养基(含卡那100μg/mL)中，于37℃，200rpm摇床中过夜培养，按1％(v/v)接种量转接于50mL液体LB培养基(含卡那100μg/mL)中，37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀至0.6左右，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，于20℃，200rpm摇床中过夜培养，诱导时间不超过20h。

(2)诱导结束后，将菌液倒入50mL离心管中，8000rpm，4℃离心5min弃去上清后，收集菌体加入40mL的0.85％(w/v)生理盐水重悬菌体，以同一条件再次离心，弃去上清获得湿菌体。

(3)在上述获得的湿菌体中加入8mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，含0.1mM磷酸吡哆醛)重悬，超声破碎15min(超3秒，停5秒；共运行15min；保护温度30℃)。8000rpm，4℃离心5min，除去细胞碎片或杂质，上清液即为所需粗酶液。如需保存则将上清倒入另一离心管中，加入4mL灭过菌的75％甘油，混匀，分装进多个2mL EP管中，-40℃保存。

图5为转氨酶ATA-W12粗酶液的凝胶电泳图，ATA-W12的分子量约为55kDa，图中能在50kDa附近能看到清晰条带，即为目标蛋白。

实施例4：酶活测定

称取25～50mg固定化酶(或含相应酶量的粗酶液)于2mL EP管中，加入1mL反应液(100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，含2.5mM丙酮酸，2.5mM(S)-苯乙胺，0.25％DMSO)。在室温条件下，反应5min，离心分离固定化酶和上清，上清加入200μL 2M HCl淬灭可能从载体上脱离下来的酶蛋白，8000rpm离心5min后取上清使用酶标仪在245nm处测定吸光值。固定化酶比酶活定义(U/g)：1g固定化酶每分钟生成产物苯乙酮的量(μmol)。

实施例5：ATA-W12固定化于氨基-环氧树脂

称取1g氨基-环氧树脂，加入适量粗酶液，用100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，0.1mM磷酸吡哆醛)补足至10mL，在20℃，200rpm摇床中处理一定时间，过滤抽干并用100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗涤除去未能固定的蛋白，加入10mL含3M甘氨酸的50mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)在20℃，200rpm条件下处理20h用于封闭未反应的环氧基位点，抽滤洗涤后将所得固定化酶加入100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，0.1mM磷酸吡哆醛)中，置于4℃冰箱保存。获得的固定化酶命名为[email protected]。

实施例6：载体氨基修饰密度的优化

根据实施例1，控制修饰时间制备具有氨基修饰密度约为0、10、20、30、50、60、70μmol/g的EES，分别称取1g具有不同氨基修饰密度的EES，与9mL 100mM pH8.0的磷酸盐缓冲液(含0.1mM磷酸吡哆醛)混合，加入1mLATA-W12粗酶液，其余操作同实施例5，过滤洗涤后按照实施例4测定酶活，将未经修饰的107s(即氨基修饰密度为0)为载体所得固定化酶的酶活记为100％，计算相对酶活。

结果如图6所示，在载体氨基修饰密度为0～20μmol/g的范围内，固定化酶相对酶活随着氨基修饰密度的增加而增加，当载体氨基修饰密度为20μmol/g时，相对酶活达到最高，为[email protected]的1.2倍。随着氨基修饰密度的继续增加，固定化酶的相对酶活逐渐减小，当载体氨基修饰密度为70μmol/g时，固定化酶相对酶活仅有50％。

实施例7：载体蛋白负载量的优化

分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL粗酶液(蛋白浓度为1.8mg/mL)于25mL反应瓶中，用100mM pH8.0的磷酸盐缓冲液(含0.1mM磷酸吡哆醛)补足至10mL，再分别加入1g实施例6所述氨基修饰密度为20μmol/g的EES，其余操作同实施例1。

从图7可以看出，在前期固定化酶的比活随着酶液用量的增加而增加，在4mL时达到峰值，且蛋白吸附率基本保持不变，处于98.5～99.9％之间，蛋白几乎被完全吸附；而当酶液增加至6mL时，比活出现微微下降的趋势，同时蛋白吸附率也在减小。故采用4mL的粗酶液使用量进行固定化。

实施例8：固定化时间的优化

准备7个EES与ATA-W12的固定化体系，以实施例6所述氨基修饰密度约为20μmol/g_载体的EES为固定化载体，按实施例7所述加入4mL粗酶液进行ATA-W12的固定化，分别在0、2、4、6、8、12、18h时取出结束固定化过程，固定化时间对固定化酶的相对酶活与蛋白吸附率的影响如图8所示。

随着固定化时间的延长，固定化酶的酶活与蛋白吸附率呈现增长的趋势，在6h时固定化酶达到最高酶活，此时蛋白吸附率为97.25％；继续延长固定化时间，固定化酶的酶活和蛋白吸附率没有出现明显变化。与ATA-W12固定化于环氧树脂的过程相比，使用EES能将固定化时间由24h缩短至6h，大大节省了时间成本。

