阅读说明：本技术 一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶及其制备与应用 (High-molecular self-healing gel integrating magnetic resonance imaging and photothermal therapy and preparation and application thereof ) 是由 蒋刚彪 朱水容 刘斌 胡甜 刘步宁 庞卯 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶的制备及应用。本发明以具有生物活性的Mn<Sup>2+</Sup>作为鳌合位点,与天然高分子形成三维网络结构,同时掺杂具有光热效果的纳米金棒,开发出一种安全、可降解、能促细胞生长和受损组织修复、且兼具磁共振成像诊断和光热治疗的医用水凝胶,实现“一次注射”便可满足诊疗的“双效果”。同时,结合自愈合的功能,该复合水凝胶在组织工程、病变诊断、定点监测与成像、光热治疗等领域具有可观的发展前景和潜在的医用价值。(The invention discloses a preparation method and application of a high-molecular self-healing gel integrating magnetic resonance imaging and photothermal therapy. The invention relates to Mn with biological activity 2+ As a chelating site, high score with the naturalThe nano-gold rods form a three-dimensional network structure and are doped with nano-gold rods with photo-thermal effects at the same time, so that the medical hydrogel which is safe, degradable, capable of promoting cell growth and repairing damaged tissues and has magnetic resonance imaging diagnosis and photo-thermal treatment is developed, and double effects of diagnosis and treatment can be met by one-time injection. Meanwhile, the composite hydrogel has considerable development prospect and potential medical value in the fields of tissue engineering, lesion diagnosis, fixed-point monitoring and imaging, photothermal therapy and the like by combining the self-healing function.)

一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶及其 制备与应用

技术领域

本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶及其制备与应用。

背景技术

磁共振成像是一种发射断层成像，利用磁共振现象从人体中获得电磁信号，从而重建人体系统的数字图像，目前已广泛用于脊髓、颅脑、关节等损伤和病变的医疗成像方面，尤其在诊断脊髓空洞、颅神经病变、脑肿瘤、血管造影、软组织损伤等有显著的成效。

目前，传统的磁共振造影剂多为重金属配合物或纳米氧化物，虽造影效果较好且已被应用于临床治疗，但仍存在各种缺陷，如常用的重金属配合物Gd³⁺毒性大，甚至能够引起大脑过敏和神经细胞死亡；而常用的纳米Fe₃O₄颗粒小，会在体内随血液流动，且难以从人体代谢系统排出。此外，造影剂多以溶液的形式注射，流动性强、成像时效短、效果不明显。因此，为解决传统磁共振造影剂毒性大、难降解、诊断时效短的弊端，需开发一种安全、可降解、成像时效长的磁共振成像医疗材料。

天然壳聚糖及其衍生物由于安全性高、可塑性强、生物相容性及柔韧性好、易降解等优点，制备而成的水凝胶成为了一种良好的医用载体材料。近年来有研究表明，Mn²⁺可作为一类锰增强磁共振诊断剂，能增强纵向弛豫成像信号，替代传统高毒性的造影剂。此外，锰还具有一定的生物活性，能够促进软骨形成。而金纳米材料由于存在等离子共振的特性，已被普遍证明可作为一类较为常用的光热试剂。

因此，本发明将Mn²⁺和纳米Au结合，开发一种集磁共振成像和光热治疗于一体的医用水凝胶，同时结合水凝胶自愈合的功能，在组织工程、病变诊断、定点监测与成像、光热治疗等领域具有很大的发展前景和潜在的医用价值。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶的制备方法。以天然来源的壳聚糖衍生物为载体基底，添加金纳米材料，同时引入Mn²⁺交联体系，制备自愈合水凝胶复合材料。将Au的光热治疗和Mn的磁共振成像功能集于一体，赋予医用复合水凝胶双重诊疗手段。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶。

本发明的再一目的在于提供上述一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)向壳聚糖溶液中加入对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌5～30min，然后反应1～4天，沉淀，洗涤，抽滤，得到醛基化壳聚糖(OCS)；

(2)在25～40℃下，向HAuCl₄溶液中加入表面活性剂并搅拌5～60s，再加入NaBH₄溶液并搅拌5～60s，得到Au种子液；

(3)在25～40℃下，向HAuCl₄溶液中加入表面活性剂并搅拌5～60s，加入AgNO₃溶液并搅拌5～60s，再加入还原剂溶液并搅拌5～60s，得到纳米Au生长液；

