阅读说明：本技术 用于改善种子萌发和/或植物对环境胁迫耐受性的方法 (Methods for improving seed germination and/or plant tolerance to environmental stress ) 是由 奥利维尔·科尔 于 2018-12-07 设计创作，主要内容包括：本公开涉及由与未处理对照组相比含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的,植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物。本公开还涉及一种用于生产含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物的方法,与未处理对照组相比,所述甘氨酸–甜菜碱将赋予种子、从所述种子衍生的幼苗或植物增强的萌发潜力和/或增加的对各种环境胁迫的耐受性。本公开还涉及甘氨酸–甜菜碱用于增强种子的萌发潜力和/或用于增加种子对环境胁迫的耐受性的用途。本公开还涉及来源于本发明的具有增加的甘氨酸–甜菜碱的国际浓度的种子的,幼苗和植物或其部分。本公开还涉及可通过本发明的方法获得的幼苗或植物或其部分。(The present disclosure relates to plant seeds, seedlings or plants derived from said seeds containing an increased glycine-betaine internal concentration compared to an untreated control. The present disclosure also relates to a method for producing a plant seed, seedling or plant derived from the seed containing an increased internal concentration of glycine-betaine that will confer to the seed, seedling or plant derived from the seed an enhanced germination potential and/or increased tolerance to various environmental stresses as compared to an untreated control group. The present disclosure also relates to the use of glycine-betaine for enhancing the germination potential of a seed and/or for increasing the tolerance of a seed to an environmental stress. The disclosure also relates to seedlings and plants or parts thereof derived from the seeds of the invention with an increased international concentration of glycine-betaine. The present disclosure also relates to a seedling or a plant or a part thereof obtainable by the method of the invention.)

用于改善种子萌发和/或植物对环境胁迫耐受性的方法

技术领域

本公开涉及由含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度(internal concentration)的植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物，以及用于产生其的方法。本公开还涉及一种用于向植物种子或从所述种子衍生的幼苗或植物提供益处的方法。更特别地，本公开提供了一种方法，该方法用于产生由具有增强的种子萌发和/或增加的对各种环境胁迫(environmental stress)的耐受性的植物种子或由所述种子衍生的幼苗或植物。本公开还涉及甘氨酸–甜菜碱用于增强种子的萌发潜力和/或用于增加种子对环境胁迫的耐受性的用途。本公开还涉及来源于本发明的具有增加的甘氨酸–甜菜碱的国际浓度(international concentration)的种子的，幼苗和植物或其部分。本公开还涉及可通过本发明的方法获得的幼苗或植物或其部分。

背景技术

植物生长和发育受各种环境胁迫如缺水、干旱、极端潮湿、盐度、营养缺乏和次优(suboptimal)温度的影响。实际上，胁迫影响植物性能，例如产量降低、对疾病和害虫的易感性增加、种子萌发减少、植物生长减少和繁殖失败。正是在种子萌发和幼苗生长阶段，植物最易受环境胁迫的影响。例如极端温度，特别是冷和寒冷，会延迟幼苗的萌发和出苗并降低植物的高度及其根的长度。已知快速和均匀的种子萌发有助于植物建立健康的生长。

甘氨酸–甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸)是植物中响应干旱、盐度和次优温度诱导的脱水而产生的，最充沛的渗透保护剂(Ashraf and Foolad,2007；Chen and Murata,2008)。在许多植物中已经充分证明了甘氨酸–甜菜碱在胁迫环境条件下的积累。无或低甘氨酸–甜菜碱积累性植物在调节甘氨酸–甜菜碱合成途径的基因并转化后，显示增强的胁迫耐受性(Ashraf and Foolad,2007)。因此，因为甘氨酸–甜菜碱已显示为植物提供一些保护以免受到胁迫的环境条件的影响，它已用于处理土壤、植物和种子。

例如，WO 95/35022公开了用甜菜碱处理种子以增强幼苗生长和保护种子免受不利环境条件影响的方法。种子可以被浸泡和干燥或用甜菜碱包衣。所列举的不利条件是水胁迫、过量NaCl、极端温度或pH和重金属毒性。

种子包衣是农业中常用的方法，用于施用各种化学试剂来增强其性能，并优化萌发后植物的生长和发育。然而，已知存在与种子包衣配制系统有关的若干问题。例如，可用于在萌发前包被种子的活性成分可能需要仅在种子萌发后变得有效。或者，作为另一个实例，可以预期包衣中的组分在延长的时期内，可能是在整个萌发期，释放其活性成分。因此，预期在种子生命周期期间的这种长时期内，有效的活性成分可能易受种子种植的环境条件的影响，例如降雨、土壤湿度条件、温度变化、日光暴露等。取决于种子包衣的组成，组分或活性成分易于流失或可能被田间的生物活动(例如微生物或害虫)侵蚀，这将导致包衣处理的有效性的最终损失。

