阅读说明：本技术 一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法 (Method for rapidly identifying transgenic arabidopsis by using seed fluorescence ) 是由 罗丽娟 李敏 刘秦 吴远航 刘攀道 蒋凌雁 陈银华 于 2019-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,公开了一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法,通过构建的pOGT载体构建重组基因载体,重组基因载体携带外源基因导入拟南芥中后,转基因拟南芥种子能够观察到荧光,与野生型拟南芥区分开来。本发明公开的pOGT植物表达载体体系避免了抗生素或除草剂对发育缺陷型植株的危害,摆脱了对无菌工作环境和大面积种植空间的需求,缩短了获得转基因植株的时间和成本。(The invention belongs to the technical field of biology, and discloses a method for rapidly identifying transgenic arabidopsis thaliana by using seed fluorescence. The pOGT plant expression vector system disclosed by the invention avoids the damage of antibiotics or herbicides to development defective plants, gets rid of the requirements on sterile working environment and large-area planting space, and shortens the time and cost for obtaining transgenic plants.)

一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法。

背景技术

转基因拟南芥的出现极大地促进了植物基因功能的研究。筛选转基因拟南芥是鉴定阳性转基因植株的重要步骤。筛选转基因植株通常需要一个选择性标记基因，这些基因多为抗生素抗性或除草剂抗性基因。这种筛选方法在很长一段时间内为我们提供了便利，但通过这种方法获得转基因拟南芥却存在着一些难以避免问题：第一，虽然转基因植株携带抗生素或除草剂抗性基因等选择性标记，但转基因导致的发育缺陷型植株可能对抗生素或除草剂十分敏感[Toxic Reactivity of Wheat(Triticum aestivum)Plants toHerbicide Isoproturon.Yin XL,Jiang L,Song NH,Yang H.Agr Food Chem.2008；56(12):4825-4831.]；第二，传统的选择性标记需要无菌工作条件、大批的植物处理量和植物种植空间。这些因素在一定程度上为建立转基因拟南芥株系带来了困难。

拟南芥种子中分布着大量的油体蛋白(Oleosin,OLEs)。OLE1(At4g25140)是油体蛋白的一种，存在于种子的整个发育时期，保证种子正常萌发[A novel role foroleosins in freezing tolerance of oilseeds in Arabidopsisthaliana.Plant.Shimada TL,Tomoo S,Hideyuki T,Fukao Y,Hara-Nishimura I.2010；55(5):798-809.]。pCXSN质粒是一种商业载体，可用于植物超量表达载体构建。pCXSN载体存在一段ccdB致死基因，转入普通大肠杆菌菌株(例如DH5a和Trans1-T1)中将导致菌株死亡，将pVS1 StaA和KanR基因的Xcm I位点突变后，用限制性内切酶Xcm I酶切后可切除pCXSN载体上的ccdB致死基因，形成T载体，连入基因后可以直接转化普通大肠杆菌菌株[AVersatile Zero Background T-Vector System for Gene Cloning and FunctionalGenomics.Chen SB,Songkumarn P,Liu JL,Wang GL.Plant Physiol.2009；150(3):1111-1121.]。

发明内容

本发明以pCXSN植物表达载体为载体骨架，Pro_OLE1::OLE1::GFP种子荧光蛋白基因为筛选标记基因开发了一种的新型植物表达载体，并将其命名为pOGT(plasmid of OLE1-GFP T-vector)。pOGT载体经Xcm I酶切后变成T载体，通过TA克隆可以将外源PCR片段克隆到pOGT载体中，随后将得到的重组载体导入拟南芥中，利用种子荧光完成转基因拟南芥的筛选。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：

(1)从拟南芥基因组中扩增Pro_OLE1::OLE1片段，克隆到pA7-GFP载体中，得到重组载体pA7-OLE1-GFP；

(2)以重组载体pA7-OLE1-GFP为模板，克隆Pro_OLE1::OLE1-GFP片段；将克隆到的Pro_OLE1::OLE1-GFP片断插入pCXSN载体中，得到重组载体pCXSN-OLE1-GFP；

