阅读说明：本技术 特异性抗体的检测标记物、其制备方法、其应用及试剂盒 (Specific antibody detection marker, preparation method, application and kit thereof ) 是由 王志新 李小冬 高省 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明适用于生物技术领域,提供了一种特异性抗体的检测标记物、其制备方法、其应用及试剂盒,该特异性抗体为2019-nCov特异性抗体,其检测标记物包括胶体金和2019-nCov抗原；所述2019-nCov抗原特异性地与所述2019-nCov特异性抗体结合。本发明将2019-nCov抗原通过物理吸附的方法固定在胶体金颗粒上,便可通过胶体金的颜色改变程度来反映与2019-nCov抗原进行特异性结合的2019-nCov特异性抗体的量,从而可以快速定性或定量检测新冠2019-nCov病毒感染后的抗体变化。(The invention is suitable for the technical field of biology, and provides a detection marker of a specific antibody, a preparation method, application and a kit thereof, wherein the specific antibody is a 2019-nCov specific antibody, and the detection marker comprises colloidal gold and a 2019-nCov antigen; the 2019-nCov antigen specifically binds to the 2019-nCov-specific antibody. According to the invention, the 2019-nCov antigen is fixed on the colloidal gold particles by a physical adsorption method, so that the amount of the 2019-nCov specific antibody specifically bound with the 2019-nCov antigen can be reflected by the color change degree of the colloidal gold, and thus, the antibody change after the new crown 2019-nCov virus infection can be rapidly detected qualitatively or quantitatively.)

特异性抗体的检测标记物、其制备方法、其应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种特异性抗体的检测标记物、其制备方法、其应用及试剂盒。

背景技术

2019-nCov，是一种新型冠状病毒，人感染了该病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，对人类造成了非常严重的危害。

另外，正常机体受到外来物质攻击时会启动自我保护机制，机体免疫系统产生特异性抗体是机体自我保护的方式之一，产生能够识别外来攻击物质的特异性抗体是免疫机制的典型表现。机体受到外来物质攻击时大约3-5天就会产生特异性免疫球蛋白IgM，10-30天内会产生特异性免疫球蛋白IgA，3-5个月后产生特异性免疫球蛋白IgG，产生的特异性IgM、IgA或IgG与外来物质特异性结合并予以清除。如果外来物质的攻击力度不断加大、产生的特异性IgM、IgA或IgG不能及时清除攻击物质会使机体的免疫系统崩溃，对机体造成严重的破坏直至威胁到生命。

因此，及时、快速检测2019-nCov病毒特异性抗体的临床意义非常重要。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种特异性抗体的检测标记物，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种特异性抗体的检测标记物，所述特异性抗体为2019-nCov特异性抗体，所述检测标记物包括胶体金和2019-nCov抗原；所述2019-nCov抗原特异性地与所述2019-nCov特异性抗体结合。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述特异性抗体的检测标记物的制备方法，其包括以下步骤：

分别配制胶体金溶液和2019-nCov抗原的稀释液，备用；

将所述胶体金溶液的pH值调至8～10后，再与所述2019-nCov抗原的稀释液进行混合，得到混合液；

往所述混合液中添加含有甘氨酸的缓冲液进行封闭处理后，再经分离，得到沉淀物；

用溶解液对所述沉淀物进行溶解，得到所述检测标记物。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述胶体金溶液的配制方法包括以下步骤：

将氯金酸和柠檬酸钠置于沸水中进行反应，得到所述胶体金溶液。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述将氯金酸和柠檬酸钠置于沸水中进行反应，得到所述胶体金溶液的步骤，具体包括：

配制质量浓度为1％～3％的氯金酸溶液以及质量浓度为1％～3％的柠檬酸钠溶液，备用；

往沸水中添加所述氯金酸溶液和所述柠檬酸钠溶液，继续煮沸后，再经冷却，并添加去离子水补足蒸发的水分，得到所述胶体金溶液；所述沸水、所述氯金酸溶液与所述柠檬酸钠溶液的体积比为(80～120):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述2019-nCov抗原的稀释液中2019-nCov抗原的浓度为0.1～0.3mg/mL；所述2019-nCov抗原的稀释液与所述胶体金溶液的体积比为(0.05～0.07):1。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述往所述混合液中添加含有甘氨酸的缓冲液进行封闭处理后，再经分离，得到沉淀物的步骤中，甘氨酸的终浓度为10～30mmol/L。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述溶解液包括吐温-20、牛血清白蛋白和甘氨酸；所述溶解液中吐温-20的质量浓度为0.1％～0.3％，牛血清白蛋白的质量浓度为1％～3％，甘氨酸的浓度为10～30mmol/L。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的检测标记物，所述胶体金的粒径为70～90nm。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述检测标记物在用于制备检测2019-nCov特异性抗体的试剂中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒用于检测2019-nCov特异性抗体，其包括上述的检测标记物。