因此，仍然需要生产由含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物，所述甘氨酸–甜菜碱将赋予植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物增强的萌发潜力和/或对各种环境胁迫的耐受性。还需要生产甘氨酸–甜菜碱种子，其内部甘氨酸–甜菜碱内部含量将被保护，以免于因为环境活动而导致的从甘氨酸–甜菜碱包衣的种子中全部或部分地降解。种子萌发和/或产量被增加了，并且衍生自富含甘氨酸–甜菜碱的种子的幼苗和植物被保护了以免受各种非生物胁迫。

发明内容

本公开的方法提供了由含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的植物种子、由所述种子衍生的幼苗或植物，由于所述内部甘氨酸–甜菜碱在所述种子内的存在，使得植物生长具有期望的特性。本公开涉及用于产生含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子的方法，所述种子与未处理对照组相比具有增强的种子萌发和/或对环境应激的耐受性。在本公开的方法中，与对环境扰动敏感的甘氨酸–甜菜碱包衣的种子相比，甘氨酸–甜菜碱的内部内容物(internal content)随着时间的推移而保持存在，并且不分解、降解或以其他方式丧失其活性。

因此，本发明提供了一种用于产生含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子的方法，包括以下步骤：

(a)使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触；以及

(b)收集在步骤(a)之后获得的用甘氨酸–甜菜碱处理的所述植物的种子，其中，与来自未处理对照组植物的种子相比，所述种子含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度。该方法可以进一步包括步骤：

(c)使含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的所述种子生长以产生所述种子衍生的幼苗或植物。

使植物与甘氨酸–甜菜碱接触的步骤可以通过在开花时前后或在开花时，将甘氨酸–甜菜碱施用到植物的地上部分、植物的花部分或花上来进行，从而将甘氨酸–甜菜碱引导到由植物产生的种子的内部。甘氨酸–甜菜碱可以通过喷雾来施用。使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤，可以通过以约1至10kg/公顷、2至8kg/公顷、3至7kg/公顷或4至6kg/公顷的量施用甘氨酸–甜菜碱来进行。

在本文所述的本发明的任何方法中，与来自未处理对照组植物的种子相比，所述种子中的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可以增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、750％或1000％。

在本文所述的本发明的任何方法中，与未处理对照组相比，所述种子、所述由所述种子衍生的幼苗或植物可具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性。在本文所述的本发明的任何方法中，环境胁迫可以选自寒冷温度(cold temperature)、极端温度、缺水、干旱及其组合。在本文所述的本发明的任何方法中，环境胁迫可以是寒冷温度。

本发明还提供了用于增强种子的萌发潜力和/或增加种子对环境胁迫的耐受性的方法，所述方法包括：

(a)使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触；以及

(b)收集由在步骤(a)之后获得的用甘氨酸–甜菜碱处理的所述植物产生的种子，

其中与来自未用甘氨酸–甜菜碱处理的对照组植物的种子相比，所述种子具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性。与来自未处理对照组植物的种子相比，所述种子可以含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度。所述方法可进一步包括(c)使所述种子生长以产生由所述种子衍生的幼苗或植物的步骤。

使植物的地上部分、植物的花部分或花卉植物与甘氨酸–甜菜碱接触的步骤可以通过在开花时前后或在开花时，将甘氨酸–甜菜碱施用于植物的地上部分、植物的花部分或花来进行，从而将甘氨酸–甜菜碱导向由植物产生的种子的内部。甘氨酸–甜菜碱可以通过喷雾来施用。

使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤，可以通过以约1至10kg/公顷、2至8kg/公顷、3至7kg/公顷或4至6kg/公顷的量施用甘氨酸–甜菜碱来进行。

本文所述的本发明的用于增强种子的萌发潜力和/或增加种子对环境胁迫的耐受性的方法，可以用于增加种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或极端温度的耐受性。与未处理对照组相比，种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或温度极限的耐受性可以增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

本文所述的本发明的用于增强种子的萌发潜力和/或提高种子对环境胁迫的耐受性的方法可以用于提高种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对干旱或缺水条件的耐受性。本文所述的本发明的用于增强种子的萌发潜力和/或提高种子对环境胁迫的耐受性的方法可以用于增强种子萌发潜力。与来自未处理对照组植物的种子相比，种子萌发潜力可以增强至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

