阅读说明：本技术 一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用 (Method for regulating and controlling amylose content and gel consistency of crop seeds and application ) 是由 刘耀光 祝钦泷 曾栋昌 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用。所述方法为利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变,创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。利用本发明方法不同程度地降低了水稻突变系胚乳的OsWx基因表达量,快速有效地获得了胚乳直链淀粉含量适度下降、胚乳胶稠度适度增加的蒸煮和食味特性更好的新品系。利用该方法获得不同直链淀粉含量和胶稠度的作物突变系,大大丰富了作物的种质资源,快速培育优质新品种；因此,该方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度、以及培育优质水稻品系或品种中具有广泛的应用前景。(The invention discloses a method for regulating and controlling amylose content and gel consistency of crop seeds and application thereof. The method is characterized in that the upstream part of the initiation codon of the crop Wx gene is subjected to site-specific mutation by using a sequence-specific nuclease genome editing technology, and a mutation system with the changed expression level of the crop Wx gene is created. The method of the invention reduces the OsWx gene expression quantity of the rice mutant endosperm to different degrees, and quickly and effectively obtains a new strain with properly reduced content of endosperm amylose, properly increased endosperm gum consistency and better cooking and taste characteristics. The method is utilized to obtain the crop mutation lines with different amylose contents and gel consistencies, so that the germplasm resources of the crops are greatly enriched, and high-quality new varieties are quickly cultivated; therefore, the method has wide application prospect in regulating and controlling the amylose content and/or the gel consistency of crop seeds and cultivating high-quality rice strains or varieties.)

一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用。

背景技术

作物如水稻、小麦和玉米等种子的胚乳主要成分为淀粉，是人类和动物摄取碳水化合物食物的主要来源；胚乳淀粉主要是由直链淀粉和支链淀粉构成，两者的比例变化会影响淀粉制品的硬度、粘度、糊化温度和胶稠度等理化性质，直链淀粉含量越高，则直链淀粉越硬、粘度越小、胶稠度越低，从而影响淀粉制品的食用口感和食品加工特性。另一方面，工业用途的淀粉也需要直链淀粉含量高的淀粉。因此，开发不同直链淀粉含量的淀粉制品能够满足不同人群的消费要求和食品工业的需求。

不同作物胚乳的直链淀粉是由高度保守的直系同源基因-Waxy基因(简称Wx，也称为蜡质基因)控制，它编码一种功能保守的植物淀粉合成的关键酶-颗粒结合淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase I，GBSSI)，Wx基因的不同等位变异会导致胚乳的直链淀粉含量和胶稠度的变化。在水稻(Oryza sativa L.)中，不同亚种类型(籼稻和粳稻)和不同品种的稻米(胚乳)的直链淀粉含量有明显差异；其中，典型的籼稻品种(O.sativa L.sspindica)的直链淀粉含量在25％左右，米饭较硬；粳稻品种(O.sativa L.ssp japonica)和部分导入粳稻血缘的籼稻的直链淀粉含量在15％～18％左右，米饭软硬适中，符合大部分人的食味喜好；少量原产于云南的软米品种的直链淀粉含量在10％～11％左右，米饭偏软。糯稻品种(籼糯和粳糯)的直链淀粉含量在2％左右，米饭黏软，是粽子、糕点等的用料。以上水稻胚乳直链淀粉含量的差异主要是由于位于第6染色体的OsWaxy基因(简称OsWx，基因号：Os06g0133000)的不同变异型控制，典型籼稻的为OsWx^a型，在进化上属于强功能的原始型；粳稻的为功能弱化的变异型OsWx^b型；软米稻的为功能更弱化的变异型OsWx^mp型；糯稻的为功能完全丧失的oswx突变型；即OsWx功能越强，水稻种子胚乳中的直链淀粉含量越高。

