阅读说明：本技术 一种鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法 (Method for establishing Yersinia pestis protein library ) 是由 石丽媛 冯彬 王鹏 张海鹏 杨丰义 钟佑宏 董珊珊 谭红丽 郭英 段存娟 杨丽华 于 2020-04-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法,属于微生物鉴定技术领域。本发明所述方法将鼠疫耶尔森氏菌质谱图加入到蛋白质谱仪中,并通过引入二级算法,成功的将鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌鉴别区分开,使用该方法得到的质谱仪能够准确鉴定鼠疫耶尔森氏菌。(The invention discloses a method for establishing a Yersinia pestis protein library, belonging to the technical field of microorganism identification. The method adds the Yersinia pestis mass spectrogram into a protein spectrometer, successfully distinguishes the Yersinia pestis and the Yersinia pseudotuberculosis by introducing a secondary algorithm, and the mass spectrometer obtained by the method can accurately identify the Yersinia pestis.)

一种鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法

技术领域

本发明涉及一种鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法，属于微生物鉴定技术领域。

背景技术

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的一种自然疫源性疾病，严重危害人类健康。我国《传染病防治法》将鼠疫列为甲类传染病。历史上，鼠疫曾发生三次世界性的大流行，造成上亿人的死亡；2017年8月，非洲马达加斯加暴发鼠疫疫情，累计报告病例2600多例，死亡200多例；2019年11月北京确诊来自内蒙锡林郭勒的2例肺鼠疫病例，当月内蒙乌兰察布又先后确诊2例腺鼠疫病例。鼠疫对人类的威胁依然存在。

随着科技的快速发展，蛋白质谱技术已广泛应用于微生物的鉴定，而在耶尔森氏菌属中最对人类威胁最大的鼠疫耶尔森氏菌尚未在质谱仪中建库，不能被准确鉴定。例如由珠海美华医疗科技有限公司研发的M-Discover 100质谱检测仪，该仪器在细菌域的库容为5159株菌，在耶尔森氏菌属的库容为37株菌，包括假结核、小肠结肠炎、罗氏、鲁氏等耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌尚未在该质谱仪建库。

鼠疫耶尔森氏菌尚未入库的原因，一方面是鼠疫耶尔森氏菌具有高致病性，从事鼠疫耶尔森氏菌活动需要在高等级生物安全实验室进行，因此限制了一般机构或公司获得和使用鼠疫耶尔森氏菌，也同时限制了质谱仪鉴定鼠疫耶尔森氏菌的能力。另一方面，发明人实验时发现，鼠疫耶尔森氏菌未建库前，测试菌株为鼠疫耶尔森氏菌时，鉴定结果为假结核耶尔森氏菌(假结核耶尔森氏菌是与鼠疫耶尔森氏菌最近缘的种)；鼠疫耶尔森氏菌建库后，鼠疫耶尔森氏菌能鉴定成功，但假结核耶尔森氏菌鉴定错误，被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌。耶尔森氏菌属目前有 18种，其中对人类致病的有3种：鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌及小肠结肠炎耶尔森氏菌。鼠疫耶尔森氏菌认为是从假结核耶尔森氏菌进化而来的，这两种菌的基因组的相似度甚至超过了某些细菌种内菌株的相似度，但在细菌的致病性上有很大的差别，鼠疫耶尔森氏菌能引起腺鼠疫、肺鼠疫等，患者急性发病，在没有有效的抗生素治疗时快速死亡，肺鼠疫还能通过飞沫传播，在没有呼吸道防护的情况下，极易造成疾病的大面积流行。而假结核耶尔森氏菌感染，患者主要表现为肠道的感染和皮肤的红斑和结节等。因此两种耶尔森菌为人类的危害程度不一，一旦鉴定失败会带来严重的后果。

综上所述，将鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱纳入质谱仪库容中，不仅需要有菌株来源，需要配备相应的生物安全实验室，还存在技术难题，而如何解决鼠疫耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌发生鉴定混淆的问题，如何进一步区分鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌是现有技术难题的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法，具体包括以下步骤：

(1)选择建库菌株：选择3个以上不同疫源地的菌株，每个疫源地的菌株大于等于5株，用大肠杆菌E.coliATCC8739校正质控。

(2)对选取的菌株进行复苏、传代、大培养，并同时进行鼠疫噬菌体裂解试验，以确保菌株没有污染发生，然后提取蛋白液，并将细菌蛋白液进行无菌实验。

(3)点板及图谱采集：无菌实验无鼠疫耶尔森氏菌存活后，将细菌蛋白液点板；每株菌蛋白液平行点样15个靶点，点在质控菌以外的15个靶点位置，每个靶点采集图谱2次；如此，每株菌共产生图谱30个。