(4)将纳米Au生长液加入到Au种子液中，25～40℃下搅拌5～60s，常温静置6～18h，待金棒生长稳定后，离心，洗涤，抽滤，得到纳米Au棒粉末；

(5)将醛基化壳聚糖(OCS)溶于水中，分散均匀，加入纳米Au棒粉末，搅拌1～3h，得到纳米Au棒混合溶液；

(6)向羧甲基壳聚糖溶液中加入纳米Au棒混合溶液，搅拌2～5h，加入MnCl₂·4H₂O水溶液，搅拌4～20h，得到高分子自愈复合水凝胶。

优选地，步骤(1)所述壳聚糖溶液的浓度为1～5wt％(w/w)，所述壳聚糖溶液中的壳聚糖的分子量为800～1000，脱乙酰度75～85％，溶剂为二甲基亚砜、丙酮、甲醇、乙醇和水中的至少一种。

优选地，步骤(1)所述壳聚糖溶液中的壳聚糖和对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶以及二环己基碳二亚胺的质量比为(5～25)：(20～60)：(0.6～1.2)：(10～35)。

优选地，步骤(1)所述对醛基苯甲酸以对醛基苯甲酸溶液的形式加入，其浓度为10～30wt％(w/w)；所述4-二甲氨基吡啶以4-二甲氨基吡啶溶液的形式加入，其浓度为0.6～1.2wt％(w/w)；所述二环己基碳二亚胺以二环己基碳二亚胺溶液的形式加入，其浓度为10～35wt％(w/w)；所述对醛基苯甲酸溶液、4-二甲氨基吡啶溶液和二环己基碳二亚胺溶液的溶剂与壳聚糖溶液中的溶剂相同。

优选地，步骤(1)所述搅拌和反应均在室温下进行。

优选地，步骤(1)所述沉淀的时间为12～48h，沉淀剂为去离子水，反应产物混合液与加入沉淀剂的体积比为9：(3～7)；所述洗涤指用无水乙醇和去离子水反复洗涤5～10次，至溶液无色即可；所述抽滤为常温常压抽滤。

优选地，步骤(2)和(3)所述HAuCl₄溶液的浓度为0.5～5mmol/L，溶剂为水。

优选地，步骤(2)所述HAuCl₄溶液中的HAuCl₄、表面活性剂和NaBH₄溶液中NaBH₄的摩尔比为(5～9)mmol：(1.25～50)mol：(5～12)mmol。

优选地，步骤(2)和(3)所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，所述表面活性剂以表面活性剂溶液的形式加入，其浓度为0.05～2mol/L，溶剂为水。

优选地，步骤(2)所述NaBH₄溶液的浓度为5～12mmol/L，溶剂为水。

优选地，步骤(3)所述HAuCl₄溶液中的HAuCl₄、表面活性剂、AgNO₃溶液中AgNO₃和还原剂溶液中的还原剂的摩尔比为(10～15)mmol：(1.25～50)mol：(4.2～10.8)mmol：(80～150)mmol。

优选地，步骤(3)所述还原剂溶液中的还原剂为维生素C(Vc)和NaBH₄中的至少一种；其浓度为80～150mmol/L。

优选地，步骤(3)所述AgNO₃溶液的浓度为7～18mmol/L，溶剂为水。

优选地，步骤(4)所述纳米Au生长液和Au种子液的体积比为(1～5)：1。

优选地，步骤(4)所述离心的转速为5000～8000r/min，时间为10～20min；所述洗涤指用无水乙醇和去离子水反复洗涤5～10次，至溶液无色即可；所述抽滤为常温常压抽滤。

优选地，步骤(5)所述醛基化壳聚糖溶于水中形成的溶液浓度为2～7wt％。

优选地，步骤(5)所述醛基化壳聚糖与纳米Au棒粉末的质量比为(2～7)：(1～10)。

优选地，步骤(5)所述纳米Au棒粉末在体系中的浓度为1～10wt％。

优选地，步骤(5)所述分散均匀的方式为超声振荡，超声的时间为5～10min。

优选地，步骤(6)所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为2～8wt％，其中羧甲基壳聚糖的分子量为2000，取代度80～85％，溶剂为水。

优选地，步骤(6)所述羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳聚糖、纳米Au棒混合溶液中的纳米Au棒和MnCl₂·4H₂O水溶液中的MnCl₂·4H₂O的质量比为(20～80)：(1～10)：(2～16)。