本发明还提供了用于增强种子萌发潜力和/或增加种子或由所述种子衍生的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性的方法，其包括以下步骤：

(a)使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触；以及

(b)收集由在步骤(a)之后获得的用甘氨酸–甜菜碱处理的所述植物产生的种子，其中与来自未处理对照组植物的种子相比，所述种子具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性，或者其中与来自未处理对照组种子的幼苗或植物相比，由所述种子衍生的所述幼苗或植物具有增加的对环境胁迫的耐受性。与来自未处理对照组植物的种子相比，所述种子可以含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度。所述方法可进一步包括(c)使所述种子生长以产生由所述种子衍生的幼苗或植物的步骤。

使植物的地上部分、植物的花部分或花卉植物(flower plant)与甘氨酸–甜菜碱接触的步骤，可以通过在开花时前后或在开花时，将甘氨酸–甜菜碱施用于植物的地上部分、植物的花部分或花来进行，从而将甘氨酸–甜菜碱导向由植物产生的种子的内部。甘氨酸–甜菜碱可以通过喷雾来施用。

使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤可以通过以约1至10kg/公顷、2至8kg/公顷、3至7kg/公顷或4至6kg/公顷的量施用甘氨酸–甜菜碱来进行。

本文所述的本发明的用于增强种子萌发潜力和/或提高种子或由所述种子衍生的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性的方法可以用于提高种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或极端温度的耐受性。与未处理对照组相比，种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或温度极限的耐受性可以增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

本发明的增强种子萌发潜力和/或提高种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性的方法，可以用于提高由种子、所述种子衍生的幼苗或植物对干旱或缺水条件的耐受性。本发明的增强种子萌发潜力和/或增加种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性的方法可以用于增强种子萌发潜力。与来自未处理对照组植物的种子相比，种子萌发潜力可以增强至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在本文所述的本发明的任何方法中，所述种子可以是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。

本发明还提供了可通过本文所述的本发明的方法获得的，含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子。

本发明还提供了与未处理对照组相比含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子，其中所述种子可通过使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触而获得。所述种子可以通过以下获得：

使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触；以及

从用甘氨酸–甜菜碱处理的植物中收集种子。

与未处理对照组相比，本文所述的本发明的种子或可通过本文所述的本发明的方法获得的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％或35％、40％、45％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、750％或1000％。与未处理对照组相比，本文所述的本发明的种子或可通过本文所述的本发明的方法获得的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可具有增强的萌发潜力和/或对环境胁迫的增加的耐受性。与未处理对照组相比，所述种子对环境胁迫的耐受性可以增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。环境胁迫可以选自寒冷温度、极端温度、缺水、干旱及其组合。环境胁迫可以是寒冷温度。与未处理对照组相比，所述种子的萌发潜力可以提高至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。所述种子可以是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。

本发明还提供了甘氨酸–甜菜碱用于产生与未处理对照组相比具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性的种子的用途，其中将甘氨酸–甜菜碱施用至植物的地上部分、植物的花部分或植物的花。与来自未处理对照组植物的种子相比，根据本文所述的本发明的甘氨酸–甜菜碱的用途可以将所述种子中甘氨酸–甜菜碱内部浓度增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、750％或1000％。与来自未处理对照组植物的种子相比，根据本文所述的本发明的甘氨酸–甜菜碱的用途可以将所述种子对环境胁迫的耐受性提高至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。环境胁迫可以选自寒冷温度、极端温度、缺水、干旱及其组合。环境胁迫可以是寒冷温度。

与未处理对照组相比，根据本文所述的本发明的甘氨酸–甜菜碱的用途可将所述种子的萌发潜力提高至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在本文所述的本发明提供的甘氨酸–甜菜碱的任何用途中，甘氨酸–甜菜碱可以施用于开花时前后或开花时的植物的地上部分、植物的花部分或花，由此甘氨酸–甜菜碱被引导至由植物产生的种子的内部，任选地其中甘氨酸–甜菜碱通过喷雾施用。在本文所述的本发明所提供的甘氨酸–甜菜碱的任何用途中，甘氨酸–甜菜碱可以以约1至10kg/公顷、2至8kg/公顷、3至7kg/公顷或4至6kg/公顷的量施用。

在本文所述的本发明提供的甘氨酸–甜菜碱的任何用途中，所述种子可以是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。

本发明提供了一种植物或幼苗，其衍生自或包含本文所述的本发明提供的种子或所述植物或幼苗的一部分。本发明还提供了植物或幼苗，其衍生自或包含可通过本文所述的本发明方法获得的种子，或所述植物或幼苗的一部分。

