生物素标记的dna及其制备方法、试剂盒

文档序号：1542519 发布日期：2020-01-17 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 生物素标记的dna及其制备方法、试剂盒 (Biotin labeled DNA, preparation method and kit thereof ) 是由高晨燕王光亮祝亮何凡王晓炜于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种生物素标记的DNA及其制备方法、试剂盒。该生物素标记的DNA的制备方法包括以下步骤：将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应,得到含有咪唑基的DNA,其中,活化剂包括碳二亚胺；及将连接有氨基的生物素与含有咪唑基的DNA反应,得到生物素标记的DNA。上述生物素标记的DNA的制备方法具有能够大规模生产,产量较高且成本低等优点。(The invention relates to biotin-labeled DNA, a preparation method thereof and a kit. The preparation method of the biotin-labeled DNA comprises the following steps: mixing an activating agent, a compound containing an imidazolyl group and DNA, and then reacting to obtain DNA containing the imidazolyl group, wherein the activating agent comprises carbodiimide; and reacting the biotin connected with the amino group with DNA containing imidazolyl to obtain biotin-labeled DNA. The preparation method of the biotin-labeled DNA has the advantages of large-scale production, high yield, low cost and the like.)

生物素标记的DNA及其制备方法、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物素标记的DNA及其制备方法、试剂盒。

背景技术

近来，由于生物素标记的抗原或抗体与结合了酶的亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使检测更加灵敏。因此，生物素标记的抗原或抗体得到了广泛的应用。

目前，针对蛋白类的抗原或抗体，主要采用NHS-(PEG)n-biotin对抗原或抗体进行标记。该方法简单方便，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的基团能在温和的条件下与抗原或抗体的氨基发生反应，然后生成抗原/抗体-(PEG)n-biotin的复合物，该复合物中的biotin(生物素)可以链霉亲和素(SA)反应结合，在化学发光免疫分析中得到广泛应用。

但是，目前针对非蛋白类的抗原要通过生物学的方法进行标记。例如双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)，主要是通过PCR扩增来进行生物素标记：在PCR的dNTPs中加入一定比例的标记有生物素的dUTP，通过PCR标记有生物素的dUTP被加入到新合成的dsDNA双链中，得到标记有生物素的dsDNA。但是通过PCR扩增来进行生物素标记的方法需要运用PCR，一般PCR的扩增体系的总体积为10μL或者50μL。所以，每次完成的量较少，很难满足工业需求。并且通过PCR扩增来进行生物素标记的方法需要生物素标记的dUTP、dNTP和酶，而生物素标记的dUTP、dNTP和酶价格均比较高，因而使得生产成本过高，难以工业推广。

发明内容

基于此，针对生物素标记的dsDNA的产量少且成本高的问题，有必要提供一种生物素标记的dsDNA的制备方法。

一种生物素标记的DNA的制备方法，包括以下步骤：

将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应，得到含有咪唑基的DNA，其中，所述活化剂包括碳二亚胺；及

将连接有氨基的生物素与所述含有咪唑基的DNA反应，得到生物素标记的DNA。

上述生物素标记的DNA的制备方法通过化学方法将生物素连接到DNA上，与传统通过PCR扩增获得生物素标记的DNA的生物学方法相比，具有能够大规模生产，产量较高且成本低等优点，并且通过上述生物素标记的DNA的制备方法上制备得到的生物素标记的DNA在化学发光免疫分析检测中，发光强度较传统生物学更高，进而使得生物素标记的DNA应用于化学发光免疫分析检测时的灵敏度更高。

在其中一个实施例中，所述含有咪唑基的化合物为单环咪唑化合物。

在其中一个实施例中，所述含有咪唑基的化合物选自咪唑、甲基咪唑及N,N-羰基二咪唑中的至少一种。

在其中一个实施例中，在所述连接有氨基的生物素中，所述氨基通过连接臂与所述生物素连接。

在其中一个实施例中，所述连接臂的原料选自聚乙二醇及α-氨基戊二酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述连接臂的原料为HO(CH₂CH₂O)_nH，n为3～10的任一整数。

在其中一个实施例中，所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种。

在其中一个实施例中，在所述将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应的步骤之后，还包括加入巯基化合物，以终止所述活化剂与所述含有咪唑基的化合物和所述DNA的反应的步骤。

一种生物素标记的DNA，所述生物素标记的DNA通过DNA的磷酸基团与生物素连接。

在其中一个实施例中，所述磷酸基团与所述生物素通过连接臂连接；所述连接臂的原料选自聚乙二醇及α-氨基戊二酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述连接臂为-(CH₂CH₂O)_n-，n为3～10的任一整数。