优选地，步骤(6)所述MnCl₂·4H₂O水溶液的浓度为1～8wt％。

上述方法制得的一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶。

上述一种集磁共振成像和光热治疗于一体的高分子自愈凝胶的应用。

本发明所用原料中醛基化壳聚糖(OCS)能够稳定包裹纳米金棒，且羧甲基壳聚糖(CMC)分子链上的氨基和OCS分子链上的醛基会发生席夫碱作用，同时还存在高分子物理缠绕和氢键作用，形成第一层交联网络。此外，CMC分子链上的氨基、羧基又与Mn²⁺之间存在配位螯合作用，形成第二层交联网络。双层高分子交联网络的形成，大大稳定了水凝胶的内部结构；而纳米金棒有一定的光热效果，鳌合的活性物质Mn²⁺又具有锰加强磁共振成像的特性；则最终可以制备出一种稳定性好、安全性高、同时具有两种诊疗手段的复合医疗水凝胶。

本发明所述水凝胶以壳聚糖衍生物为主要的高分子链，协同由席夫碱键间形成的动态共价键和氢键、金属配位键形成的非共价键作用，结合高分子链间的物理缠绕作用形成的具有三维网络结构的自愈水凝胶，同时以纳米金棒为纳米填料均匀的分散在水凝胶网络中，既增加了刚性位点，稳定了水凝胶的内部结构；又具有一定的光热效果。再结合鳌合的活性物质Mn²⁺，能够促进受损神经修复的同时，又具有锰加强磁共振成像的特性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明中的高分子凝胶制备简单、安全性高。在常温、不需要引发剂的条件下通过原料“一锅”混合搅拌便可制备成该凝胶。此外，相对于人工合成高分子，本发明由天然来源的壳聚糖衍生物制备，可降解且生物相容、安全性更高，更合适用于人体医疗方面。

2、本发明中的高分子凝胶为寻找磁共振成像造影剂的替代品提供了新的切入点。传统造影剂毒性大、体内流动不稳定、难降解，而天然高分子水凝胶具有三维网络结构，是良好的医用载体；同时低浓度Mn²⁺又是人体内所需的微量元素，具有一定的生物活性，能促进受损软骨修复；因此，本发明制备的鳌合Mn²⁺水凝胶具有促进细胞生长和组织修复等生物功能，有望代替现有的高毒类造影剂应用于人体。

3、本发明中的高分子凝胶提供了一种更便捷的双重诊疗手段。目前Mn已被证明具有锰加强磁共振成像的特性，可以用作造影诊断剂；同时体系中还含具有纳米金棒，可以应用于光热治疗；因此本发明制备的复合水凝胶可以将磁共振成像和光热治疗一体化，“一次注射”便可满足诊疗“双效果”，为医用诊断和治疗方面提供了更准确、便捷的方法。

4、本发明开拓了对“磁共振成像+”的多重功能联合的研究思路，虽然仅涉及“磁共振成像+光热治疗”方面的研究，但针对不同的功能需求，可通过加入不同特性的原料，如导电材料、光热材料、成像材料等，实现多功能复合材料的定向制备，从而达到多重效果集于一体的目的。

附图说明

图1为实施例1中制备的复合水凝胶冻干后的扫描电镜图(SEM)。

图2为实施例2中制备的复合水凝胶在pH＝7.4的PBS缓冲液、37℃下的溶胀曲线。

图3为实施例2中制备的复合水凝胶在pH＝7.4的PBS缓冲液、37℃下的降解曲线。

图4为实施例5中制备的复合水凝胶的体外细胞毒性效果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

(1)称取2g羧甲基壳聚糖粉末溶于100mL去离子水中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.1g壳聚糖溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(2)称取2.2g对醛基苯甲酸溶于20mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取0.66g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.1g二环己基碳二亚胺(DCC)溶于10mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(3)量取50mL步骤(1)所得的壳聚糖溶液于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下分别量取步骤(2)所配制的20mL对醛基苯甲酸溶液、10mL DMAP溶液、10mL DCC溶液，依次按顺序加入壳聚糖溶液中，前两个溶液加入后均搅拌5min。全部加入完成后，常温搅拌1d。待反应结束后，加入30mL去离子水进行沉降12h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤5次，常温常压抽滤后得到浅黄色OCS粉末。

