阅读说明：本技术 一种基于高通量测序的物种鉴定系统和方法 (Species identification system and method based on high-throughput sequencing ) 是由 姜帆 朱水芳 张永江 于 2020-02-18 设计创作，主要内容包括：本发明“一种基于高通量测序的物种鉴定系统和方法”,涉及物种鉴定技术,包含可远程访问的服务器；所述服务器包含数据预处理模块和物种鉴定模块；所述数据预处理模块用于根据用户数据分析启动指令调取核酸序列数据处理工具对用户提供的高通量测序数据进行预处理得到经预处理数据；所述物种鉴定模块基于经预处理数据进行数据比对分析得出物种鉴定结果。(The invention discloses a species identification system and method based on high-throughput sequencing, which relates to a species identification technology and comprises a server which can be remotely accessed; the server comprises a data preprocessing module and a species identification module; the data preprocessing module is used for calling a nucleic acid sequence data processing tool according to a user data analysis starting instruction to preprocess high-throughput sequencing data provided by a user to obtain preprocessed data; and the species identification module performs data comparison analysis based on the preprocessed data to obtain a species identification result.)

一种基于高通量测序的物种鉴定系统和方法

技术领域

本发明涉及物种鉴定技术，特别是一种基于高通量测序的物种鉴定方法及系统。

背景技术

随着全球贸易的飞速发展和国际交流日益增加，出入境检验检疫工作迎来了前所未有的挑战，目前口岸工作面临业务量大，人员不足，鉴定专家缺乏等诸多难题。如何在确保检验检疫质量的同时，又能缩短检验检疫周期，加快通关速度，成为一大难题，因此必须提供新的检疫鉴定技术。

DNA条形码技术是利用一段或者几段标准的、易扩增的、种间差异大于种内差异的DNA片段来进行物种鉴定的新技术，最早由加拿大学者Hebert提出。与传统的分类鉴定技术相比，DNA条形码技术具有操作简单，不受个体发育阶段和形态特征的限制等优点，使不具备物种分类鉴定知识的人也可以通过该技术对物种进行鉴定。该技术一经提出便迅速成为分子分类学及分子鉴定技术的核心方法，在生物物种鉴定方面发挥了重要作用。但传统的DNA条形码技术通常一次只能鉴定出一种或者少数几种物种，不能一次性快速分析出数百万基因序列、鉴定上千种物种。而多数情况下，待测样品通常是多种不同物种的混合物，特别是病原微生物，因此同时对混合样品多物种进行鉴定的需求越来越大。

传统的DNA条形码技术基于一代测序技术，但一代测序技术无法同时完成对多个体多物种混合样品进行检测。高通量测序技术可以同时获得样本中每个物种的DNA序列，具有测序通量高、速度快、成本低等优点，近年来被广泛应用生物安全、医药卫生等各个领域。

目前高通量测序技术已经在各个物种鉴定领域发挥重要的作用，随着鉴定的物种类群的增加，急需一套能同时快速鉴定各个类群物种的智能鉴定方法和系统。

发明内容

本发明提供一种基于高通量测序的物种鉴定方法和系统，针对的物种包括：病毒、类病毒、细菌、真菌、寄生虫等，在一小时之内可以同时鉴定出上千种物种。请求保护以下技术方案：

一种基于高通量测序的物种鉴定系统，其特征在于，包含可远程访问的服务器；

所述服务器包含数据预处理模块和物种鉴定模块；

所述数据处理预模块用于根据用户数据分析启动指令调取核酸序列数据处理工具对用户提供的高通量测序数据进行预处理得到经预处理数据，测序数据包括PCR扩增子测序数据以及siRNA测序数据；

对于来自PCR扩增子的测序数据的预处理，包括

去接头、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得用于后续分析的有效序列的集合；以及对所述有效序列的集合进行归类操作即OTU聚类分析得到所述经预处理数据；

对于来自siRNA的测序数据的预处理，包括对所述siRNA测序数据进行组装得到病毒重叠群(contig)和类病毒基因组群，得到所述经预处理数据；

所述物种鉴定模块用于基于所述经预处理数据进行数据比对分析得出物种鉴定结果：包括真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元，用于将全部所述经预处理数据进行真核、原核和病毒类病毒分类，将分类后的经预处理数据分配到对应的真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元中，各鉴定单元将经预处理数据与本地存储或在线关联的已知物种参考序列数据库进行BLAST比对,得出物种鉴定结果，并合并各鉴定单元的结果，生成用户可下载的物种鉴定报告。