本发明还提供了可通过本文所述的本发明的任何方法获得的植物或幼苗，或所述植物或幼苗的一部分，所述方法包括步骤(c)使含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的所述种子生长以产生由所述种子衍生的幼苗或植物。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。本文提及的所有出版物、专利和其它参考文献出于所有目的通过引用整体并入。

根据本公开的方法使用了一种新的方式将甘氨酸–甜菜碱引入植物中，而在施用期间或之后不伤害植物种子。与未处理对照组种子相比，用该方法产生的种子含有更高或增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度。甘氨酸–甜菜碱被应用于植物的地上部分、植物的花部分或植物的花，其被作为植物的天然入口，并允许甘氨酸–甜菜碱被有效地引入下一代植物种子中。更具体地说，当在开花时或开花时前后，将甘氨酸–甜菜碱(例如通过喷雾)施用到植物的地上部分时，当籽粒形成(grain formation)开始时，甘氨酸–甜菜碱被转移、运输或传送，并且被引导到由植物产生的种子内部(或出现的种子)。与未处理对照组相比，本公开的方法可以通过增强种子萌发和/或增加对各种环境胁迫的耐受性或抗性来帮助作物生产力。此外，甘氨酸–甜菜碱在种子内的运输或转移而不是外部施用，例如作为种子包衣，使得甘氨酸–甜菜碱对环境条件较不敏感，并且提供了对化学种子包衣的优异相容性。此外，通过种植由本公开的方法产生的种子，甘氨酸–甜菜碱被携带或运输至后续世代植物。

开花植物(被子植物)允许在花期之后的籽粒发育(grain development)过程中将甘氨酸–甜菜碱转移至种子。合适的植物包括单子叶植物和双子叶植物。单子叶植物的实例包括禾本科(gramineous)(禾本科(Poaceae))植物。双子叶植物的实例包括豆科(leguminous)(豆科(Fabaceae))植物和十字花科(cruciferous)(十字花科(Brassicaceae))植物。在一个实施方案中，植物是禾本科植物。本文中的禾本科植物的实例包括农业上重要的物种，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、小米(millet)、高粱、玉米和燕麦。在另一个实施方案中，植物是豆科植物，例如豌豆、菜豆(bean)、羽扇豆、苜蓿、大豆或小扁豆。在另一个实施方案中，植物是诸如油菜的十字花科植物。

在本公开的上下文中，在开花时或开花时前后，通过例如喷洒有效量的甘氨酸–甜菜碱溶液，将甘氨酸–甜菜碱溶液接触或施用到植物的地上部分、植物的花部分或植物的花。本文所用的术语“接触”(contacted or contacting)是指将待处理的表面，例如植物的地上部分、植物的花部分或植物的花，与甘氨酸–甜菜碱溶液接触的任何方式。如本文所用，术语“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。如本公开的上下文中使用的术语“在开花时”是宿主植物(host plant)开花(blooms)的时期。术语“开花时前后”是指花序(inflorescence)出现之前或直至开花期(anthesis)和开花结束之后的时间段，并且包括籽粒发育的不同阶段。使植物与甘氨酸–甜菜碱接触的方法不限于特定的方法，只要其能够使甘氨酸–甜菜碱溶液与植物或植物部分有效接触即可。在工业生产方法中，喷雾是特别有用的。由于对所用的甘氨酸–甜菜碱的有利条件具有保护作用，喷雾是值得推荐的。

从糖用甜菜中提取的甘氨酸–甜菜碱是可商购的，例如商标为(Lallemand)。其它甜菜碱产品，例如甜菜碱一水合物、盐酸甜菜碱和粗制甜菜碱液体也是可商购的，并且它们可以用于本公开的目的。

甘氨酸–甜菜碱通常以合适的浓度以悬浮液形式施用。因此，在一个实施方案中，甘氨酸–甜菜碱的悬浮液以一次或连续几次处理的方式，被施用到植物的地上部分、植物的花部分或植物的花。用量根据植物品种和生长期而变化。例如，每公顷可使用至少，约0.1至20kg；约0.5至15kg；约1至10kg或约1至6kg的甘氨酸–甜菜碱。在另一个实施方案中，将甘氨酸–甜菜碱以每公顷至少约1kg、2kg、3kg、4kg、5kg、6kg、7kg、8kg、9kg、10kg、11kg、12kg、13kg、14kg、15kg、16kg、17kg、18kg、19kg或20kg干物质的量直接施用或递送至植物的地上部分、植物的花部分或植物的花。这里给出的量仅是建议性的，本领域技术人员可以容易地确定以本文所述方式起作用的有效浓度。