(4)量取5mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在25℃下磁力搅拌5s，再加入25mL浓度为0.05mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌5s后，再加入1mL浓度为5mmol/L的NaBH₄水溶液，搅拌60s便可获得金种子液。

(5)量取10mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在25℃下磁力搅拌5s，再加入25mL浓度为0.05mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌5s后，再依次加入0.6mL浓度为7mmol/L的AgNO₃溶液、1mL浓度为80mmol/L的Vc水溶液，各溶液加入后分别搅拌5s，便可获得纳米Au生长液。

(6)量取2mL步骤(4)所得的种子液，加入2mL步骤(5)所得的生长液，在25℃下磁力搅拌5s后，常温放置18h，待金棒生长稳定后，将混合溶液在5000r/min的速率下离心10min。待离心结束后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤5次，常温常压抽滤后得到纳米Au棒粉末。

(7)称取0.02g步骤(3)所得的OCS粉末溶于1mL去离子水中，超声振荡5min至分散均匀，再加入0.01g步骤(6)所得的纳米Au棒粉末，磁力搅拌1h后，制备出纳米Au棒混合溶液。

(8)称取0.04g的MnCl₂·4H₂O溶于4mL去离子水中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，常温放置备用。

(9)量取10mL步骤(1)所得的羧甲基壳聚糖溶液于烧杯中，磁力搅拌下加入1mL步骤(7)所得的纳米Au棒混合溶液，充分搅拌2h后；再缓慢加入2mL步骤(8)所得的Mn²⁺溶液，常温搅拌20h后，即得复合水凝胶。

本实施例所得复合水凝胶的SEM图见图1，结合SEM图分析可知，该复合水凝胶具有多孔的三维网络结构，整个交联体系是以羧甲基壳聚糖(CMC)鳌合Mn²⁺作为结构支撑的。其中有棒状突起的交联点为被醛基化壳聚糖(OCS)表面包裹的纳米金棒，同时OCS与CMC又有高分子结合及缠绕作用，穿插在CMC鳌合Mn²⁺的整体结构中。而吸附在高分子表面的微小颗粒，可能为未鳌合的Mn离子或纳米金颗粒(因为本发明制备纳米金棒的方法，可能导致金棒中含有纳米金颗粒杂质)。

实施例2

(1)称取8g羧甲基壳聚糖粉末溶于100mL去离子水中，常温磁力搅拌5h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取5.5g壳聚糖溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌6h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(2)称取6.6g对醛基苯甲酸溶于20mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.32g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取3.85g二环己基碳二亚胺(DCC)溶于10mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(3)量取50mL步骤(1)所得的壳聚糖溶液于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下分别量取步骤(2)所配制的20mL对醛基苯甲酸溶液、10mL DMAP溶液、10mL DCC溶液，依次按顺序加入壳聚糖溶液中，前两个溶液加入后均搅拌30min。全部加入完成后，常温搅拌4d。待反应结束后，加入70mL去离子水进行沉降48h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤10次，常温常压抽滤后得到浅黄色OCS粉末。

(4)量取9mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在40℃下磁力搅拌60s，再加入25mL浓度为2mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌60s后，再加入1mL浓度为12mmol/L的NaBH₄水溶液，搅拌5s便可获得金种子液。

(5)量取15mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在40℃下磁力搅拌60s，再加入25mL浓度为2mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌60s后，再依次加入0.6mL浓度为18mmol/L的AgNO₃溶液、1mL浓度为150mmol/L的Vc水溶液，各溶液加入后分别搅拌60s，便可获得纳米Au生长液。

(6)量取2mL步骤(4)所得的种子液，加入10mL步骤(5)所得的生长液，在40℃下磁力搅拌60s后，常温放置6h，待金棒生长稳定后，将混合溶液在8000r/min的速率下离心20min。待离心结束后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤10次，常温常压抽滤后得到纳米Au棒粉末。

(7)称取0.07g步骤(3)所得的OCS粉末溶于1mL去离子水中，超声振荡10min至分散均匀，再加入0.1g步骤(6)所得的纳米Au棒粉末，磁力搅拌3h后，制备出纳米Au棒混合溶液。

(8)称取0.32g的MnCl₂·4H₂O溶于4mL去离子水中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，常温放置备用。

(9)量取10mL步骤(1)所得的羧甲基壳聚糖溶液于烧杯中，磁力搅拌下加入1mL步骤(7)所得的纳米Au棒混合溶液，充分搅拌5h后；再缓慢加入2mL步骤(8)所得的Mn²⁺溶液，常温搅拌4h后，即得复合水凝胶。