(4)建库：将16株鼠疫耶尔森氏菌株建库，每株菌有30个图谱，将图谱叠加，剔除峰形特殊的图谱后剩余图谱全部入库，系统自动生成该菌株的蛋白质谱库。

(5)引入二级算法

①初级检索：谱图经过预处理后，采用基于谱图相似度匹配的检索鉴定算法，对包含有鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌数据库进行检索，并按谱图比较相似度得分进行由高到低排序，取出前10条结果。

②二级检索条件判断：前10条结果中，如第1条结果为二者中任意一菌或 10条结果中超过6条为二者任意一菌则将启动二级检索，不满足以上条件，则直接输出第一条结果为最终鉴定结果。

(6)二级检索执行

①对所采集的谱图和数据库标准谱图进行基于最强峰的归一化变换，变换后，最高峰值为1。

②对待鉴定的未知谱图所有蛋白峰进行笛卡尔坐标投影，横坐标为质荷比，纵坐标为归一化后的相对强度。

③以3063Da为中心，以±500ppm的相对误差对步骤②中的投影进行搜索，并对此范围内搜索到的所有投影信号进行累加，得到投影累加值S。

④判断S，如S≥0.2，则判定鉴定结果为鼠疫耶尔森菌，否则结果判定为假结核耶尔森菌，完成检索。

本发明步骤(2)中培养条件为：LB加血培养基，28℃培养24小时。

本发明骤(2)中采用乙醇/甲酸提取法制备细菌蛋白液。

本发明的有益效果：本发明首次发现，在蛋白质谱检测中，鼠疫耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌容易混淆，二级算法的引入成功地将两者区分开，使蛋白质谱仪鉴定鼠疫耶尔森氏菌成为可能，所建立的鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库检测准确率高。

附图说明

图1 16株鼠疫耶尔森氏菌建库后，在蛋白质谱仪库列表中的位置及信息；

图2质控菌大肠杆菌的涂菌位置；

图3鼠疫耶尔森氏菌(EV76、72、1408、1409)蛋白质谱图；

图4假结核耶尔森氏菌(PST1、PST2)蛋白质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

我国存在12种鼠疫自然疫源地，而云南拥有3种类型的鼠疫自然疫源地，分别为家鼠鼠疫自然疫源地、剑川野鼠鼠疫自然疫源地和丽江野鼠鼠疫自然疫源地。本发明实施例中，项目依托单位保藏有上世纪50年代至今的鼠疫耶尔森氏菌种资源，且各个疫源地的菌株都有保藏。

实施例1

本实施例中实验菌株的选择：用于建库的鼠疫疫源地菌株15株；用于预实验、建库及鉴定检测的鼠疫疫苗株EV76；用于鉴定检测的鼠疫耶尔森氏菌3株(72、1408、1409)、假结核耶尔森氏菌2株(PST1、PST2)和小肠结肠炎耶尔森氏菌2株(GMG-3、GMG-7)；用于校正质控用的大肠杆菌E.coliATCC8739。

一、用鼠疫疫苗株EV76进行预实验，建立鼠疫耶尔森氏菌质谱检测操作规程。

(1)复苏、传代、大培养：鼠疫疫苗株EV76，使用LB加血培养基，28℃培养24小时，并同时进行鼠疫噬菌体裂解试验，以确保菌株没有污染发生。质控菌株大肠杆菌E.coliATCC8739，使用LB培养基，37℃培养18-24小时。

(2)校正：质谱仪使用时，需要进行校正，其校正的方法是每次将质控菌株涂菌点板，仪器在采集图谱之前，会优先检测质控菌株。每块板检测均需要校准，大肠杆菌采用新鲜菌直接涂菌法，涂菌位置固定于C6，如下图2所示。

直接涂菌法：利用无菌木质棉签或牙签平面的一端将待测菌涂在靶板的靶点中心，尽可能挑取单个菌落，若菌落较小，可以挑几个纯菌落，涂成均匀的薄膜，覆盖0.6～1uL甲酸(起到破壁作用)，待干燥后再覆盖1uL基质，干燥后形成结晶(淡黄色薄膜)，即可进行检测。

(3)制备细菌蛋白液：因鼠疫耶尔森氏菌为高致病性病原菌，所以不能采取直接涂菌法，而采用乙醇/甲酸提取法，且在验证蛋白液没有活菌存活的情况下，才能将蛋白液进行点板检测。