(3)突变重组载体pCXSN-OLE1-GFP上Pro_OLE1的XcmI位点得到pOGT载体；

(4)采用pOGT载体构建重组基因载体，将重组基因载体转入感受态细胞，选择正确单克隆，侵染拟南芥得到转基因拟南芥种子，转基因种子能够观察到荧光。

进一步，所述步骤(1)中，重组载体pA7-OLE1-GFP的构建方法为：根据拟南芥OLE1基因及其启动子序列，设计合成特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，以拟南芥基因组为模板，克隆OLE1基因的启动子和OLE1基因(Pro_OLE1::OLE1)；SalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切pA7-GFP载体后回收4591bp线性化pA7-GFP片段，将克隆得到的Pro_OLE1::OLE1片段克隆到pA7-GFP载体中，即得重组载体pA7-OLE1-GFP；特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，其序列为分别为：

ACGAACGATACTCGAGCACCCTACTTAGATCAACACATA和TCACTAGTACGTCGACAGTAGTGTGCTGGCCACC。

进一步，所述的步骤(2)中，重组载体pCXSN-OLE1-GFP的构建方法为：根据Pro_OLE1::OLE1-GFP序列设计合成一对特异性引物pOGT-F和pOGT-R，以pA7-OLE1-GFP质粒为模板，pOGT-F、pOGT-R为引物，克隆Pro_OLE1::OLE1-GFP片段；HindⅢ酶切pCXSN载体，回收10802bp线性化pCXSN大片段；用同源重组酶将Pro_OLE1::OLE1::GFP片段插入到pCXSN载体的HindⅢ酶切位点之间，然后转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，得到pCXSN-OLE1-GFP重组载体；特异性引物pOGT-F和pOGT-R其序列分别为：GCAGGCATGCAAGCTTCACCCTACTTAGATCAACACAT；pOGT-R其序列为：GGCCAGTGCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATG。

进一步，所述的步骤(3)中，突变重组载体pCXSN-OLE1-GFP上Pro_OLE1的XcmI位点的方法，采用Quick MutationTM基因定点突变试剂盒说明书(Biyotime公司)中的突变Pro_OLE1的XcmI位点突变方法，点突变引物为PM-XcmⅠ-F、PM-XcmⅠ-R，PM-XcmⅠ-F其序列为：TCGGTCTTGGTCACACAAGGAACTCTCTGGTAA；PM-XcmⅠ-R其序列为：TTACCAGAGAGTTCCTTGTGTGACCAAGACCGA。

进一步，所述步骤(4)中，重组基因载体的构建方法为：Xcm I酶切pOGT载体，回收大片段，得到T载体；在外源基因末端加上腺嘌呤脱氧核糖核苷酸后用T4连接酶连入T载体；将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1-T1，得到重组基因载体。

进一步，所述的重组基因载体的基因为木薯MeEXPA30基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

进一步，木薯MeEXPA30基因转入拟南芥中所采用的方法为：Xcm I酶切pOGT载体，回收收大片段，得到T载体；在外源基因MeEXPA30末端加上腺嘌呤脱氧核糖核苷酸后用T4连接酶连入T载体，热激法将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1-T1；37℃过夜培养后，得到pOGT-MeEXPA30重组载体；将pOG-MeEXPA30载体转入感受态细胞，侵染拟南芥得到转基因拟南芥种子。

进一步，侵染拟南芥的方法选择浸花法。

进一步，所用的感受态细胞为GV3101根癌农杆菌。

本发明的有益效果：

采用本发明所述的pOGT载体可以将外源的基因片段克隆到pOGT载体中，重组基因载体导入拟南芥中后，转基因拟南芥种子可以观察到荧光，利用种子的荧光即可实现转基因拟南芥的筛选。与传统筛选技术相比，本发明公开的pOGT植物表达载体体系避免了抗生素或除草剂对发育缺陷型植株的危害，摆脱了对无菌工作环境和大面积种植空间的需求，在一定程度上缩短了获得转基因植株的时间和成本，为从事拟南芥转化工作的科研工作者提供了更多的选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1pOGT载体构建流程示意图，在扩增引物中，来自载体的16bp上游序列用小写字母表示。