图2为本实施例中制备的复合水凝胶的溶胀性能。从溶胀曲线看，该复合凝胶溶胀性能较好，溶胀平衡率可达830％。这归因于多孔的网络结构以及添加了刚性的纳米填料，导致凝胶在冻干后具备较好的吸湿能力，增加抗逆性，能保持一定时间内的溶胀平衡。

图3为本实施例中制备的复合水凝胶的溶解性能。从降解曲线来看，该复合凝胶具有可降解性，在降解7天后，能保持原有凝胶52.56％的质量，但在14天后，凝胶质量降到10％以下，说明该凝胶有望用作生物体内的载药材料，在缓慢释放药物后，也可在一定时间内达到降解要求，避免长期残留在生物体内。

实施例3

(1)称取6g羧甲基壳聚糖粉末溶于100mL去离子水中，常温磁力搅拌4h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取2.5g壳聚糖溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(2)称取2.5g对醛基苯甲酸溶于20mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取0.8g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.68g二环己基碳二亚胺(DCC)溶于10mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(3)量取50mL步骤(1)所得的壳聚糖溶液于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下分别量取步骤(2)所配制的20mL对醛基苯甲酸溶液、10mL DMAP溶液、10mL DCC溶液，依次按顺序加入壳聚糖溶液中，前两个溶液加入后均搅拌10min。全部加入完成后，常温搅拌1d。待反应结束后，加入40mL去离子水进行沉降18h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤，常温常压抽滤后得到浅黄色OCS粉末。

(4)量取8mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在35℃下磁力搅拌10s，再加入25mL浓度为1mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌10s后，再加入1mL浓度为10mmol/L的NaBH₄水溶液，搅拌20s便可获得金种子液。

(5)量取12mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在35℃下磁力搅拌10s，再加入25mL浓度为1mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌10s后，再依次加入0.6mL浓度为10mmol/L的AgNO₃溶液、1mL浓度为90mmol/L的Vc水溶液溶液，各溶液加入后分别搅拌20s，便可获得纳米Au生长液。

(6)量取2mL步骤(4)所得的种子液，加入5mL步骤(5)所得的生长液，在35℃下磁力搅拌15s后，常温放置8h，待金棒生长稳定后，将混合溶液在6000r/min的速率下离心10min。待离心结束后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤7次，常温常压抽滤后得到纳米Au棒粉末。

(7)称取0.03g步骤(3)所得的OCS粉末溶于1mL去离子水中，超声振荡10min至分散均匀，再加入0.06g步骤(6)所得的纳米Au棒粉末，磁力搅拌1.5h后，制备出纳米Au棒混合溶液。

(8)称取0.12g的MnCl₂·4H₂O溶于4mL去离子水中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，常温放置备用。

(9)量取10mL步骤(1)所得的羧甲基壳聚糖溶液于烧杯中，磁力搅拌下加入1mL步骤(7)所得的纳米Au棒混合溶液，充分搅拌2h后；再缓慢加入2mL步骤(5)所得的Mn²⁺溶液，常温搅拌16h后，即得复合水凝胶。

实施例4

(1)称取4g羧甲基壳聚糖粉末溶于100mL去离子水中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取4.5g壳聚糖溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌3h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(2)称取6g对醛基苯甲酸溶于20mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取0.9g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.5g二环己基碳二亚胺(DCC)溶于10mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(3)量取50mL步骤(1)所得的壳聚糖溶液于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下分别量取步骤(2)所配制的20mL对醛基苯甲酸溶液、10mL DMAP溶液、10mL DCC溶液，依次按顺序加入壳聚糖溶液中，前两个溶液加入后均搅拌25min。全部加入完成后，常温搅拌2d。待反应结束后，加入70mL去离子水进行沉降35h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤，常温常压抽滤后得到浅黄色OCS粉末。

(4)量取6mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在30℃下磁力搅拌15s，再加入25mL浓度为0.8mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌15s后，再加入1mL浓度为7mmol/L的NaBH₄水溶液，搅拌45s便可获得金种子液。

(5)量取13mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在30℃下磁力搅拌15s，再加入25mL浓度为0.8mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌15s后，再依次加入0.6mL浓度为8mmol/L的AgNO₃溶液、1mL浓度为85mmol/L的Vc水溶液溶液，各溶液加入后分别搅拌20s，便可获得纳米Au生长液。