如果需要，施用可以例如通过与一些其它肥料或杀虫剂的喷雾一起喷雾来进行。甘氨酸–甜菜碱溶液还可以含有润湿剂和/或表面活性剂，它们有助于渗透植物的地上部分、植物的花部分或植物的花。根据本公开内容利用的甘氨酸–甜菜碱被运输到植物细胞，主动调节细胞的渗透平衡，并且还参与细胞代谢的其他过程。用甘氨酸–甜菜碱处理的细胞甚至在受到外源胁迫因素时也更有活力。

本公开的方法还包括收集步骤。“收集步骤”是收集植物种子的步骤，所述种子包含与未处理对照组种子相比内部增加浓度的甘氨酸–甜菜碱。

通过本发明方法获得的种子可以像普通种子一样处理，并且可以以常规方式进一步加工。例如，可以提供具有生长促进剂或其它有益于植物生长和植物健康的化学品的包衣，所述化学品例如杀虫剂、杀真菌剂、驱虫剂、肥料、抗生素等。当然，可以用甘氨酸–甜菜碱对种子进行包衣。本公开内容的上下文中使用的术语“种子”是指所有种类的种子、植物繁殖材料和植物繁殖体(propagules)，包括但不限于真实种子(true seeds)、种子碎片(seed pieces)、球茎(corms)、鳞茎(bulbs)、果实、块茎、籽粒(grain)、削芽(cut shoots)等。如本文所用，种子准备用于种植和生长。

甘氨酸–甜菜碱(连同其有益特性)在种子内部被保护起来，防止暴露于环境危害。因此，种子可以储存相当长的时间而不会显著损失有益特质。例如，通过本公开的方法获得的植物种子可以储存至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少2年或至少3年。

本公开的方法提供了含有高甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子，该甘氨酸–甜菜碱可以在下一代植物体中进一步运输或转移。实验结果发现，下一代植物体如幼苗可被甘氨酸–甜菜碱占据和/或获得甘氨酸–甜菜碱提供的增强的对各种环境胁迫耐受性的益处。在本公开的上下文中，术语“胁迫”包括但不限于所有可能影响植物或种子从感染到环境的生物和非生物胁迫。例如，冷、热、缺水、干旱、盐度、化学品、天气条件、真菌或细菌感染、昆虫侵袭、土壤营养缺乏或过量、土壤紧实度或密度、光、遮蔽或土壤pH或这些条件的任意组合，是植物或种子可能经历并响应的胁迫类型。可以受胁迫影响的植物或种子的那些物理或生物化学特征包括，例如产量、高度、颜色、活力、根生长、芽生长、开花时间和质量、种子质量、花粉质量、繁殖潜力、萌发或发育、对真菌病的抗性或这些或其他植物特征的任何组合。

与未处理的种子的情况相比，通过本公开的方法产生的种子的甘氨酸–甜菜碱含量增加了至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、超过20％、超过25％、超过30％。

与来自未处理对照组植物的种子相比，通过本文所述的本发明的方法产生的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可以增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、750％、1000％或1100％。与来自未处理对照组植物的种子相比，通过本文所述的本发明的方法产生的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可增加约2％至约1100％、约3％至约1000％、约5％至约750％、约4％至约500％、约5％至约400％、约10％至约300％、约15％至约200％、约25％至约100％、或约15％至约50％。

与来自未处理对照组植物的种子相比，本文所述的本发明提供的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可以增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、750％、1000％或1100％。与来自未处理对照组植物的种子相比，本文所述的本发明提供的种子的甘氨酸–甜菜碱内部浓度可以增加至少约2％至约1100％、约3％至约1000％、约5％至约750％、约4％至约500％、约5％至约400％、约10％至约300％、约15％至约200％、约25％至约100％、或约15％至约50％。

与未处理对照组(即，没有本公开的方法的对照组)相比，衍生自通过本公开的方法产生的种子、幼苗或植物具有增加的胁迫耐受性或抗性，所述增加的胁迫耐受性或抗性在温度耐受性(耐寒性或耐冻性)上至少约5、10、25、30、35、40、45或50％的变化，或在耐旱性(或缺水条件)上至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％的变化。