由于直链淀粉含量高的水稻品种的口感较差，为了培育直链淀粉含量适中、食用口感较好的优质籼稻品种，现有传统的育种方法为：利用作物种质资源中存在的自然突变产生的Wx等位基因进行杂交和回交选育新品种；例如，采用杂交和回交的方法把粳稻的OsWx^b等位基因转移到籼稻背景品种中替换原有的OsWx^a。但是，该方法存在以下局限性：(1)可利用的Wx等位基因种类少，如在水稻中，主要为籼型OsWx^a(直链淀粉含量约25％)，粳型OsWx^b(直链淀粉含量约15％～18％)和糯型oswx(直链淀粉含量约2％)；(2)需要多代回交，育种时间长。近年来，序列特异性核酸酶基因组编辑技术，如TALENs技术、CRISPR/Cas(包括多种Cas酶如Cas9、Cas12a等)技术已经发展成熟，并在各种生物中成功应用。

现有技术中，Ma等通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对粳稻品种台中65的OsWx基因的编码区进行编辑，产生移码突变敲除了此基因的功能，获得了直链淀粉为2％左右的糯稻新材料(A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplexgenome editing in monocot and dicot plants.Molecular Plant 8:1274-1284,2015)。范美英等通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对水稻品种秀水134的OsWx基因的编码区进行编辑，产生移码突变敲除了此基因的功能，得到了直链淀粉降低到1.6％～2.1％左右的糯稻新材料(利用CRISPR/Cas9技术创制糯稻新材料，2019)。申请号为201911186091.1的现有专利公开了一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA，在OsWx基因的第7外显子区域设计sgRNA靶点序列，产生移码突变敲除了该基因功能，获得了直链淀粉含量降低到2％左右的糯稻新种质。

但是，以上现有技术均为编辑OsWx基因的编码区产生移码等突变类型，即只是简单地敲除OsWx基因的功能，产生该基因功能失活的突变体，得到直链淀粉含量很低(2％左右)的糯稻，而不能实现对OsWx基因的表达水平量进行调控，从而适度调整直链淀粉到各种含量水平。因此，利用基因组编辑技术研发能同时适量调控作物直链淀粉含量和胶稠度的方法，对于快速培育具有不同直链淀粉含量和胶稠度，改良食味品质和加工特性的作物新品种具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有调控作物种子直链淀粉含量的方法的缺陷和不足，提供一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及其应用。

本发明的目的是提供一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法。

本发明另一目的是提供所述方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度中的应用。

本发明又一目的是提供所述方法在培育优质水稻品系或品种中的应用。

本发明再一目的是提供一种调控作物Wx基因表达水平的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法，利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变，创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。

所述位点特异性突变能够改变Wx基因的5’非编码区(5’UTR)及其第一内含子区的前体RNA剪接点及其旁边序列，使之剪接效率改变，以及改变其启动子区序列而影响其转录活性，从而有效地对作物Wx基因进行表达调控，得到了作物Wx基因表达水平改变的突变系。

优选地，所述位点特异性突变的方法为：选择作物Wx基因的起始密码子上游部分中的一个或多个靶点，构建含不同靶点引导RNA的敲除载体，转化入作物。

更优选地，所述含不同靶点引导RNA为sgRNA表达盒。

优选地，所述起始密码子上游部分为启动子调控区或5’UTR调控区。

优选地，所述序列特异核酸酶基因组编辑技术为CRISPR/Cas基因组编辑技术。

更优选地，所述CRISPR/Cas基因组编辑技术为CRISPR/Cas9基因组编辑技术。

优选地，所述作物Wx基因为水稻OsWx基因。所述水稻OsWx基因的起始密码子上游部分的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述水稻OsWx基因的起始密码子上游部分的靶点为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10或T11中的任意一种或几种的组合；所述靶点T1～T11的序列依次分别如SEQID NO.2～12所示。

更优选地，所述靶点为双靶点T1/T2、T3/T4、T5/T6、T7/T8、T9/T10或单靶点T11。

本发明研究发现：对上述靶点进行单敲除或组合敲除可获得Wx基因表达水平不同的突变系，进而得到直链淀粉含量不同的多个突变系，实现对作物直链淀粉含量的人为调控。比如，在经过CRISPR/Cas基因组编辑技术编辑的T2代纯合突变植株中，OsWx^a基因启动子调控区的双靶点(T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10)编辑，以及OsWx^a基因5’UTR调控区的单靶点(T11)编辑，都能有效的产生各种类型的缺失和插入突变体，得到多个突变系的直链淀粉含量低于25％(9％～20％)、且胚乳的胶稠度升高(50～85mm)的多个突变系。