乙醇/甲酸提取法制备细菌蛋白液：挑取细菌单菌落5-10mg至含有300ul纯水的1.5ml离心管中，震荡混匀后，加900ul无水乙醇，12000r/min，3min离心，彻底丢弃上清液，加入50ul裂解液1，震荡混匀，再加入50ul裂解液2，震荡混匀，再次12000r/min，3min离心，丢弃沉淀，取上清；上清液经无菌实验证实无活菌存在后，取1ul上清点样，室温下干燥后，覆盖1uL基质，干燥后形成结晶，即可进行检测。

操作过程中注意如下事项：

①每个混匀的步骤都充分震荡混匀；

②混匀后开盖，需要对离心管短暂离心，避免气溶胶；

③在菌株未裂解前，使用生物安全柜里的离心机和涡旋仪进行操作。

(4)点板及图谱采集：E.coliATCC8739点于C6，EV76蛋白液平行点样4 个靶点(推荐至少点2个靶点)，点在C6以外的位置，每个靶点采集2次，4 个靶点共产生图谱8个。

(5)鉴定结果：8个图谱结果显示，鼠疫疫苗株EV76被鉴定为假结核耶尔森氏菌，得分83.00-91.50。

综上，利用鼠疫疫苗株EV76进行预实验，建立了质谱仪对鼠疫耶尔森氏菌这种高致病性病原菌进行检测的操作规程。

二、建库前，对鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定

鼠疫耶尔森氏菌是对人致病的耶尔森菌中的一种，其他对人致病的耶尔森菌还包括假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。鼠疫耶尔森氏菌在28℃和 37℃两种培养温度下，蛋白表达具有差异性，37℃时F1抗原等蛋白高度表达，因此发明人认为有必要对两种温度培养下制备的蛋白液进行检测，以观察温度条件是否造成鉴定结果的变化。

(1)菌株：鼠疫耶尔森氏菌4株(EV76、72、1408、1409)、假结核耶尔森氏菌2株(PST1、PST2)、小肠结肠炎耶尔森氏菌2株(GMG-3、GMG-7)；用于校正质控用的大肠杆菌E.coliATCC8739。

(2)复苏、传代、大培养：假结核耶尔森氏菌及小肠结肠炎菌，使用LB 加血培养基，28℃培养24小时。鼠疫耶尔森氏菌使用LB加血培养基分别于28℃和37℃下培养24小时。质控菌株大肠杆菌E.coli ATCC8739，使用LB培养基，37℃培养18-24小时。

(3)制备细菌蛋白液：乙醇/甲酸提取法制备。

(4)点板及图谱采集：E.coli ATCC8739点于C6，待测菌株每株菌的蛋白液平行点样4个靶点，点在C6以外的位置，每个靶点采集2次。

(5)鉴定结果：鉴定结果如表1第3列所示，两种温度下培养的鼠疫耶尔森氏菌均被鉴定为假结核耶尔森氏菌，而假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎菌鉴定准确无误。

表1.建库前后致病耶尔森氏菌鉴定结果比较

三、鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库的建立方法，具体包括以下步骤：

(1)建库菌株：不同分离年代、不同分离源来源的剑川野鼠、丽江野鼠及云南家鼠鼠疫自然疫源地的菌株各5株(见表2)，鼠疫疫苗株EV76，共计16 株鼠疫耶尔森氏菌株。大肠杆菌E.coliATCC8739为校正质控用。

表2 15株建库鼠疫耶尔森氏菌株分离信息

(2)复苏、传代、大培养：LB加血培养基，28℃培养24小时，并同时进行鼠疫噬菌体裂解试验，以确保菌株没有污染发生；此操作在生物安全三级实验室内进行。

(3)提取蛋白液：采用乙醇/甲酸提取法制备细菌蛋白液，并将细菌蛋白液进行无菌实验。此操作在生物安全三级实验室内进行。

(4)点板及图谱采集：无菌实验证实无鼠疫耶尔森氏菌存活后，将细菌蛋白液点板。每株菌蛋白液平行点样15个靶点，点在质控菌以外的15个靶点位置，每个靶点采集图谱2次。如此，每株菌共产生图谱30个。