当提及通过本文所述的本发明方法可获得的种子、幼苗或植物，或本文所述的本发明提供的种子、幼苗或植物的“对环境胁迫的耐受性提高”时，该术语涉及所述种子、幼苗或植物的任何有用性质或特征的提高，所述性质或特征可能由于暴露于环境胁迫而受到不利影响。如上所述，可能受到暴露于环境胁迫的不利影响的种子、幼苗的有用特性或特征可以选自产量、高度、颜色、活力、根生长、芽生长、开花时间和质量、种子质量、花粉质量、繁殖潜力、萌发或发育、萌发潜力、对真菌病的抗性或这些或其它植物特性的任何组合。当提及“对环境胁迫的耐受性提高”时，种子、幼苗或植物的有用性质或特征的提高可以是有用性质或特征的显著提高。显著增加可以是通过适当的统计检验确定的统计学显著的增加。例如用于确定两个数据集是否显著不同的统计检验，例如t-检验或任何其它合适的统计检验。本领域技术人员将能够容易地使用本领域已知的任何技术来评价种子、幼苗或植物的有用特性或特征，并选择和进行适当的统计检验。

种子的萌发潜力(有用特性的实例)可能由于暴露于环境胁迫(例如寒冷温度)而受到不利影响(即降低)。因此，例如，为了评估甘氨酸–甜菜碱处理的种子对环境胁迫的耐受性，可以在显露于环境胁迫适当的时间后，将甘氨酸–甜菜碱处理的多个种子的萌发，与多个未处理对照组种子的萌发进行比较。例如，可以将种子暴露于冷的温度(例如，约10℃持续7天)。在暴露于环境胁迫之后，可以测定甘氨酸–甜菜碱处理的种子和对照组种子两者成功萌发的种子比例，并将这两个值进行比较。当萌发的经甘氨酸–甜菜碱处理的种子的比例高于(例如显著高于)未处理对照组种子时，可以说经甘氨酸–甜菜碱处理的种子具有增加的对环境胁迫的耐受性(在这种情况下，增加的对寒冷温度度的耐受性和/或增加的耐寒性)。

幼苗或植物的种子/果实的生长、存活和/或产量可能由于暴露于环境胁迫，如寒冷温度，而受到不利影响。为了评估本文所述的本发明的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性，可将用甘氨酸–甜菜碱处理的多个幼苗或植物的种子/果实(或上述任何其它有用的特征或性质)的生长、存活和/或产量，与多个未处理的幼苗或植物的种子/果实(或上述任何其它有用的特征或性质)的生长、存活和/或产量进行比较。当与未处理对照组幼苗或植物相比，经甘氨酸–甜菜碱处理的幼苗或植物的种子/果实的生长、存活和/或产量(或上述任何其它有用的特征或性质)更高(例如显著更高)时，可以说经甘氨酸–甜菜碱处理的幼苗或植物具有增加的对环境胁迫的耐受性，例如增加的对寒冷温度的耐受性和/或增加的抗寒性。

与未处理对照组相比，通过本文所述的本发明的方法可获得的种子、幼苗或植物，或通过本文所述的本发明提供的种子、幼苗或植物对环境胁迫的耐受性可以增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。与未处理对照组相比，通过本文所述的本发明的方法可获得的种子、幼苗或植物，或通过本文所述的本发明提供的种子、幼苗或植物对环境胁迫的耐受性可以增加约0.2％至50％、约0.4％至约45％、约0.6％至约40％、约0.8％至约35％、约1％至约30％、约1.2％至约25％、约1.4％至约20％、约1.6％至约10％、约1.8％至约5％，或约2％至约4％。

与未处理对照组相比，通过本文所述的本发明的方法可获得的种子、幼苗或植物或由本文所述的本发明提供的种子、幼苗或植物对寒冷温度(例如，耐寒性或耐冻性)的耐受性可增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。与未处理对照组相比，通过本文所述的本发明的方法可获得的种子、幼苗或植物或通过本文所述的本发明提供的种子、幼苗或植物对寒冷温度的耐受性(例如，耐寒性或耐冻性)可以增加至少约0.2％至50％、约0.4％至约45％、约0.6％至约40％、约0.8％至约35％、约1％至约30％、约1.2％至约25％、约1.4％至约20％、约1.6％至约10％、约1.8％至约5％或约2％至约4％。