图2为克隆Pro_OLE1::OLE1片段的凝胶电泳图，其中，1为拟南芥OLE1promoter::OLE1基因的PCR扩增产物。

图3为XhoⅠ和SalⅠ酶切pA7-GFP载体的凝胶电泳图，其中，2和3为pA7-GFP质粒SalⅠ和XhoⅠ酶切产物。

图4用引物pOLE1-F和pOLE1-R对5个随机单克隆进行菌落PCR的凝胶电泳图，其中，4-8为5个pA7::GFP::OLE1::promoter::OLE1重组载体的PCR产物。

图5为PCR扩增Pro_OLE1::OLE1-GFP片段的凝胶电泳图，其中，9为Pro_OLE1::OLE1-GFP片段，10-11为HindⅢ酶切pCXSN载体产物，12-13为pCXSN-OLE1-GFP重组载体。

图6为pOGT重组载体凝胶电泳图。

图7为pOGT转基因拟南芥种子的荧光和分子检测，其中，(a-e)明场的图像；(f-j)荧光显微镜下同一物象；(a,f)Col-0(野生型)拟南芥种子；(b,g)T₀代pOGT转基因拟南芥种子；(c,h)T₁代pOGT转基因拟南芥种子；(d,i)T₀代pCXSN-OLE1-GFP转基因拟南芥种子；(e,j)T₁代pCXSN-OLE1-GFP转基因拟南芥种子。

图8为突变前后T₀、T₁代种子荧光比例比较。

图9为野生型、点突变后和点突变前转基因拟南芥中GFP的相对表达量比较。图10为转基因拟南芥基因组DNA凝胶电泳图。

图11为pOGT-MeEXPA30载体构建示意图。

图12为野生型拟南芥种子和T₀、T₁代pOGT-MeEXPA30拟南芥种子图片。图13为在显微镜下的每个随机视图中，荧光种子与种子总数的比值。

图14为T₁代pOGT-MeEXPA30转基因拟南芥的PCR鉴定凝胶电泳。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

pOGT载体的构建方法

1.OLE1-GFP载体构建

根据TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)上公布的拟南芥OLE1基因及其启动子序列，设计合成特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R(表1)。以拟南芥基因组为模板，克隆OLE1基因的启动子和OLE1基因(Pro_OLE1::OLE1)(图1，图2lane1)。SalⅠ和XhoⅠ(New EnglandBiolabs)限制性内切酶酶切pA7-GFP载体(BioVector)后回收4591bp线性化pA7-GFP片段(图1，图3lane2-3)。按照同源重组酶(Vazyme ClonExpressII One Step Cloning Kit)产品说明书、大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen Biotech)产品说明书进行重组反应和产物转化。过夜培养后，挑取重组反应转化平板上若干单克隆进行菌落PCR鉴定(图1，图4lane4-8)，并将阳性克隆的菌液送测序，将测序正确的载体命名为pA7-OLE1-GFP。

2.pCXSN-OLE1-GFP载体构建

根据Pro_OLE1::OLE1-GFP序列设计合成一对特异性引物pOGT-F、pOGT-R(参见表1)，以正确测序的pA7-OLE1-GFP质粒为模板，pOGT-F、pOGT-R为引物(表1)，克隆Pro_OLE1::OLE1-GFP片段(图1，图5lane9)。HindⅢ酶切pCXSN载体，回收10802bp线性化pCXSN大片段(图1，图5lane10-11)。用同源重组酶(Vazyme)将Pro_OLE1::OLE1::GFP片段插入到pCXSN载体的HindⅢ酶切位点之间，然后转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养12～16h，挑取平板上若干单克隆进行菌落PCR鉴定(图1，图5lane12-13)，并用HindⅢ酶切阳性克隆质粒进行酶切验证，将阳性克隆的菌液送测序，最后得到pCXSN-OLE1-GFP重组载体。

3.pCXSN-OLE1-GFP点突变

因为Pro_OLE1有一个Xcm I酶切位点，为不影响T载体使用，参考Quick MutationTM基因定点突变试剂盒说明书(Biyotime)突变Pro_OLE1的XcmI位点突变，点突变引物为PM-XcmⅠ-F、PM-XcmⅠ-R(表1)，突变的具体操作如下。测序成功后得到pOGT重组载体(图1，图6)。