实施例9：固定化酶反应pH的优化

按表1所示缓冲液配方配制不同pH缓冲液，离子浓度均为100mM。分别为磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，以及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0～10.0)。

表1：不同pH缓冲液的配制

游离酶(200μL反应体系)：20μL粗酶液，不同pH的缓冲溶液，终浓度为2.5mM的丙酮酸和2.5mM的(S)-苯乙胺，0.25％DMSO助溶。在37℃条件下反应5min，用盐酸终止反应后离心取上清于245nm波长下测定吸光值。

固定化酶(1mL反应体系)：称取50mg固定化转氨酶[email protected]于2mL EP管中，加入不同pH的缓冲溶液，终浓度为2.5mM的丙酮酸和2.5mM的(S)-苯乙胺，0.25％DMSO助溶。在37℃条件下反应5min，用盐酸终止反应后离心取上清于245nm波长下测定吸光值。

固定化前后生物催化剂在不同pH条件下的相对酶活如图9所示。游离酶ATA-W12的最适pH条件为100mM pH8.5Tris-HCl缓冲液，在pH8.0～10.0范围内均表现出较高活性。对于固定化酶[email protected]，最适pH条件为100mMpH8.0磷酸钠缓冲液，与游离酶相比，固定化酶的最适pH偏低，即略向酸性偏移。

实施例10：固定化酶反应温度的优化

固定化转氨酶[email protected]的最适反应温度在4～70℃范围内进行测定，反应体系为1mL。称取50mg固定化转氨酶[email protected]于2mL EP管中，加入100mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液，终浓度为2.5mM的丙酮酸和2.5mM的(S)-苯乙胺，0.25％DMSO助溶。分别在4、20、30、40、50、60、65、70℃条件下反应5min，用盐酸终止反应后离心取上清于245nm波长下测定吸光值，将最高酶活记为100％。

结果如图10所示。固定化酶的最适反应温度范围为30～50℃，当反应温度升高至65℃时，[email protected]的剩余酶活仍保留了50％左右，说明[email protected]具有良好的耐热性，这可能是因为固定化载体对酶蛋白形成了一定的保护。虽然[email protected]在50℃具有最高酶活，但在实际操作中，高温会增加经济成本，并且容易发生危险，因此结合以往的经验，在后续的实验中选择37℃为固定化酶的反应温度。

实施例11：固定化酶存储稳定性的测定

将固定化酶[email protected]与游离酶ATA-W12均加入100mM pH8.0磷酸盐缓冲液(含0.1mM磷酸吡哆醛)中，放置于4℃冰箱保存，每隔一定时间按实施例4测定其相应酶活，以第0天的固定化酶(游离酶)酶活为初始酶活，记为100％，残余酶活计算方法如下：

残余酶活＝当前酶活初始酶活×100％

将固定化酶[email protected]与游离酶ATA-W12一同放置于4℃冰箱中贮藏30天并持续测定其残余酶活，结果见图11。游离酶随着存储时间的增加，酶活持续大幅度降低，在第15天时残余酶活为初始值的43.6％，在第30天时仅有4.3％的酶活残留。固定化酶[email protected]在前10天左右酶活没有明显的损失，在存储30天后，残余酶活为初始值的89.42％，展现了出色的存储稳定性。

实施例12：固定化酶pH稳定性的测定

配制不同pH的缓冲液(pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，离子浓度均为100mM，配方见表2)，然后将固定化酶[email protected]与游离酶ATA-W12分散在不同pH的缓冲液中，4℃孵育24h，按实施例4测定其相应酶活，以孵育前的酶活为初始酶活，记为100％，残余酶活计算方法同实施例11。

表2：不同pH缓冲液的配制

比较游离酶和固定化酶的pH稳定性，结果如图12所示。在pH为8.0的缓冲液中，游离酶和固定化酶均表现出较强的稳定性，而在所有pH条件下固定化酶的残余酶活均略高于游离酶，说明转氨酶ATA-W12在固定化后，对不同pH环境的耐受性得到了一定提高。

实施例13：固定化酶重复操作稳定性的测定

固定化酶的重复批次操作稳定性以图3所示反应作为模式反应进行测定，具体操作如下：称取1g固定化酶[email protected](或[email protected])于25mL反应瓶中，加入10mL反应液，含20mM丙酮酸，1.5倍当量(S)-苯乙胺，溶于100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液(含0.1mM磷酸吡哆醛)中，5％DMSO(v/v)助溶。在37℃，200rpm条件下反应2h后，过滤分离固定化酶与上清，固定化酶经洗涤后按实施例4测定酶活，再加入新的反应液进行重复批次实验，残余酶活同实施例11。

为了确定氨基修饰后对固定化酶重复操作稳定性可能会产生的影响，分别对固定化酶[email protected]与[email protected]进行了重复操作稳定性的测定，结果如图13所示。[email protected]在使用至第8次时，还保留了初始值的91.05％的活性，随后酶活逐渐减小，当重复使用至16次时，残余酶活仅为31.49％。而[email protected]在重复使用至16次时，保留有90.58％的残余酶活，当重复操作20次后，残余酶活为85.02％，具有良好的重复批次使用稳定性。