此外，本公开的方法提供了与未处理对照组相比，具有增强的种子萌发潜力、幼苗出苗或植物生长或更均匀的萌发的种子。在本公开的上下文中，术语“种子萌发”涉及尤其在休眠期之后从种子上的胚发育的根生长的清楚证据。术语“种子萌发潜力”涉及种子例如在休眠和/或暴露于环境胁迫一段时间后，从种子上的胚发育根生长的能力。当提及种子的“增强的种子萌发”和/或“增强的萌发潜力”时，这些术语涉及与未处理对照组种子相比，甘氨酸–甜菜碱处理的种子的种子萌发或种子萌发潜力的增加。例如，为了评估种子萌发或种子萌发潜力的增加，可以将用甘氨酸–甜菜碱处理的多个种子的萌发与多个未处理对照组种子的萌发进行比较。可以测定甘氨酸–甜菜碱处理的种子和对照组种子两者成功萌发的种子比例，并比较这两个值。当萌发的甘氨酸–甜菜碱处理的种子的比例高于(例如显著高于)未处理对照组种子时，可以说甘氨酸–甜菜碱处理的种子具有增强的萌发。这样的种子也可被称为具有“增强的萌发潜力”。技术人员可以使用适当的统计学检验，例如t-检验，来确定成功萌发的甘氨酸–甜菜碱处理的种子的比例是否显著高于成功萌发的未处理对照组种子的比例。在本公开的上下文中，术语“幼苗出苗”意指在生根培养基(rooting medium)表面上方可观察到的植物生长。与未处理对照组相比，本公开的方法提供了从至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％的植物的更大的种子萌发、幼苗出苗或生长。

与来自未处理对照组植物的种子相比，通过本文所述的本发明方法可获得的种子或由本文所述的本发明提供的种子的萌发或萌发潜力可增加至少约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。与来自未处理对照组植物的种子相比，通过本文所述的本发明的方法可获得的种子或通过本文所述的本发明提供的种子的萌发或萌发潜力可以增加至少约0.2％至50％、约0.4％至约45％、约0.6％至约40％、约0.8％至约35％、约1％至约30％、约1.2％至约25％、约1.4％至约20％、约1.6％至约10％、约1.8％至约5％或约2％至约4％。

通过参考以下实施例将更容易理解本公开，给出这些实施例是为了说明本公开而不是限制其范围。

实施例

实施例1：甘氨酸–甜菜碱的外/叶面施用对玉米种子甘氨酸–甜菜碱的内部浓度的影响

方法：

田间试验用两种不同的玉米品种进行：LG 32.58品种和Casey品种。

为了防止玉米种子生产期间的自体受精，在花粉脱落时间之前去除雌性系的雄性生殖部分。

在籽粒发育阶段，以4kg/公顷的当量将市售(Lallemand)制剂喷雾至雌性系叶。每次重复由18株植物组成。对照组植物用水处理。

在成熟时收集种子(200)。使用球磨机研磨种子，并用乙醇提取。样品被蒸发至干并溶解在氧化氘(D2O)(50mg/ml)中。使用3-(三甲基甲硅烷基)-1-丙烷磺酸钠盐(DSS)作为内标进行¹H-NMR分析(Bruker，于500MHz)。NMR信号的ppm值是9个质子的化学位移，其给出了甘氨酸–甜菜碱在3.251ppm的信号。对每个样品进行总共三次提取。

结果：

表1：LG 32.58品种的玉米种子中甘氨酸–甜菜碱的内部浓度

*以不同字母表示的各个值在统计上存在显著差异(p＜0.05)

表2：Casey品种的玉米种子中甘氨酸–甜菜碱的内部浓度

*以不同字母表示的各个值在统计上存在显著差异(p<0.05)

表3：与未处理的种子重量相比，用甘氨酸–甜菜碱处理后的种子重量(g)

N.S.——表示非统计学显著性差异

表4：玉米种子中甘氨酸–甜菜碱的内部浓度(mg/kg)

S——表示统计学显著性差异

表1至4中公开的结果表明，通过在开花期喷洒植物，可以将甘氨酸–甜菜碱引入玉米种子中。与未处理的种子相比，通过本公开的方法产生的种子的甘氨酸–甜菜碱内部含量明显更高。

实施例2：寒冷温度对玉米种子萌发的影响

方法：

将每种处理的两百粒种子(用水处理的植物和用甘氨酸–甜菜碱处理的植物)种植在湿润的沙上。将样品置于10℃的萌发室内7天。然后将样品转移至设定为25℃的萌发室中5天。用与更传统的种子品种相比具有增加的耐寒性的各种种子进行实验。标准种子在冷萌发(cold germination)试验后萌发率为50–70％。

结果：

表5：寒冷温度对玉米种子萌发的影响

S——表示统计学显著性差异

表5中公开的结果显示，与未处理的种子(即来自对照组植物的种子，即用水处理的)相比，具有增加的甘氨酸–甜菜碱内部含量的种子在冷处理(cold treatment)后具有显著更好的种子萌发百分比。

