阅读说明：本技术 一种医用重组人源胶原蛋白及其制造方法 (Medical recombinant human collagen and preparation method thereof ) 是由 范小晴 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种医用重组人源胶原蛋白。所述医用重组人源胶原蛋白所述蛋白为单链结构,所述蛋白的等电点为6.8,所述蛋白包括氨基酸组数为268组。还提供一种医用重组人源胶原蛋白的制造方法,包括以下步骤：S1制备质粒；S2菌落转化；S3发酵培养；S4重组人源胶原蛋白的诱导；S5蛋白纯化,S1中的制备质粒：优选人员蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段。本发明提供的医用重组人源胶原蛋白具有可以充分的体现重组人源胶原蛋白使用时的水溶性更好的质量,并且可以适应使用者的体温标准,提高使用者使用重组人源胶原蛋白与人体的相容性,应用于人体上时减少人体的免疫排斥和过敏现象,方便对医药医疗的应用。(The invention provides a medical recombinant human collagen. The medical recombinant human collagen is of a single-chain structure, the isoelectric point of the protein is 6.8, and the number of the protein groups including amino acid groups is 268. Also provides a method for preparing the medical recombinant human collagen, which comprises the following steps: s1 preparing plasmids; s2 bacterial colony transformation; s3 fermentation culture; s4 induction of recombinant human collagen; purification of S5 protein, preparation of plasmid in S1: preferably DNA fragments of the helical region of the type II and type III collagen genes in human proteins. The medical recombinant human collagen provided by the invention can fully reflect the better water solubility quality of the recombinant human collagen when in use, can adapt to the body temperature standard of a user, improves the compatibility of the recombinant human collagen used by the user and the human body, reduces the immune rejection and allergy phenomena of the human body when applied to the human body, and is convenient for application to medical treatment.)

一种医用重组人源胶原蛋白及其制造方法

技术领域

本发明涉及医用蛋白技术领域，尤其涉及一种医用重组人源胶原蛋白及其制造方法。

背景技术

胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面，胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸、碱法处理动物来源的组织，从中提取胶原蛋白，但所得到的产品成分复杂，主要应用于饲料添加及微生物发酵培养基，四川铭让生物科技有限公司采用生物酶定向剪切技术，生产的胶原蛋白组成稳定，具有生物活性，但以上这些方法得到的胶原蛋白产品都有一定的病毒隐患，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。

通过对人体胶原蛋白的重组，重组后的胶原蛋白应用在医学领域中时，蛋白的亲和性和相容性较差，并且蛋白的温度适应范围受到限制，当人体体温出现差异时，重组人源胶原蛋白无法体现其最佳的效果。

因此，有必要提供一种医用重组人源胶原蛋白解决上述技术问题。

发明内容

本发明提供一种医用重组人源胶原蛋白，解决了重组人源胶原蛋白体温适应范围固定的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供的医用重组人源胶原蛋白所述蛋白为单链结构，所述蛋白的等电点为6.8，所述蛋白包括氨基酸组数为268组。

一种医用重组人源胶原蛋白的制造方法，包括以下步骤：

S1制备质粒；

S2菌落转化；

S3发酵培养；

S4重组人源胶原蛋白的诱导；

S5蛋白纯化。

优选的，S1中的制备质粒：

优选人员蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用 PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI 和XhoI的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒。

优选的，提取质粒完成后再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功重组表达载体，命名为为pET32a-NTOD。

优选的，S2中的菌落转化：

将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中 36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。

优选的，S3中的发酵培养：

将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为0.5g/L、 1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5.2～7 之间，培养18～21小时，将培养后的转化子转接入FBS培养基的大罐发酵，生长温度控制在29.5～30℃。

优选的，S4中的诱导：

诱导温度应低于生长温度，pH相同，溶氧控制在22％～28％，诱导发酵的时间在38～44小时。

优选的，S5中的蛋白转化：

用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液，利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。

与相关技术相比较，本发明提供的医用重组人源胶原蛋白具有如下有益效果：

本发明提供一种医用重组人源胶原蛋白，可以充分的体现重组人源胶原蛋白使用时的水溶性更好的质量，并且可以适应使用者的体温标准，提高使用者使用重组人源胶原蛋白与人体的相容性，应用于人体上时减少人体的免疫排斥和过敏现象，方便对医药医疗的应用。

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明作进一步说明。

一种医用重组人源胶原蛋白包括：所述蛋白为单链结构，所述蛋白的等电点为6.8，所述蛋白包括氨基酸组数为268组。

一种医用重组人源胶原蛋白的制造方法，包括以下步骤：S1制备质粒； S2菌落转化；S3发酵培养；S4重组人源胶原蛋白的诱导；S5蛋白纯化。

S1中的制备质粒：

优选人员蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用 PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI 和XhoI的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒。

提取质粒完成后再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功重组表达载体，命名为为 pET32a-NTOD。

S2中的菌落转化：

将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中 36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。

S3中的发酵培养：

将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为0.5g/L、 1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5.2～7 之间，培养18～21小时，将培养后的转化子转接入FBS培养基的大罐发酵，生长温度控制在29.5～30℃。

S4中的诱导：

诱导温度应低于生长温度，pH相同，溶氧控制在22％～28％，诱导发酵的时间在38～44小时。

S5中的蛋白转化：

用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液，利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。

用诱导发酵后的菌落，用30-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合TritonX-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌，每2s超声，留有6s间歇，全长45min，保护温度控制在40～46℃，12200rpm/min离心20min，收集上清液。

此时溶液中即含有大量的pET32a-NTOD重组蛋白。

用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱柱材，然后将柱材和pET32a-NTOD的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有15mM咪唑的PBS 溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的Trx-HC8，在柱上加入适量具有His标签的PPase蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将pET32a-NTOD蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱pET32a-NTOD蛋白，所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

与相关技术相比较，本发明提供的医用重组人源胶原蛋白具有如下有益效果：

可以充分的体现重组人源胶原蛋白使用时的水溶性更好的质量，并且可以适应使用者的体温标准，提高使用者使用重组人源胶原蛋白与人体的相容性，应用于人体上时减少人体的免疫排斥和过敏现象，方便对医药医疗的应用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。