实施例14：使用[email protected]以间歇模式不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶

称取0.5g固定化酶[email protected]于10mL反应瓶中，加入3mL反应液，含20mM底物N-Boc-3-哌啶酮，40mM异丙胺(IPA)作为氨基供体，100mMpH8.0磷酸盐缓冲液(含0.1mM磷酸吡哆醛)，5％DMSO助溶。于37℃，200rpm摇床中进行反应，每小时取500μL上清反应液加入100μL 2M HCl以淬灭可能从载体上脱落的酶蛋白，使用0.22μm的一次性针头过滤器进行过膜处理，使用HPLC进行下一步检测。

实施例15：使用[email protected]以连续流模式不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶

称取一定质量的固定化酶[email protected]填充于玻璃柱(长度10cm，内径10mm)中，放置于37℃水浴中保温，通过蠕动泵以一定流速将反应液(反应液体系同实施例14)泵入反应器中，在出口处收集反应液，反应液样品使用0.22μm的一次性针头过滤器进行过膜处理，使用HPLC进行下一步检测。

实施例16：分析方法的建立

使用高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对收集到的反应液样品进行分析检测，检测条件为：ZORBAX Extend-C18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为28％乙腈和72％水(含0.1％TFA)，柱温37℃，流速为0.8mL/min，进样量5μL，在UV210nm处检测。在该条件下，底物N-Boc-3-哌啶酮保留时间为12.1min，产物(S)-1-Boc-3-氨基哌啶保留时间为3.5min。

实施例17：填充床连续流反应器反应液流向的优化

称取2g固定化酶[email protected]填充于玻璃柱中，分别在0.2、0.5和1mL/min的流速条件下，将反应液(反应液体系同实施例14)分别由上至下(下流系统)和由下至上(上流系统)泵入反应器，在出口处收集反应液，经处理后通过HPLC测定转化率。

结果如图14所示。发现无论是在慢速、中速还是快速的流速条件下，下流系统中洗脱液的转化率均略高于上流系统。鉴于当该过程以向上流动模式进行时，反应器中的固定化酶处于悬浮状态，且有略微的聚集现象，向上流动的半流化床反应器的性能较差可能是由于轴向液体的回混和底物溶液的通道化以及反应物与固定化酶接触不良。因此将反应液从反应器顶部泵入柱中较好。

实施例18：填充床连续流反应器固定化酶填料量的优化

分别称取1g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、5g固定化酶[email protected]填充于玻璃柱中，统一使用0.8mL/min的流速，按实施例17所述将反应液(反应液体系同实施例14)由上至下泵入反应器，在出口处收集反应液，经处理后通过HPLC测定转化率。

结果如图15所示。可以看出，反应转化率随着反应器中填料量的增加而升高，在填料量从1g增加至2.5g时，反应转化率显著提高(从约30％增长至60％)，当生物催化剂使用量继续增加时，反应转化率趋于平稳，仅有小幅增加。考虑到反应器的催化效率(μmol·min^-1·g^-1)的最大化，采用2.5g的固定化酶使用量为最佳填料量，此时反应转化率为64.36％。

实施例19：填充床连续流反应器反应液流速的优化

按实施例18确定最优填料量为2.5g，按实施例17所述分别以0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5mL/min的流速将反应液(反应液体系同实施例14)由上至下泵入反应器，在出口处收集反应液，经处理后通过HPLC测定转化率。

结果如图16所示。显然地，降低流速能够增加底物与固定化酶的接触时间，使其充分反应从而提高转化率，然而在0.20～0.40mL/min的流速范围内，反应转化率没有明显变化，因此选择0.40mL/min流速进行下面的实验，此时计算反应转化率为95.14％。

实施例20：最优条件下连续流反应器的催化效力及其可持续性能

根据实施例17、18、19所述结果，将连续流生物催化反应的工艺条件调整为：固定化酶填料量为2.5g，以0.4mL/min的流速将反应液从上至下泵入玻璃层析柱中，恒温水浴37℃。计算得反应器中反应液总体积约为3.925mL，则反应液在反应器中的平均停留时间(定义为反应器中液体体积除以反应液流量)约为9.8min。分别在连续流催化模式与实施例14所述间歇反应模式下进行(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的不对称合成，将反应结果进行对比，如表3所示。在连续流操作的最佳条件下，20mM的N-Boc-3-哌啶酮在不到10min的停留时间内即可达到95％的转化率，催化效率为1.83μmol·min^-1·g^-1，比相应的间歇反应高出约6倍。将该连续流反应器系统连续操作24h用于不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶，发现在持续工作24h后反应转化率仍保持在90％以上，计算时空产率(Space-Time Yield)高达930.73g·L^-1·d^-1。

表3：间歇反应与连续流生物催化合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶

平均停留时间:为反应器中液体体积除以料液的流量所得数值；

催化效率:表示在对应操作模式下固定化酶的催化能力，即每分钟每克固定化酶催化生成产物的量(μmol)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。