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虽然已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但是应当理解，权利要求的范围不应当由在示例中阐述的优选实施例限制，而是应当给予与作为整体的描述一致的最宽泛的解释。

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本发明的其它方面和实施方案在以下编号的段落中阐述：

1、一种用于产生含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的种子的方法，所述方法包括：

(a)使植物的地上部分、花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤；以及

(b)收集在步骤(a)之后获得的用甘氨酸–甜菜碱处理的所述植物的种子的步骤，其中所述种子与未处理对照组相比含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度。

2、如段落1所述的方法，进一步包括

(c)使所述种子生长，以产生与从未处理对照组萌发的幼苗或植物相比，含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的，由所述种子衍生的幼苗或植物的步骤。

3、如段落1或2所述的方法，其中，使植物与甘氨酸–甜菜碱接触的步骤是通过开花时前后或在开花时喷洒甘氨酸–甜菜碱来进行的，从而甘氨酸–甜菜碱被引导至由所述植物产生的所述种子的内部。

4、如段落1–3任一所述的方法，其中使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤通过以约1–10kg/公顷、2–8kg/公顷、3–7kg/公顷或4–6kg/公顷的量施用甘氨酸–甜菜碱来进行。

5、如段落1–5任一所述的方法，其中与未处理对照组相比，甘氨酸–甜菜碱内部浓度增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％或35％。

6、如段落1–5任一所述的方法，其中所述种子是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。

7、如段落2–6任一所述的方法，其中与未处理对照组相比，所述种子、由所述种子衍生的幼苗或植物具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性。

8、一种用于增强种子萌发和/或增加种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对环境胁迫的耐受性的方法，所述方法包括：

(a)使植物的地上部分、花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤；以及

(b)收集在步骤(a)之后获得的用甘氨酸–甜菜碱处理的所述植物的所述种子的步骤，其中所述种子与未处理对照组相比表现出增强的种子萌发和/或与未处理对照组种子、幼苗或植物相比具有增加的对环境胁迫的耐受性。

9、如段落8所述的方法，进一步包括

(c)使所述种子生长，以产生与从未处理对照萌发的幼苗或植物相比，含有增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度的，由所述种子衍生的幼苗或植物的步骤，其中所述种子与未处理对照组相比表现出增强的种子萌发，或者与从未处理对照组萌发的幼苗或植物相比，由所述种子萌发的幼苗或植物具有增加的对环境胁迫的耐受性。

10、如段落8或9所述的方法，其中，使植物与甘氨酸–甜菜碱接触的步骤是通过开花时前后或在开花时喷洒甘氨酸–甜菜碱来进行的，从而甘氨酸–甜菜碱被引导至由所述植物产生的所述种子的内部。

11、如段落8–10任一所述的方法，其中使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触的步骤通过以约1–10kg/公顷、2–8kg/公顷、3–7kg/公顷或4–6kg/公顷的量施用甘氨酸–甜菜碱来进行。

12、如段落8–11任一所述的方法，其用于增加种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或极端温度的耐受性。

13、如段落8–11任一所述的方法，其用于增加种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对干旱或缺水条件的耐受性。

14、如段落12所述的方法，其中与未处理对照组相比，所述种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对寒冷温度或极端温度的耐受性增加至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％。

15、如段落13所述的方法，其中与未处理对照组相比，所述种子、由所述种子衍生的幼苗或植物对干旱或缺水条件的耐受性增加至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％。

16、如段落8–11任一所述的方法，其用于增强种子萌发。

17、如段落16所述的方法，其中与未处理对照组相比，种子萌发增强至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％。

18、如段落8–17任一所述的方法，其中所述种子是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。

19、一种种子，所述种子包含与未处理对照组相比增加的甘氨酸–甜菜碱内部浓度，所述种子可通过使植物的地上部分、植物的花部分或植物的花与有效量的甘氨酸–甜菜碱接触来获得，其中甘氨酸–甜菜碱存在于所述种子的内部。

20、如段落19所述的种子，其中与未处理对照组相比，甘氨酸–甜菜碱内部浓度增加至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、25％、30％或35％。

21、如段落19或20所述的种子，其中与未处理对照组相比，所述种子具有增强的萌发潜力和/或增加的对环境胁迫的耐受性。

22、如段落21所述的种子，其中与未处理对照组相比，对环境胁迫的耐受性增加至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％。

23、如段落21所述的种子，其中与未处理对照组相比，萌发增强至少约5、10、20、25、30、35、40、45或50％。

24、如段落19–23任一所述的种子，其中所述种子是玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子或油菜种子。