利用所述方法能够快速培育出作物Wx基因表达水平改变的突变系，得到直链淀粉含量和/或胶稠度改变的变异系；因此，所述方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度、以及在培育优质水稻品系或品种中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种调控作物Wx基因表达水平的方法，选择作物Wx基因的起始密码子上游部分中的一个或多个靶点，利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因进行基因编辑。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用。本发明利用CRISPR/Cas基因组编辑技术对水稻OsWx基因进行表达调控，不同程度降低了水稻突变系的胚乳OsWx基因相对表达量。与野生型籼稻品种天丰B(种子直链淀粉含量约25％)相比，快速有效地获得了胚乳直链淀粉含量适度下降、胚乳胶稠度适度增加的水稻新品系；能够快速培育蒸煮和食味特性更好、以及适应工业需求的作物新品种，极大地满足不同人群的消费要求和工业的需求。

利用该方法获得了多种不同直链淀粉含量和胶稠度的突变系，大大丰富了作物的种质资源，且得到的突变系除了直接作为作物品种推广应用外，还可以作为育种亲本，育种时间短；因此，该方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度、以及培育优质水稻品系或品种中均具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是水稻OsWx^a基因结构、启动子及其调控区序列和CRISPR/Cas9靶点设计示意图；(A)图是水稻OsWx^a基因结构(省略了部分外显子/内含子)，其中，“Promotor”代表启动子，“5’UTR”代表5’端调控区，“3’UTR”代表3’端调控区，“Exon”代表外显子；(B)图是启动子及其调控区序列和CRISPR/Cas9靶点设计示意图，其中，下划线字符为靶点T1～T11(T11位于5’UTR调控区)，斜体字符(正义链为NGG，反义互补链为CCN)为靶点必需的前间区序列邻近基序(PAM)，小写字符为位于5’UTR调控区的第一内含子。

图2是对水稻OsWx^a基因的启动子调控区和5’UTR调控区进行双靶点组合和单靶点编辑的CRISPR/Cas9基因组编辑载体示意图；其中，“OsU6a”、“OsU6b”代表水稻小核RNA启动子；“sgRNA”代表单引导RNA；“P_ubi”代表玉米泛素强启动子；“NLS”代表核定位信号；“Cas9p”代表水稻密码子优化的Cas9蛋白；“Tnos”代表nos终止子；“2xP_35s”代表2倍35S启动子；“HPT”代表潮霉素筛选标记基因；“T_35S”代表35S终止子；“LB”代表左边序列；“RB”代表右边界序列；“Kan^R”代表卡拉霉素筛选标记；“pBR322ori”代表细菌复制子；“pVS1replicon”代表农杆菌复制子。

图3是水稻OsWx^a基因的启动子调控区和5’UTR调控区编辑部分突变系的靶点序列变异；其中，“Ref”代表野生型转化受体籼稻(天丰B)参考序列，“-”代表碱基缺失，“del”代表碱基缺失，“in”代表碱基插入，“sub”代表碱基替换。

图4是水稻突变系的胚乳胶稠度测定结果；其中，(A)图是水稻突变系的胚乳直链淀粉含量测定结果；(B)图是水稻突变系的胚乳胶稠度测定结果。

图5是水稻突变系的胚乳OsWx基因相对表达量检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

1、编辑靶点的设计

利用CRISPR/Cas基因组编辑在线工具软件包“CRISPR-GE”(http://skl.scau.edu.cn/)，以其中的子程序targetDesign在水稻OsWx基因的起始密码子上游部分(序列如SEQ ID NO.1所示)中选出11个靶点T1～T11(序列分别如SEQ ID NO.2～SEQ IDNO.12所示)；其中，水稻OsWx^a基因结构、启动子及其调控区序列和CRISPR/Cas9靶点设计示意图如图1所示。

2、CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

利用CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、含小RNA启动子OsU6a/OsU6b以及sgRNA的质粒载体pYLgRNA-OsU6a/OsU6b(Molecular Plant8:1274-1284,2015)，构建了6个含有不同靶点组合的基因组编辑载体，靶点组合为：T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11；其中，对水稻OsWx^a基因的启动子调控区和5’UTR调控区进行双靶点组合和单靶点编辑的CRISPR/Cas9基因组编辑载体示意图如图2所示。