基因定点突变反应：

(1)如下设置基因定点突变反应体系：

(2)按照如下参数设置PCR仪

(3)DpnI消化

PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI，混匀后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。DpnI消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

(4)转化、挑克隆鉴定

感受态细菌的转化效率至少在10⁷以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100μl的DB3.1感受态细菌中可以加入5-10μl经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。对于得到的克隆，可以挑取3-5个克隆送样测序去测序，以确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。

为保证OLE1启动子区域的XcmI位点突变后不会对OLE1启动子的表达造成影响，分别把pCXSN-OLE1-GFP和pOGT植物表达载体转到拟南芥中，得到两种转基因植株。用RNA-plant Plus(Tiangen biotech)提取转基因拟南芥RNA，反转成cDNA(PrimeScript RTreagent Kit，TaKaRa)后，用RT-qPCR(SYBR realtime PCR Kit，TaKaRa)检测两种转基因植株的GFP表达量和荧光种子(图7-10)。图中，T₁代种子是荧光强度最强的T₀代种子的后代。图8和图9中数值为平均值±SE，实验设置三个重复(n＝3)。小写字母表示组间差异(p<0.01)。统计检验采用t检验。实验结果表明，两株转基因拟南芥种子均可检测到荧光(图7)。T₀、T₁代种子荧光比例无明显差异(图8)，说明点突变前后不会影响种子萌发。野生型、点突变后和点突变前转基因拟南芥中GFP的相对表达量也无明显差异(图9)，说明点突变前后OLE1的启动子活性没有变化。通过种子荧光筛选出来的pOGT转基因拟南芥种子PCR凝胶电泳中均可检测出ProOLE1::OLE1::GFP片段，如图10所示。其中1-10为T₁代幼苗基因组DNA，Lane 11的模板是野生型拟南芥幼苗基因组DNA，Lane 12的模板是ProOLE1::OLE1::GFP片段。证明通过种子荧光筛选出来的pOGT转基因拟南芥中均含有ProOLE1::OLE1::GFP片段。以上实验结果说明种子荧光植物表达载体pOGT碱基定点突变成功。

可利用点突变成功的pOGT重组载体携带外源基因导入拟南芥，制备转基因拟南芥，转基因拟南芥的种子的能够观察到荧光，通过检测拟南芥种子的荧光即可将转基因拟南芥和野生型拟南芥区别开来。

表1 pOGT载体的构建使用的引物序列

实施例2

利用pOGT载体研究木薯基因在拟南芥中的异位表达

Xcm I(New England Biolabs)酶切pOGT载体，回收收大片段，得到T载体。从Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中下载木薯基因，其核苷酸序列如表1和SEQ ID NO:1所示，为了便于表述，命名为MeEXPA30。提取木薯RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用MeEXPA30基因的引物PA30-F、PA30-R(如表3所示)进行PCR，获得MeEXPA30基因。用Takara DNA A-Tailing Kit在外源基因MeEXPA30末端加上A(腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)后用T4连接酶(Thermo)连入T载体。热激法将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1-T1(TransGen Biotech)。37℃过夜培养后进行菌落PCR鉴定，挑选有阳性条带的单克隆摇菌，测序成功后，得到pOGT-MeEXPA30重组载体(图11)。

表2 MeEXPA30核苷酸序列(长度756bp)

表3 MeEXPA30引物序列

将pOG-MeEXPA30载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞(WeiDiBiotechnology)，选择正确单克隆，参考浸花法侵染拟南芥得到T₀代种子。具体操作如下。

所需材料：携带载体的农杆菌(利用冻融法或电转法对农杆菌进行转化)、拟南芥植物。

1L渗透介质含有：0.5×MS、1×Gamborg B5维生素(GIBCO)(可不需要)、5％蔗糖(w/v)、10μl/L苄氨基嘌呤储备溶液、50μl/L Silwet L-77(也被称为“Vac-in-Stuff”)。

(1)将植物放置在10cm²的盆中，密度为10-15株/盆。短日照(光照9-12小时/天)、肥料充足以获得大量花。用尼龙网覆盖盆以固定花盆中的泥土。如果没有短日照的条件，或者时间有限，从一开始就要长日照(光照16-24小时/天)种植植物，但是将密度增加到15-20株/盆。