(6)量取2mL步骤(4)所得的种子液，加入3mL步骤(5)所得的生长液，在30℃下磁力搅拌45s后，常温放置9h，待金棒生长稳定后，将混合溶液在7000r/min的速率下离心20min。待离心结束后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤9次，常温常压抽滤后得到纳米Au棒粉末。

(7)称取0.04g步骤(3)所得的OCS粉末溶于1mL去离子水中，超声振荡10min至分散均匀，再加入0.05g步骤(6)所得的纳米Au棒粉末，磁力搅拌3h后，制备出纳米Au棒混合溶液。

(8)称取0.16g的MnCl₂·4H₂O溶于4mL去离子水中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，常温放置备用。

(9)量取10mL步骤(1)所得的羧甲基壳聚糖溶液于烧杯中，磁力搅拌下加入1mL步骤(7)所得的纳米Au棒混合溶液，充分搅拌2h后；再缓慢加入2mL步骤(8)所得的Mn²⁺溶液，常温搅拌6h后，即得复合水凝胶。

实施例5

(1)称取3g羧甲基壳聚糖粉末溶于100mL去离子水中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取3.2g壳聚糖溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(2)称取3g对醛基苯甲酸溶于20mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取0.7g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌1h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。称取1.35g二环己基碳二亚胺(DCC)溶于10mL二甲基亚砜(化学纯)中，常温磁力搅拌2h至溶解均匀，放置在4℃冰箱中保存备用。

(3)量取50mL步骤(1)所得的壳聚糖溶液于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下分别量取步骤(2)所配制的20mL对醛基苯甲酸溶液、10mL DMAP溶液、10mL DCC溶液，依次按顺序加入壳聚糖溶液中，前两个溶液加入后均搅拌10min。全部加入完成后，常温搅拌3d。待反应结束后，加入50mL去离子水进行沉降40h，用无水乙醇和去离子水交替洗涤，常温常压抽滤后得到浅黄色OCS粉末。

(4)量取6mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在32℃下磁力搅拌25s，再加入25mL浓度为0.1mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌25s后，再加入1mL浓度为6mmol/L的NaBH₄水溶液，搅拌30s便可获得金种子液。

(5)量取14mL浓度为1mmol/L的HAuCl₄溶液加入圆底烧瓶中，在32℃下磁力搅拌25s，再加入25mL浓度为0.1mol/L的表面活性剂CTAB水溶液，搅拌25s后，再依次加入0.6mL浓度为9mmol/L的AgNO₃溶液、1mL浓度为95mmol/L的Vc水溶液溶液，各溶液加入后分别搅拌15s，便可获得纳米Au生长液。

(6)量取2mL步骤(4)所得的种子液，加入4mL步骤(5)所得的生长液，在32℃下磁力搅拌45s后，常温放置15h，待金棒生长稳定后，将混合溶液在8000r/min的速率下离心20min。待离心结束后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤10次，常温常压抽滤后得到纳米Au棒粉末。

(7)称取0.05g步骤(3)所得的OCS粉末溶于1mL去离子水中，超声振荡10min至分散均匀，再加入0.04g步骤(6)所得的纳米Au棒粉末，磁力搅拌2h后，制备出纳米Au棒混合溶液。

(8)称取0.08g的MnCl₂·4H₂O溶于4mL去离子水中，常温磁力搅拌0.5h至溶解均匀，常温放置备用。

(9)量取10mL步骤(1)所得的羧甲基壳聚糖溶液于烧杯中，磁力搅拌下加入1mL步骤(7)所得的纳米Au棒混合溶液，充分搅拌2h后；再缓慢加入2mL步骤(8)所得的Mn²⁺溶液，常温搅拌20h后，即得复合水凝胶。

图4为本实施例中制备的复合水凝胶的体外细胞毒性效果。在复合凝胶表面培养(培养条件：高糖DMEM+10％FBS小牛血清，37℃)1、4天的肿瘤细胞(293细胞)，观察其荧光染色(AO/PI染色)效果。其中，图中显示的绿色部分为活细胞，红色部分为死细胞。从染色结果可以看出，死细胞量较少，说明材料的生物毒性较低。随着时间的增长，接种于材料表面的细胞量逐渐增加，说明细胞在材料表面有较好的增殖能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。