基因组编辑载体构建的具体步骤为：

1)构建sgRNA表达盒的引物设计

利用CRISPR/Cas基因组编辑在线工具软件包“CRISPR-GE”(http://skl.scau.edu.cn/)，以其中的子程序primerDesign中的primerDesign-V分支程序，对选出的11个靶点T1～T11设计sgRNA表达盒构建引物OsU6aT1/gRT1～OsU6aT11/gRT11(序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.34所示，表1)。

表1 用于构建sgRNA表达盒的引物及其序列

2)不同sgRNA表达盒的Overlapping PCR拼接

通过两轮PCR，获得两侧具有Bsa I酶切位点的sgRNA表达盒，具体步骤为：

(1)第一轮PCR：利用表1所示的sgRNA表达盒构建引物OsU6aT1/gRT1～OsU6aT11/gRT11，将靶点序列分别引入到小RNA启动子OsU6a/OsU6b的下游和sgRNA序列的上游。

第一轮PCR的引物为U-F/gRNA-R，按照以下PCR体系和PCR程序，利用表2所示的U-F引物(序列如SEQ ID NO.35所示)分别与OsU6aT1/gRT1～OsU6aT11/gRT11引物配对，PCR扩增分别获得含靶点的启动子序列；利用表2所示的gRNA-R引物(序列如SEQ ID NO.36所示)分别与gRT1～gRT11引物配对，PCR扩增分别获得含靶点的sgRNA序列。

PCR体系为(15μL)：2×Phanta Max Buffer 7.5μL，10mM dNTPs Mix 0.35μL，Phanta Max Polymerase 0.25μL，pYLgRNA-OsU6a/OsU6b(含小RNA启动子OsU6a/OsU6b以及sgRNA质粒)3ng，10μM U-F 0.3μL，10μM引物OsU6aT1～OsU6aT11 0.2μL，10μM gRNA-R 0.4μL，10μM引物gRT1～gRT11 0.2μL，ddH₂O补足到15μL。

PCR程序为：预变性95℃1min，28个PCR循环(95℃10s，58℃15s，72℃20s)，延伸72℃1min。

表2 第一轮PCR的引物U-F/gRNA-R及其序列

(2)第二轮PCR：拼接小RNA启动子OsU6a/OsU6b驱动的RNA启动子OsU6a/OsU6b，并在PCR产物两侧引入Bsa I酶切位点。

按照以下PCR体系和PCR程序，各取1μL以上第一轮PCR获得的含相同靶点的小RNA启动子和sgRNA，稀释，混合，加8μLddH₂O稀释10倍；由于靶点组合为：T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11，因此，利用表3所示的第二轮PCR的引物Pps-R/Pgs-2(序列分别如SEQID NO.37～38所示)分别扩增含T1，T3，T5，T7，T9靶点的sgRNA表达盒；利用引物Pps-2/Pps-L(序列分别如SEQ ID NO.39～40所示)分别扩增含T2，T4，T6，T8，T10靶点的sgRNA表达盒；利用引物Pps-R/Pps-L(序列分别如SEQ ID NO.41～42所示)扩增含T11靶点的sgRNA表达盒。

PCR体系为(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15.0μL，10mM dNTPs Mix 0.5μL，Phanta Max Polymerase 0.5μL，混合稀释10倍的第一轮PCR产物1.0μL为模板，10μM引物Pps-R/Pgs-2，或引物Pps-2/Pps-L，或引物Pps-R/Pps-L 0.5μL，ddH₂O补足到30μL。

PCR程序为：预变性95℃1min，28个PCR循环(95℃10s，58℃15s，72℃20s)，延伸72℃1min。之后用琼脂凝胶电泳检测是否成功扩增。

然后，按照靶点组合T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11，混合双靶点的第二轮PCR产物，使用Genstar纯化试剂盒纯化PCR产物。

表3 第二轮PCR的引物及其序列

3)含不同靶点sgRNA表达盒的敲除载体的构建

采用基于Bsa I酶切位点的“金门”克隆方法(Golden Gate Cloning)，以“边切边连接”方式，按照靶点组合T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11将以上纯化后的5个双靶点和1个单靶点的sgRNA表达盒，“边切边连”组装到双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，分别获得基因组编辑载体T1T2、T3T4、T5T6、T7T8、T9T10和T11，如图2。