优选地，在所述物种鉴定系统，

真核生物鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包含BOLD、NT；

原核生物鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包括BOLD、NT、UNITE、RDP、Sliva或GreenGene；

病毒类病毒鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包括NT、NR。

优选地，在所述物种鉴定系统，所述核酸序列数据处理工具包括无关数据过滤软件；

用于过滤接头的CutAdapt软件；

用于OTU聚类分析的CD-hit,Uclust、BLAST、mothur、usearch或

prefix/suffix；用于进行病毒类病毒序列组装的软件。

优选地，在所述物种鉴定系统，所述物种鉴定模块被配置为：

对于来自PCR扩增子的数据，当经预处理数据中某一序列与物种鉴定数据库中的一个已知参考序列相似性达到预定值，优选设定为97％，判定待检验检疫物品中含有该已知参考序列代表的物种。

对于siRNA测序数据，将经预处理数据中的病毒重叠群(contig)与NR库进行进行blastn比对，如果blastn相似性大于90％且覆盖度大于85％，则继续进行blastx，如果blastx相似性与blastn的相似度差异在10％以内为相似度高，判断为已知病毒；否则判断为新病毒，并通过与相似序列进行家族性进化树构建，识别新病毒；

将经预处理数据中的类病毒基因组群与NR库进行blastn比对，如果相似性大于90％，则判断为已知类病毒；否则继判断是否存在保守区域，如不存在则判断为未知病毒，如存在，则判断为新类病毒，并通过与相似序列家族性进化树构建，识别新类病毒。

优选地，在任一所述物种鉴定系统，

还包含用户数据管理模块和数据存储模块；

所述用户数据管理模块用于管理用户权限、存储用户输入的用户数据、历次上传的测序数据和历次得出的物种鉴定报告；

所述数据存储模块用于存储所述核酸序列数据处理工具、已知物种参考序列数据库、以及经物种鉴定模块得出结论的物种基因序列数据。

优选地，在任一所述物种鉴定系统，还包含至少一台客户端，所述客户端与服务器通过直接连接或网络连接，可通过客户端远程访问所述服务器，向服务器上传测序数据、设定鉴定条件、下载鉴定报告；

所述客户端选自笔记本电脑、智能手机、平板电脑。

本发明的另一方面，还提供一种基于高通量测序的物种鉴定方法，包含以下步骤：

(1)提取核酸：

对初步判断病原菌为真菌、细菌或寄生虫的材料，提取DNA；

对初步判断病原菌仅为病毒类病毒的材料，提取RNA；

对初步判断病原菌种类多样或种类不清楚的材料，提取RNA和DNA；

(2)对提取的RNA进行siRNA测序得到siRNA测序数据；

对提取的DNA，采用物种分类通用引物进行PCR；

(3)混合所有物种分类通用引物的PCR产物，加测序接头制作测序文库；

(4)对文库进行高通量双端测序，获得PCR扩增子测序数据；

(5)将siRNA测序数据和PCR扩增子测序数据提供给上述任一物种鉴定系统完成以下步骤：

对测序数据进行预处理得到经预处理数据：

对于来自PCR扩增子的测序数据的预处理,包括

去接头、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得用于后续分析的有效序列的集合；以及对所述有效序列的集合进行归类操作即OTU聚类分析得到所述经预处理数据，包含代表样品中所含物种的代表性测序序列；

对于来自siRNA的测序数据的预处理，包括对所述siRNA测序数据进行组装得到病毒重叠群和类病毒基因组群，得到所述经预处理数据，包含样品所含病毒类病毒种类的代表性测序数据；

对经预处理数据进行物种鉴定：将全部所述经预处理数据与物种鉴定模块中的真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元进行匹配，并在不同鉴定单元中将匹配到该单元的若干代表性测序序列与本地存储或在线关联的已知物种参考序列数据库同时进行BLAST比对,得出物种鉴定结果，并生成用户可下载的物种鉴定报告。