一种试剂盒，包括由上述生物素标记的DNA。

附图说明

图1为一实施方式的生物素标记的DNA的制备方法的合成路线；

图2为图1的生物素标记的DNA的制备方法中生成含咪唑基的DNA的合成路线；

图3为实施例8的dsDNA抗体浓度与对应待测液的发光值的关系柱状图；

图4为实施例8的dsDNA抗体浓度与对应待测液的发光值的拟合曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种生物素标记的DNA，该生物素标记的DNA通过DNA的磷酸基团与生物素连接。进一步地，磷酸基团与生物素通过连接臂连接。通过连接臂能够增加生物素与DNA分子之间的间隔，减少生物素对DNA的影响。具体地，连接臂的原料选自聚乙二醇及α-氨基戊二酸中的至少一种。当然，在其中一些实施方式中，连接臂的原料还可以是其他化合物。

在其中一个实施例中，连接臂为-(CH₂CH₂O)_n-，n为3～10的任一整数。进一步地，n为3、5或10。更进一步地，n为3。

经实验验证，上述生物素标记的DNA的发光强度较传统生物学更高，进而使得生物素标记的DNA应用于化学发光免疫分析检测时的灵敏度更高。

请参阅图1，本发明一实施方式提供了一种生物素标记的DNA的制备方法，包括步骤S110～步骤S120。

步骤S110、活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应，得到含有咪唑基的DNA。活化剂包括碳二亚胺。

具体地，活化剂包括碳二亚胺。活化剂用于活化DNA的磷酸基团，以使DNA能够与含有咪唑基的化合物反应。进一步地，活化剂用于活化DNA的磷酸基团的羟基。

在其中一个实施例中，碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种。进一步地，活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简称EDC。在图示的实施方式中，活化剂为EDC。

具体地，含有咪唑基的化合物用于活化DNA的磷酸基团，以使生物素能够连接到DNA上。在本实施方式中，含有咪唑基的化合物为单环咪唑化合物。当然，在其他实施方式中，含咪唑基的化合物还可以非单环咪唑化合物，例如并环咪唑化合物或含有杂环的化合物，只要含有的咪唑基不被其他结构干扰，具有活性即可。在其中一个实施例中，含有咪唑基的化合物选自咪唑、甲基咪唑及N,N-羰基二咪唑中的至少一种。

在本实施方式中，DNA是指双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)，因为在自身免疫检测中，dsDNA经常作为抗原，对于免疫性疾病的检测具有重要意义。当然，对于DNA具体的核苷酸序列结构不作限定，只要是dsDNA即可。可以理解的是，在其他一些实施方式中，DNA也可以是单链DNA，只要DNA具有磷酸基团即可。需要说明的是，本文中的磷酸基团是指具有如下所示的结构的基团：

在图示的实施方式中，dsDNA为

含有咪唑基的DNA为

请参阅图2，活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应包括：活化剂与DNA发生反应，将DNA的磷酸基团的羟基进行活化，得到羟基活化后的DNA；然后羟基活化后的DNA与含有咪唑基的化合物反应，得到含有咪唑基的DNA。进一步地，活化剂与DNA发生反应为加成反应。羟基活化后的DNA与含有咪唑基的化合物发生的反应为取代反应。

在图示的实施方式中，羟基活化后的DNA为

具体地，活化剂与含有咪唑基的化合物和DNA反应的条件为：16℃～30℃反应0.5h～2h。进一步地，反应的温度为22℃～28℃，反应的时间为0.75h～1.5h。

在其中一个实施例中，在将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应的步骤之后，还包括加入巯基化合物，以终止活化剂与含有咪唑基的化合物和DNA的反应的步骤。巯基化合物能够淬灭活化剂碳二亚胺，避免含有咪唑的化合物和DNA进一步反应。进一步地，巯基化合物选自巯基乙醇、巯基苏糖醇、半胱氨酸和半胱氨酸盐酸盐中的至少一种。更进一步地，巯基化合物为巯基乙醇。

在其中一个实施例中，将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应，得到含有咪唑基的DNA的步骤包括：将活化剂、含有咪唑基的化合物及DNA混合后进行反应，得到含有咪唑基的DNA的第一反应液；以及对含有咪唑基的DNA的第一反应液纯化处理，得到含有咪唑基的DNA。纯化处理的目的是将第一反应液中含有咪唑基的DNA和其他物质分离。例如将含有咪唑基的DNA和未参与反应的含有咪唑基的化合物及/或活化剂分离。当然，对纯化处理的方式有多种，例如超滤纯化、脱盐柱纯化、透析纯化等。在对含有咪唑基的DNA的第一反应液进行纯化处理时，可以选择上述其中一种纯化方式，也可以将多种纯化方式结合。在本实施方式中，纯化含有咪唑基的DNA的第一反应液的方式为脱盐柱纯化或超滤纯化。