本发明实施例提供的一种特异性抗体的检测标记物，通过将基因工程表达的2019-nCov抗原通过物理吸附的方法固定在胶体金颗粒上，而固定在胶体金上的抗原与机体产生的2019-nCov特异性抗体进行特异性结合后会改变胶体金原有的颜色(从波长为550nm的棕红色改变成波长为680nm的蓝黑色)，从而可以通过胶体金的颜色改变程度来反映与2019-nCov抗原进行特异性结合的2019-nCov特异性抗体的量，以快速定性或定量检测新冠2019-nCov病毒感染后的抗体变化。

附图说明

图1为本发明实施例3得到的胶体溶液金的电镜图。

图2为本发明实施例3得到的胶体溶液金的光吸收图谱。

图3为本发明实施例4得到的胶体金-抗原-抗体结合物的光吸收图谱。

图4为本发明实施例4得到的用于检测2019-nCov特异性抗体的标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种特异性抗体的检测标记物，所述特异性抗体为2019-nCov特异性抗体，所述检测标记物包括胶体金和2019-nCov抗原；所述2019-nCov抗原特异性地与所述2019-nCov特异性抗体结合。具体的，该2019-nCov抗原为现有的2019-nCov衣壳蛋白，2019-nCov衣壳蛋白(S)抗原为外购原料，购买自南京金斯瑞生物科技有限公司(S)抗原。另外，该检测标记物的制备方法，包括以下步骤：

S1、配制质量浓度为1％的氯金酸溶液以及质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，并用0.22μm的滤膜过滤氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，备用；接着，取640mL去离子水加入到2500mL的平底三角烧瓶，并将盛有去离子水的2500mL平底三角烧置于电磁炉上加热煮沸，得到沸水；分别往沸水中添加12mL上述氯金酸溶液和12mL上述柠檬酸钠溶液，继续煮沸10min后，再经冷却，并添加去离子水补足蒸发的水分，得到胶体金溶液。

S2、用5mM的Tris缓冲液将基因工程表达的新型冠状病毒2019-nCov衣壳(S)抗原稀释成浓度为0.1mg/mL的2019-nCov抗原的稀释液，备用。

S3、取1mL上述胶体金溶液，并用10％碳酸钾溶液将其pH值调至8后，再将其与50μL的上述2019-nCov抗原的稀释液用旋转混均器进行旋转混均2h，得到混合液。

S4、往所述混合液中添加含有终浓度为10mmol/L甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)进行封闭处理1h后，再经5000转/分的转速分离20min，弃上清，得到沉淀物。

S5、用溶解液对上述沉淀物进行溶解，即可得到检测标记物。其中，溶解液为含有吐温-20、牛血清白蛋白和甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)；溶解液中吐温-20的质量浓度为0.1％，牛血清白蛋白的质量浓度为1％，甘氨酸的终浓度为10mmol/L。另外，该检测标记物可用作于2019-nCov特异性抗体检测试剂盒中的试剂。

实施例2

该实施例提供了一种特异性抗体的检测标记物，所述特异性抗体为2019-nCov特异性抗体，所述检测标记物包括胶体金和2019-nCov抗原；所述2019-nCov抗原特异性地与所述2019-nCov特异性抗体结合。具体的，该2019-nCov抗原为现有的2019-nCov衣壳蛋白，2019-nCov衣壳蛋白(S)抗原为外购原料，购买自南京金斯瑞生物科技有限公司(S)抗原。另外，该检测标记物的制备方法，包括以下步骤：

S1、配制质量浓度为3％的氯金酸溶液以及质量浓度为3％的柠檬酸钠溶液，并用0.22μm的滤膜过滤氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，备用；接着，取960mL去离子水加入到2500mL的平底三角烧瓶，并将盛有去离子水的2500mL平底三角烧置于电磁炉上加热煮沸，得到沸水；分别往沸水中添加4mL上述氯金酸溶液和4mL上述柠檬酸钠溶液，继续煮沸30min后，再经冷却，并添加去离子水补足蒸发的水分，得到胶体金溶液。

S2、用5mM的Tris缓冲液将基因工程表达的新型冠状病毒2019-nCov衣壳(S)抗原稀释成浓度为0.3mg/mL的2019-nCov抗原的稀释液，备用。

S3、取1mL上述胶体金溶液，并用10％碳酸钾溶液将其pH值调至10后，再将其与70μL的上述2019-nCov抗原的稀释液用旋转混均器进行旋转混均2h，得到混合液。