优选地，所述物种分类通用引物选自一对或多对真菌通用引物、一对或多对细菌通用引物以及一对或多对寄生虫通用引物。

优选地，所述物种分类通用引物中含有物种DNA条形码标签；所述数据预处理还包含：根据PCR扩增子测序序列中包含的DNA条形码标签确定样本来源以对样本进行拆分。

优选地，所述细菌通用引物：细菌16S rRNA基因V3-V4区扩增引物：

322F-1:ACGGHCCARACTCCTACGGA，

796R:CTACCMGGGTATCTAATCCKG；

所述真菌通用引物，ITS基因扩增引物：

ITS1F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。

本领域技术人员可获取真菌，细菌或寄生虫的其它通用引物来完成本发明。

本发明提供一种基于高通量测序的物种鉴定系统，其搭建的内部数据处理模块能够多对来自待测样品的核酸的高通量测序数据进行集中处理和物种鉴定，在一小时内的一次鉴定结果可以涵盖数千种检疫性物种，特别适合跨境生物鉴定，能显著提高口岸清关效率。

本发明的方法中，在检验检疫物品中待鉴定物种类群明确的情况下，采用已知针对不同类群的核酸提取技术提取即可；在检验检疫物品中待鉴定物种类群未知的情况下，采用商业化的DNA和RNA共提取试剂盒对核酸进行同时提取。

本发明中采用的物种分类通用引物的要求是有足够的通用性以保证尽可能多的扩增出目标物种，同时又要保证所扩增的片段有足够的变异能够区分不同物种；每个类群至少一对通用引物，也可根据需要采用多对引物同时扩增。

本发明的系统预处理中，包括根据测序得到的原始fastq文件统计测序总长、序列长度分布、各个位置平均碱基质量值、序列平均碱基质量值、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得后续分析的有效序列集合。

例如通过Pandaseq软件利用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads拼接成一条序列，得到高变区的长Reads，对拼接后的Reads进行去除和筛选处理，保留引物的错配数在2个以内的序列，根据长度小于220bp、平均质量值低于 20以及超过3个含N碱基数的Reads，得到Clean Reads即有效序列。

数据预处理中进行的OTU分析是对序列进行归类操作(cluster)，为明确样品测序后的的种、属等分布信息。主要原理是根据序列的相似性(在系统中可设置相似参数，比如设置在97％的相似水平上进行归类)，将序列归为多个OUT；同时在每个OTU中挑取出现次数最多的一条序列作为物种代表序列，合并成一个代表序列集合；OTUs生成时，在序列条数≥2的OTU，即认为是有意义的OTU，可用于后续分析。在物种鉴定模块中，所有代表序列同时与数据库进行比对得出结果，因此，可以同时鉴定出上千种物种。

本发明提供的方法和系统，在一小时内的一次鉴定结果可以涵盖数千种检疫性物种，无论待测物所携带/包含物种来自国内还是国外，都可以鉴定，

附图说明

图1.本发明物种鉴定系统的一种实施方案示意图；

图2.本发明物种鉴定系统的一种实施方案示意图；

图3.本发明鉴定方法中真核生物和原核生物物种鉴定数据处理流程；

图4.本发明鉴定方法中病毒、类病毒鉴定数据处理流程；

图5-7.本发明基于高通量测序的物种鉴定系统客户端用户界面登陆界面示例；

图8-10.本发明物种鉴定系统鉴定结果报告界面客户端示例；

图11.核酸提取检测结果

图12.PCR扩增检测结果

具体实施方式

结合附图说明本发明的方法和系统的一些示例性实施方案，不用限制本发明的保护范围。

物种鉴定系统

如图1所示，在本发明所有实施方案中，提供一种基于高通量测序的物种鉴定系统，其特征在于，包含可远程访问的服务器；所述服务器包含数据预处理模块和物种鉴定模块；

所述数据处理预模块用于根据用户数据分析启动指令调取核酸序列数据处理工具对用户提供的测序数据进行预处理得到经预处理数据，测序数据包括 PCR扩增子测序数据以及siRNA测序数据；

对于来自PCR扩增子的测序数据的预处理,包括

去接头、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得用于后续分析的有效序列的集合；以及对所述有效序列的集合进行归类操作即OTU聚类分析得到所述经预处理数据，包含代表样品中所含物种的代表性测序序列；

对于来自siRNA的测序数据的预处理，包括对所述siRNA测序数据进行组装得到病毒重叠群和类病毒基因组群，得到所述经预处理数据，包含样品所含病毒类病毒种类的代表性测序数据；