步骤S120、将连接有氨基的生物素与含有咪唑基的DNA反应，得到生物素标记的DNA。

具体地，连接有氨基的生物素中的氨基和含有咪唑基的DNA的咪唑基进行反应，得到生物素标记的DNA。

在其中一个实施例中，连接有氨基的生物素还连接有连接臂，连接臂的一端与氨基连接，连接臂的另一端与生物素连接。连接臂的作用是增大DNA与生物素之间的距离，减少DNA对于生物素的位阻，便于后续亲和素与生物素的反应。进一步地，连接臂的原料选自聚乙二醇及α-氨基戊二酸中的至少一种。更进一步地，连接臂的原料为聚乙二醇。在本实施方式中，连接臂的原料为HO(CH₂CH₂O)_nH，n为3～10的任一整数。进一步地，n为3、5或10。更进一步地，n为3。

在其中一个实施例中，连接臂为-(CH₂CH₂O)_n-，n为3～10的任一整数。连接有氨基和连接臂的生物素为：氨基-(CH₂CH₂O)_n-生物素(即Amine-(CH₂CH₂O)_n-biotin)。

在图示的实施方式中，连接有氨基和连接臂的生物素为

生物素标记的DNA为

在其中一个实施例中，将连接有氨基的生物素与含有咪唑基的DNA反应，得到生物素标记的DNA的步骤包括：将连接有氨基的生物素与含有咪唑基的DNA反应，得到含有生物素标记的DNA的第二反应液；然后对含有生物素标记的DNA的第二反应液进行纯化处理。纯化处理的目的是将第二反应液中的生物素标记的DNA和其他物质分离。例如将生物素标记的DNA和未参与反应的连接有氨基的生物素分离。当然，对纯化处理的方式有多种，例如超滤纯化、脱盐柱纯化、透析纯化等。在对生物素标记的DNA的第二反应液进行纯化处理时，可以选择上述其中一种纯化方式，也可以将多种纯化方式结合。在本实施方式中，纯化含有生物素标记的DNA的第二反应液的方式为脱盐柱纯化或超滤纯化。

上述生物素标记的DNA的制备方法至少包括以下优点：

(1)能够大规模生产，产量较高：传统生物法是通过PCR扩增获得生物素标记的DNA，一般PCR的扩增体系的总体积为10μL或者50μL，每次完成的量较少。与传统生物法的制备生物素标记的DNA相比，上述生物素标记的DNA的制备方法是通过化学的方法将生物素标记到DNA上，能够实现大规模生产，产量较高。

(2)成本较低：传统生物法通过PCR扩增获得生物素标记的DNA时，需要生物素标记的dUTP、dNTP和酶，而生物素标记的dUTP、dNTP和酶价格均比较高，并且PCR扩增需要在PCR仪中进行，也增加了生产成本。与传统的生物法相比，上述生物素标记的DNA的制备方法的原料易得，且原料成本较低，整个制备条件容易满足，生产成本较低。

(3)制备得到的生物素标记的DNA在化学发光免疫分析检测中，发光强度较传统生物学更高，进而使得生物素标记的DNA应用于化学发光免疫分析检测时的灵敏度更高。

此外，本发明一实施方式还提供一种生物素标记的DNA，该生物素标记的DNA由上述任一实施例的生物素标记的DNA的制备方法制得。

本发明一实施方式还提供上述任一实施例的生物素标记的DNA在制备试剂盒中的应用。

本发明一实施方式还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述生物素标记的DNA。

具体地，上述试剂盒包括标记物，标记物包括上述生物素标记的DNA。

在其中一个实施例中，上述试剂盒包括载体、包被抗原及标记物；该试剂盒利用检测形成的包被抗原-待检抗体-标记物复合物的量来实现待测抗体的检测。

具体地，包被抗原包括上述生物素标记的DNA。标记物为带标记的待检抗体的抗体(抗抗体或称二抗)，标记物能够与待检抗体特异性结合，但不与上述生物素标记的DNA结合，标记物上标记有化学发光或生物发光的物质，以使在相应的条件作用下能够发光而被检测。载体用于将包被抗原-待检抗体-标记物反应形成的包被抗原-待检抗体-标记物复合物与其他物质分离。在本实施方式中，载体为亲和素包被的磁珠。当然，在其他实施方式中，载体还可以是包被有亲和素的纤维素膜。

上述试剂盒包括上述生物素标记的DNA，亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性，而且还可以利用亲和素与生物素之间的多级放大效应，使得该试剂盒的检测灵敏度更高。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)将EDC和咪唑分别溶于纯水中制备成浓度为2mM的EDC和浓度为100mM的咪唑。将0.1mL浓度为2mM的EDC和0.1mL浓度为100mM的咪唑与0.8mL浓度为10mg/mL的dsDNA(鲑鱼精DNA，sigma)中，在25℃条件下反应1h，得到第一反应液。

(2)用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)，以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液将步骤(1)得到的第一反应液过柱3遍，以去掉多余未反应的咪唑和EDC，得到含有咪唑基的DNA。