(5)建库：将16株鼠疫耶尔森氏菌株建库，每株菌有30个图谱，将图谱叠加，剔除峰形特殊的图谱后剩余图谱全部入库，系统自动生成该菌株的蛋白质谱库。

鼠疫耶尔森氏菌建库后的验证：鼠疫耶尔森氏菌建库后，将之前用于鉴定检测的耶尔森氏菌再次进行鉴定检测，培养情况同前。蛋白质谱仪鉴定结果见表1 第4列，两种温度下培养的鼠疫耶尔森氏菌均被准确鉴定为鼠疫耶尔森氏菌，小肠结肠炎菌鉴定亦准确无误，但假结核耶尔森氏菌鉴定错误，被混淆为鼠疫耶尔森氏菌。

(6)引入二级算法

由于鼠疫耶尔森氏菌建库后，假结核耶尔森氏菌的鉴定发生混淆，因此当系统出具鼠疫耶尔森氏菌鉴定结果时，需要引入二级算法，甄别细菌为鼠疫耶尔森氏菌还是假结核耶尔森氏菌。鼠疫耶尔森氏菌蛋白图谱与假结核耶尔森氏菌蛋白图谱比对：鼠疫耶尔森氏菌EV76、72、1408、1409的蛋白质谱图在质荷比为3063 左右的峰的相对强度为1(如图3所示)，而假结核耶尔森氏菌PST1、PST2的蛋白质谱图在质荷比为3063左右的峰的相对强度明显小于1，在0.2以下(如图 4所示)。由此，可以将这个特征作为算法来区别鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。

①初级检索。谱图经过预处理后(平滑、去基线、对齐、寻峰)，采用基于谱图相似度匹配的检索鉴定算法(如Pearson算法)，对包含有上述两菌的微生物数据库进行检索，并按谱图比较相似度得分进行由高到低排序，取出前10 条结果；

②二级检索条件判断。前10条结果中，如第1条结果为二者中任意一菌或 10条结果中超过6条为二者任意一菌则将启动二级检索，不满足以上条件，则直接输出第一条结果为最终鉴定结果；

(7)二级检索执行。

a)对所采集的谱图和数据库标准谱图进行基于最强峰的归一化变换，变换后，最高峰值为1。

b)对待鉴定的未知谱图所有蛋白峰进行笛卡尔坐标投影，横坐标为质荷比，纵坐标为归一化后的相对强度。

c)以3063Da为中心，以±500ppm的相对误差对b步骤中的投影进行搜索，并对此范围内搜索到的所有投影信号(即峰值信号)进行累加，得到投影累加值S。

d)判断S，如S≥0.2，则判定鉴定结果为鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)，否则结果判定为假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)，完成检索。

引入二级算法后耶尔森氏菌验证：鉴定菌株及其培养条件同前，鉴定结果如表3第4列所示，鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌及小肠结肠炎菌鉴定准确无误。

表3二级算法引入前后鉴定结果比较

由表3可以看出，得到的鼠疫耶尔森氏菌蛋白质谱库(包含二级算法)可用蛋白质谱仪鉴定鼠疫耶尔森氏菌，且不会干扰其他致病耶尔森菌的鉴定。

实施例2

在鼠疫耶尔森氏菌建库完成后，发明人除了对云南鼠疫耶尔森氏菌株进行了质谱验证，还对其他国家如美国、缅甸的鼠疫耶尔森氏菌，其他省份如广西、贵州的鼠疫耶尔森氏菌也进行了质谱检测。

(1)菌株：实施例的菌株信息如表4。

表4实施例2的菌株背景信息

(2)复苏、传代、大培养：LB加血培养基，28℃培养24小时，并同时进行鼠疫噬菌体裂解试验，以确保菌株没有污染发生。此操作在生物安全三级实验室内进行。

(3)提取蛋白液：采用乙醇/甲酸提取法制备细菌蛋白液，并将细菌蛋白液进行无菌实验。此操作在生物安全三级实验室内进行。

(4)点板及图谱采集：无菌实验无鼠疫耶尔森氏菌存活后，将细菌蛋白液点板。每株菌蛋白液平行点样4个靶点，每个靶点采集图谱1次。

记录采集结果见表5。从靶点来看，5株菌共20个靶点，其中被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌且得分90及以上的有16个靶点，占比80％(16/20)；被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌且得分90以下的有3个靶点，占比15％(3/20)；未被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌的有1个靶点，占比5％(1/20)。从菌株来看，5株菌中的每株菌至少有2个及以上有靶点被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌且得分90及以上，也就5 株菌均被鉴定为鼠疫耶尔森氏菌。

表5 5株云南以外地区分离的鼠疫耶尔森氏菌株质谱鉴定结果