对经预处理数据进行物种鉴定：将全部所述经预处理数据与物种鉴定模块中的真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元进行匹配，并在不同鉴定单元中将匹配到该单元的若干代表性测序序列与本地存储或在线关联的已知物种参考序列数据库同时进行BLAST比对,得出物种鉴定结果，并生成用户可下载的物种鉴定报告。

在所述系统的一些实施方案中，优选

真核生物鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包含BOLD、NT；

原核生物鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包括BOLD、NT、UNITE、RDP、Sliva或GreenGene；

病毒类病毒鉴定单元关联且可以调取以进行BLAST比对的已知物种参考序列数据库包括NT、NR。

在所述系统的一些实施方案中，优选

所述核酸序列数据处理工具包括无关数据过滤软件；

用于过滤接头的CutAdapt软件；

用于OTU聚类分析的CD-hit,Uclust、BLAST、mothur、usearch或 prefix/suffix；用于进行病毒类病毒序列组装的软件。

在所述系统的一些实施方案中，优选所述物种鉴定模块被配置为：

对于来自PCR扩增子的数据，当经预处理数据中某一序列与物种鉴定数据库中的一个已知参考序列相似性达到预定值，优选设定为97％，判定待检验检疫物品中含有该已知参考序列代表的物种。

对于siRNA测序数据，将经预处理数据中的病毒重叠群(contig)与NR库进行进行blastn比对，如果blastn相似性大于90％且覆盖度大于85％，则继续进行blastx，如果blastx相似性与blastn的相似度差异在10％以内为相似度高，判断为已知病毒；否则判断为新病毒，并通过与相似序列进行家族性进化树构建，识别新病毒；

将经预处理数据中的类病毒基因组群与NR库进行blastn比对，如果相似性大于90％，则判断为已知类病毒；否则继判断是否存在保守区域，如不存在则判断为未知病毒，如存在，则判断为新类病毒，并通过与相似序列家族性进化树构建，识别新类病毒。

在所述系统的一些实施方案中，优选

还包含用户数据管理模块和数据存储模块；

所述用户数据管理模块用于管理用户权限、存储用户输入的用户数据、历次上传的测序数据和历次得出的物种鉴定报告，如图1和图2；

如图2，所述数据存储模块用于存储所述核酸序列数据处理工具、已知物种参考序列数据库、以及经物种鉴定模块得出结论的物种基因序列数据。

其中一种实施方案中搭建的系统的客户端用户界面登陆界面如图5-7所示，鉴定结果报告界面示例如图8-图10所示。

物种鉴定方法

实施例1.本发明一种基于高通量测序的物种鉴定方法

表1待检测材料

注：表中材料1-5为实验室培养已知病原物植物材料，用于测试系统。

材料6-11，病原物可初步判断为真菌或细菌，但是病原物种类未知。

1.对来自待检验检疫物品的代表性样品提取核酸

采用OMEGA公司生产的E.Z.N.A.TM Plant DNA/RNA Kit(R6733)试剂盒

(1)称取200mg～2g植物样品或植物种子在液氮中研磨至粉末状，将植物样品粉末或植物种子粉末转入1.5mL离心管中，为保证后续核酸提取质量，每个 1.5mL离心管中植物样品粉末≤100mg或植物种子粉末≤40mg。随后向每个 1.5mL离心管中加入500μL CPL缓冲液(使用前，每1mL CPL缓冲液加入20 μL 2-巯基乙醇混合，混合液可在室温条件下保存1个月。)，55℃水浴10min。

(2)加入500μL氯仿，震荡30s，13,000×g离心5min。

(3)转移350μL上清液至新离心管中，并向其中加入350μL PR缓冲液，震荡混匀，将混合液转移至DNA吸附柱(DNA吸附柱放入2mL收集管中)， 10，000×g离心1min，将DNA吸附柱放置室温或4℃待后续用于DNA提取，洗脱液用于后续RNA提取。

DNA提取(材料1-3，6-11)

(4)将(3)所得DNA吸附柱放入新的2mL离心管中，向DNA吸附柱中加入500μL DNA洗涤缓冲液，10，000×g离心1min，弃掉滤液。

(5)向DNA吸附柱中加入500μL DNA洗涤缓冲液，14，000×g离心2min，弃掉滤液。可适当延长离心时间以保证DNA吸附柱彻底干燥。

(6)将DNA吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间悬空滴加 50～100μL TE缓冲液，室温放置2min，10，000×g离心2min，DNA被洗脱到离心管中，分装，做好标记，-80℃保存备用。