S4、往所述混合液中添加含有终浓度为30mmol/L甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)进行封闭处理3h后，再经5000转/分的转速分离40min，弃上清，得到沉淀物。

S5、用溶解液对上述沉淀物进行溶解，即可得到检测标记物。其中，溶解液为含有吐温-20、牛血清白蛋白和甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)；溶解液中吐温-20的质量浓度为0.3％，牛血清白蛋白的质量浓度为3％，甘氨酸的终浓度为30mmol/L。另外，该检测标记物可用作于2019-nCov特异性抗体检测试剂盒中的试剂。

实施例3

该实施例提供了一种特异性抗体的检测标记物，所述特异性抗体为2019-nCov特异性抗体，所述检测标记物包括胶体金和2019-nCov抗原；所述2019-nCov抗原特异性地与所述2019-nCov特异性抗体结合。具体的，该2019-nCov抗原为现有的2019-nCov衣壳蛋白，2019-nCov衣壳蛋白(S)抗原为外购原料，购买自南京金斯瑞生物科技有限公司(S)抗原。另外，该检测标记物的制备方法，包括以下步骤：

S1、配制质量浓度为2％的氯金酸溶液以及质量浓度为2％的柠檬酸钠溶液，并用0.22μm的滤膜过滤氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，备用；接着，取800mL去离子水加入到2500mL的平底三角烧瓶，并将盛有去离子水的2500mL平底三角烧置于电磁炉上加热煮沸，得到沸水；分别往沸水中添加8mL上述氯金酸溶液和8mL上述柠檬酸钠溶液，继续煮沸20min后，再经冷却，并添加去离子水补足蒸发的水分，得到胶体金溶液。其中，该胶体金溶液的电镜图如附图1所示，其中胶体金颗粒的平均粒径为90nm，另外，该胶体金的光吸收图谱如附图2所示。

S2、用5mM的Tris缓冲液将基因工程表达的新型冠状病毒2019-nCov衣壳(S)抗原稀释成浓度为0.2mg/mL的2019-nCov抗原的稀释液，备用。

S3、取1mL上述胶体金溶液，并用10％碳酸钾溶液将其pH值调至9后，再将其与60μL的上述2019-nCov抗原的稀释液用旋转混均器进行旋转混均2h，得到混合液。

S4、往所述混合液中添加含有终浓度为20mmol/L甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)进行封闭处理2h后，再经5000转/分的转速分离30min，弃上清，得到沉淀物。

S5、用溶解液对上述沉淀物进行溶解，即可得到检测标记物。其中，溶解液为含有吐温-20、牛血清白蛋白和甘氨酸的Tris缓冲液(pH值为8)；溶解液中吐温-20的质量浓度为0.2％，牛血清白蛋白的质量浓度为2％，甘氨酸的终浓度为20mmol/L。另外，该检测标记物可用作于2019-nCov特异性抗体检测试剂盒中的试剂。

实施例4

该实施例提供了一种2019-nCov特异性抗体的检测方法，其包括以下步骤：

S1、用含有质量浓度为0.05％的吐温-20，质量浓度为2％的牛血清白蛋白，pH为7.2、浓度为20mM的磷酸盐缓冲液倍比稀释已知高效价的阳性样本，得到八组效价分别为1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280的阳性稀释样本，备用。

S2、取八组上述阳性稀释样本各100μL，并分别与50μL上述实施例3提供的检测标记物进行混合，并置于室温下进行反应5min，得到八组胶体金-抗原-抗体结合物。其中一组胶体金-抗原-抗体结合物的光吸收图谱如附图3所示，从图1和3可以看出，与原来的胶体金溶液的颜色相比，胶体金-抗原-抗体结合物的颜色发生了变化。

S3、分别对八组胶体金-抗原-抗体结合物550nm波长的OD值进行测试，根据八组OD值绘制标准曲线，如附图4所示，从图中可以看出，随着阳性稀释样本的效价的变化，其对应550nm波长的OD值也随之变化。

S4、取5μL待检测样品、95μL磷酸盐缓冲液(pH为7.2，浓度为20mM，且含有质量浓度为0.05％的吐温-20，质量浓度为2％的牛血清白蛋白)以及50μL上述实施例3提供的检测标记物进行混合，并置于室温下进行反应5min，得到待检测结合物。需要说明的是，所有用于检测2019-nCov特异性抗体的样本都需要进行灭话处理，单独存放，严格管理。

S5、对上述待检测结合物550nm波长的OD值进行测试，并根据上述如附图4所示的标准曲线，即可计算得到待检测样品中2019-nCov特异性抗体的效价(含量)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。