(2)一旦出现第一个花序芽，立即移除。并将植物移至长日照(光照16-24小时/天)，大约1周后，当次生花序芽高约7～8cm(3英寸)时，可将植物用于转化。按照如下所述进行浸花操作。

(3)在拟南芥转化的前三天，接种含有载体农杆菌到5ml含有选择Ti和T-DNA质粒的抗生素的土壤农杆菌液体LB培养基，于28℃摇床培养。

(4)2天后，将1～2mL预培养液接种到200mL含有合适抗生素(例如卡那霉素和利福平等)的液体YEB培养基中，并在28℃摇床中培养24小时直至OD值≧2.0。

(5)停止浇灌植物，让土壤稍微干燥一点，以免土壤在浸渍过程中从盆中洒落。

(6)培养获得的菌液在室温下6000rpm离心10分钟沉淀农杆菌。请注意，此时细胞是粉红色的。

(7)将细胞沉淀重悬于400ml渗透介质(蔗糖溶液)中，在渗透介质中重新悬浮细胞到OD600＝0.8～1.0。

(8)将农杆菌悬浮液转移到用于浸渍植物的容器中，例如一次性移液管吸头盒或400ml烧杯。

(9)将一盆植物倒置并将其花序芽浸入悬浮液中。将盆放置在烧杯边缘，让植物浸泡约2min，勿将莲座叶浸入，以免拟南芥受到损伤死亡。400mL农杆菌悬浮液可以用于侵染10盆以上拟南芥。

(10)浸泡后，用保鲜膜包裹转化后的拟南芥后，黑暗处理24小时。

(11)24小时后，取下盖子，立直植物，按照常规方法进行日常管理。

(12)约3-4周后，收集拟南芥种子，即为T₀代pOG-MeEXPA30转基因种子。用体视荧光显微镜观察干燥的T₀代pOG-MeEXPA30转基因种子，用湿牙签蘸取强荧光种子播种，得到T₁代拟南芥种子。T₀代种子和T₁代均可以观察到明显的荧光(图12)，可以轻易与野生型进行区分。

分别统计各显微镜随机视图中荧光种子数和种子总数，计算荧光种子与种子总数的比值(图13)。提取荧光种子的T₁代幼苗基因组DNA，用MeEXPA30引物(PA30-F、P30-R，如表3所示)检测，如图14所示。其中，Lane 1-10的模板是荧光种子幼苗基因组DNA，Lane 11的模板是野生型拟南芥幼苗基因组DNA，Lane 12的模板是pOGT-MeEXPA30质粒。可以看出，Lane1-10在MeEXPA30处可以显示出明显的条带，MeEXPA30基因成功转入拟南芥中，与显微镜观察结果一致。

对于其他外源基因，也可以采用本申请所述的pOGT载体转入拟南芥中，通过观察种子荧光进行筛选。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgtcggctg aaacactttc tttctctctt attctcttgt gtttctcact ctctttacgc 60

gaaattttag ctgattatgg agggtgggag agtgctcatg ccaccttcta cggcggcggt 120

gatgcttcag gaacaatggg aggagcatgc gggtacggga atttgtatgg gcaagggtat 180

ggaacaaaca cagcagcact aagcacagcg ttgttcaaca atggaatgag ctgtggagca 240

tgttatgaaa tgagatgtga tgatgatcca agatggtgtc ttcctgggac cctcactgtt 300

actgctacta atttttgtcc accaaatcct tctctcccca acaacaatgg cggatggtgt 360

aatcctcctc tccagcactt cgatttggct gagcctgctt tcctccagat tgctcaatac 420

cgtgctggaa ttgtccctgt cgcctttcga agggttccat gtgtgaagaa aggaggaaca 480

aggttcacca ttaatggtca ctcttacttc aacctggtgt tgatcaccaa cgtcgccggt 540

gcaggagatg ttcatgcagt ttcgatcaaa ggatccagaa caggatggca accaatgtca 600

agaaattggg gacaaaactg gcaaagtaac tcttacctca acggtcaaag cctatccttt 660

caagtcacca ccagtgacgg tagaactgtg acaagctaca acgtggtgcc tgctggttgg 720

cagtttggcc agacctttga aggaggccaa ttttaa 756