RNA提取(材料4、5)

(7)向(3)所得的洗脱液中加入0.5倍洗脱液体积的无水乙醇，轻轻混匀。

(8)将700μL A.3.4所得液体转移至RNA吸附柱(RNA吸附柱放入2mL 收集管中)，10，000×g离心1min，弃掉滤液。

(9)将剩余A.3.4所得液体转移至RNA吸附柱，10，000×g离心1min，弃掉滤液。

(10)向RNA吸附柱中加入500μL RWC洗涤缓冲液，10，000×g离心1min，弃掉滤液。

(11)向RNA吸附柱中加入500μL RNA洗涤缓冲液II(使用前按说明要求加入相应量的无水乙醇)，10，000×g离心1min，弃掉滤液。

(12)向RNA吸附柱中加入500μL RNA洗涤缓冲液II，10，000×g离心2 min，弃掉滤液。可适当延长离心时间以保证RNA吸附柱彻底干燥。

(13)将RNA吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间悬空滴加 40～70μLDEPC(焦碳酸二乙酯)洗脱缓冲液，室温放置2min，14，000×g离心1min，RNA被洗脱到离心管中。

(14)为提高RNA浓度，可重新吸取离心得到的RNA，再加入RNA吸附柱中，室温放置2min，14，000×g离心1min。

(15)RNA被洗脱到离心管中，分装，做好标记，-80℃保存备用。

(16)结果检测：将提取的核酸样品(DNA和RNA)分别进行细菌16s、真菌ITS、病毒反转录PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图11所示，成功提取了DNA和RNA。

2.对提取的DNA，采用物种分类通用引物进行PCR

细菌通用引物：细菌16S rRNA基因V3-V4区扩增引物：

322F-1:ACGGHCCARACTCCTACGGAA

796R:CTACCMGGGTATCTAATCCKG

真菌通用引物，ITS基因扩增引物：

ITS1F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

25ul

扩增反应体系：

扩增反应条件：

将多重扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图12：

3.将所得的PCR产物进行Illumina Miseq双端测序构建文库；

步骤1中所提取的RNA进行小RNA测序；

获得原始测序数据fastq格式文件，所得的原始测序数据信息如下：

PCR扩增子总共获得274823条有效序列，序列总长为116938514，平均序长为425bp左右。

siRNA测序数据总共获得165Mb数据，20万条左右有效序列，平均序长为 21.8nt左右，中位数长度为21nt。

4.将原始测序数据提供给本发明物种鉴定系统完成物种鉴定：

对测序数据进行预处理得到经预处理数据：

对于来自PCR扩增子的测序数据的预处理,包括

去接头、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得用于后续分析的有效序列的集合；以及对所述有效序列的集合进行归类操作即OTU聚类分析得到所述经预处理数据；

对于来自siRNA的测序数据的预处理，包括对所述siRNA测序数据进行组装得到病毒重叠群和类病毒基因组群，得到所述经预处理数据；

对经预处理数据进行物种鉴定：将全部所述经预处理数据与物种鉴定模块中的真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元进行匹配，并在不同鉴定单元中将匹配到该单元的经预处理数据与本地存储或在线关联的已知物种参考序列数据库进行BLAST比对,得出物种鉴定结果，并生成用户可下载的物种鉴定报告。

鉴定结果整理如表2所示。

材料1-5为实验室培养的已知材料，经系统鉴定的结果符合预期。

表明所开发的系统可用于基于新一代测序技术的病原微生物一次性高通量检测。

实施例2.常见蝇类携带细菌性病原体鉴定

实验材料：采集自中山市紫马岭公园，竹苑小区、沙岗墟等生境的12个麻蝇样品。

实验步骤如下：

1.体表携带细菌的收集方法

取1只病媒昆虫(麻蝇)置于适中的离心管中，加入可浸没该病媒生物的0.9％NaCl溶液，800r/min漩涡振荡30s，短暂离心。收集上清转移至新的离心管中 13，800×g离心2min。弃上清，留沉淀。重复以上步骤3次。