“边切边连接”反应体系为(15μL)：10×CutSmart Buffer 1.5μL，10mM ATP 1.5μL，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒90ng，纯化后的sgRNA表达盒25ng，Bsa I-HF10U，T4 DNAligase 35U，ddH₂O补足到15μL。

用PCR仪变温循环进行酶切连接反应，反应程序为：37℃10min，接着10～12循环(37℃5min，10℃3min，20℃5min)；最后37℃3min。

透析以上连接产物后，电激转化进入DH10B细胞，在卡那抗性(Kan)LB板上筛选，利用表3所示的引物SP-L1/SP-R1做菌落PCR，筛选阳性克隆，最终用表3所示的引物SP-L1和SP-L1测序确定含不同靶点sgRNA表达盒的敲除载体构建成功。

实施例2 CRISPR/Cas9基因组编辑载体转化水稻和突变系的测序分析

1、实验方法

把实施例1构建成功的CRISPR/Cas9基因组编辑载体T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11分别转化入农杆菌菌株EHA105后，分别转化籼稻品种天丰B(种子直链淀粉含量约25％)种子诱导的胚愈伤组织，获得T0转化水稻植株。

利用CRISPR/Cas基因组编辑在线工具软件包“CRISPR-GE”(http://skl.scau.edu.cn/)的子程序primerDesign中的primerDesign-A分支程序对T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10，T11编辑位点，在水稻基因组中设计6对扩增引物F-T1T2-CX/R-T1T2-CX～F-T11-CX/R-T11-CX(序列分别如SEQ ID NO.43～54所示，表4)，用于基因编辑靶点的PCR扩增与测序分析。

对以上获得的T0转化水稻植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模板，利用表4所示的引物Cas9-f/Cas9-r(序列分别如SEQ ID NO.55～56所示)筛选去除转基因阴性植株；对转基因阳性植株，利用表4所示的引物F-T1T2-CX/R-T1T2-CX～F-T11-CX/R-T11-CX分别PCR扩增T1T2，T3T4，T5T6，T7T8，T9T10，T11的基因组序列，并做Sanger测序；测序结果利用CRISPR/Cas基因组编辑在线工具软件包“CRISPR-GE”(http://skl.scau.edu.cn/)的子程序DSDecode自动解码分析突变类型。

用相同的方法分析T1和T2代转化水稻植株中纯合的突变植株。

表4 用于基因编辑靶点的PCR扩增与测序分析的引物

2、实验结果

水稻OsWx^a基因的启动子调控区和5’UTR调控区编辑部分突变系的靶点序列变异如图3所示，可以看出，在基因编辑的T2代纯合突变植株中，OsWx^a基因启动子调控区的双靶点(T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10)编辑，以及OsWx^a基因5’UTR调控区单靶点(T11)编辑，都能有效的产生各种类型的缺失和插入突变体；其中，单靶点T11编辑突变还涉及到位于5’UTR调控区的外显子-内含子剪接点附近碱基的突变，可能影响该内含子的剪接模式和效率。

实施例3 水稻突变系的胚乳直链淀粉含量和胶稠度测定

1、水稻突变系的胚乳直链淀粉含量测定

(1)实验方法

参考GB/T15683-1995国标法对纯合水稻突变系(T2)的直链淀粉含量进行测定，为了其能适应高通量操作，将方法中的材料和试剂按比例减少，参比样品购自中国水稻研究所。具体步骤为：

①称0.0100g米粉样品以及标样，每个样品3个重复，将米粉倒入25mL容量瓶；②移液枪加250μL95％乙醇，此时轻轻摇晃容量瓶，以防米粉沾在容量瓶的底部；③加2250μLNaOH(1M)，分三次加入，750μL/次，加3次；④将容量瓶置沸水浴中煮10分钟；⑤待容量瓶冷却后定容到25mL，盖上塞子，将溶液上下颠倒摇匀；⑥先往空的12mL离心管中加1mL的水，移出500μL样品：250μL/次，加2次；⑦再依次加100μL乙酸(1M)和加150μL碘-碘化钾，定容到10ml摇匀，反应15～20分钟；⑧以500μL 0.09M NaOH作为空白对照：250μL/次，加2次；⑨将反应结束的样品吸取300μL到酶标板，用酶标仪在620nm波长测量吸光值；⑩根据标准样品的吸光值和直链淀粉含量的关系，制作标准曲线，通过回归方程计算出所有测试样品的直链淀粉含量。3个重复之间的相对误差小于1％。