将收集的细菌沉淀，加入500μL 0.9％NaCl溶液悬浮后合并，4℃保存备用。

收集的废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃。

2.提取DNA

将装有菌液的离心管13，800×g离心2min，转移上清液并高压灭菌处理。收集沉淀进行细菌DNA的提取，提取方法如下。

向离心管内加入180μL溶菌酶溶液(20mg/mL)和20μL Proteinase K溶液，用移液器吸打混匀。

加入220μL Buffer GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变的清亮，简短离心去除管盖和内壁的水珠。

加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管盖和内壁的水珠。

将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，13，800×g离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前应检查是否加入无水乙醇)， 13，800×g离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前应检查是否加入无水乙醇)， 13，800×g离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，13，800×g离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

将吸附柱CB3放回收集管中，13，800×g离心2min，弃废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱CB3转入一个干净的EP管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50 μLddH2O，室温放置5min，13，800×g离心2min，EP管中收集到的即为提取出的DNA溶液。

3.PCR扩增

扩增细菌样本16S rRNA的V3～V4高变区基因。

扩增引物为基于以下正向引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)加barcode序列所得的 5对引物，具体如下：

(A)341FA:TCAGAGCTACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

(B)341FB:AGCTCTGACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

(C)341FC:GATCTCACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

(D)341FD:CTGAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

(E)341FE:CATGATGCACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

PCR扩增体系(50μL)

组分名称	体积μL
		缓冲液(2×)	25
dNTP(2mmol/L)	2.5
		高成功率PCR酶(1U/μL)	1
正向引物(20μmol/L)	1
		反向引物(20μmol/L)	1
模板DNA	3
		ddH<sub>2</sub>O	16.5

PCR扩增条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环；68℃延伸10min；10℃保温。

PCR产物检测和纯化,参见SN/T 4278中“PCR产物的检测”执行操作。

PCR产物浓度测定：使用DNA浓度测定仪对PCR产物浓度和质量进行检测，以DNA溶解溶液做参比，分别测定样品溶液在260nm、280nm、230nm、 270nm处的吸收值，计算A₂₆₀/A₂₈₀，A₂₆₀/A₂₃₀，A₂₆₀/A₂₇₀的比值，同时满足以下条件的DNA样品可视为质量高的基因组DNA：A₂₆₀/A₂₈₀为1.8～1.9，A₂₆₀/A₂₃₀＞2.0，A₂₆₀/A₂₇₀为1.1～1.3。利用A₂₆₀＝1相当于50μg/mL的双链DNA计算DNA 浓度，要求PCR产物的DNA总量≥2μg，浓度≥50ng/μL。

4.高通量测序

使用全波长酶标仪对提取的细菌DNA及PCR产物进行检测定量，若浓度达到测序要求，按照带有不同barcode的引物进行混样，然后送交华大基因测序公司，样品质检合格后进行建库和测序。

测序采用Illumina HiSeq 2000测序平台，测序策略为PE300。

得到原始测序数据，12个麻蝇样品体表表细菌共得到405162条有效序列。

5.将测序数据提交本发明的物种鉴定系统进行以下处理：

对测序数据进行预处理得到经预处理数据

对于来自PCR扩增子的测序数据的预处理,包括

去接头、剔除低质量序列、嵌合体序列和过短序列，获得用于后续分析的有效序列的集合；以及对所述有效序列的集合进行归类操作即OTU聚类分析得到所述经预处理数据；

对经预处理数据进行物种鉴定：将全部所述经预处理数据与物种鉴定模块中的真核生物鉴定单元、原核生物鉴定单元、病毒类病毒鉴定单元进行匹配，并在不同鉴定单元中将匹配到该单元的经预处理数据与本地存储或在线关联的已知物种参考序列数据库进行BLAST比对,得出物种鉴定结果，并生成用户可下载的物种鉴定报告。

设置在97％相似度下进行聚类。

鉴定结果整理如下：

被鉴定的12个麻蝇样品体表所携带细菌被注释为8个门、19个纲、36个目、76个科、126个属和79个种。

在门分类等级上，主要有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。

在属分类等级上，主要有营发酵单胞菌属(Dysgonomonas)、漫游球菌属(Vagococcus)和普罗维登斯菌属(Providencia)三个属。

鉴定到的79个细菌中，包括5个致病菌，13个条件致病菌。

说明本发明的物种鉴定系统可实现一个小时内可以同时鉴定出若干种病原菌。