(2)实验结果

水稻突变系的胚乳直链淀粉含量测定结果如图4中的(A)图所示，可以看出，与野生型转化受体籼稻(天丰B)胚乳的高直链淀粉含量(约25％)相比，OsWx^a基因启动子调控区的双靶点(T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10)编辑突变系，能够有效地降低直链淀粉含量，产生直链淀粉含量为15％～25％的稳定的不同突变系；OsWx^a基因5’UTR调控区单靶点(T11)编辑突变系，也能够有效地降低直链淀粉含量，产生直链淀粉含量为10％～25％的稳定的不同突变系。

1、水稻突变系的胚乳胶稠度测定

(1)实验方法

参考GB/T 22294-2008《粮油检验大米胶稠度的测定方法》，对纯合水稻突变系(T2)的胚乳胶稠度进行测定。具体步骤为：

①用万分之一分析天平称取两份米粉样品，每份100mg于试管(规格为13mm×150mm)中；②用200ul移液枪量取200uL 0.025g/100mL麝香草酚蓝95％乙醇溶液，此时要轻摇动试管，使米粉充分分散(乙醇能防止碱糊化时的米胶结块；而麝香草酚蓝可以使碱性胶糊醒目，容易观测米胶的前沿)。③用1mL移液枪加入2.0mL 0.2mo1/L氢氧化钾溶液，将试管置于振荡器上使米粉充分混匀；④将混匀的米粉试管立即放入沸水浴中，用玻璃弹珠盖试管口，加热8min，控制试管在水浴过程中深度为试管高度的三分之一，三分之二在水面上，使试管内的米胶沸腾时到达的高度试管的三分之二为好。⑤取出试管，拿去玻璃弹子球，将试管冷却静置5～10min。⑥将试管放置于0℃左右的冰水混合浴中冷却20min；⑦将试管从冰浴中取出，立即将其水平放置在铺有坐标纸上，确保放在坐标纸的桌面水平，在室温(25±2℃)下静置1小时。⑧测量米胶流动长度，自管底量起至米胶前言的长度，以毫米为单位。误差要求：两个重复间硬胶稠度不超过3毫米，中等胶稠度不超过5毫米，软胶稠度不超过7毫米，求其平均数，即为胚乳胶稠度测定结果。

(2)实验结果

水稻突变系的胚乳胶稠度测定结果如图4中的(B)图所示，可以看出，与野生型转化受体籼稻(天丰B)胚乳的低胶稠度(约50mm)相比，OsWx^a基因启动子调控区的双靶点(T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10)编辑突变系，在有效地降低直链淀粉含量的同时，能够有效地增强胚乳的胶稠度，产生胚乳胶稠度为50～75mm的稳定的不同突变系；OsWx^a基因5’UTR调控区单靶点(T11)编辑突变系，在有效地降低直链淀粉含量的同时，也能够有效地增强胚乳的胶稠度，产生胚乳胶稠度为55～85mm的稳定的不同突变系。

从以上图4中水稻突变系的胚乳直链淀粉含量和胶稠度测定结果可以看出，OsWx^a基因启动子调控区和5’UTR调控区的基因编辑，能够快速有效地获得胚乳直链淀粉含量适度下降、胚乳胶稠度适度增加的水稻品系，使得籼稻蒸煮和食味特性更好。

实施例4 水稻突变系的胚乳OsWx基因表达水平检测

1、实验方法

利用qRT-PCR对纯合水稻突变系(T2)和野生型转化受体籼稻(天丰B)种子(授粉后10天)的OsWx内源基因的表达水平进行检测，具体步骤为：

把纯合水稻突变系(T2)和野生型对照授粉后10天的种子，液氮条件下研磨成粉，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用MMV逆转录试剂盒，oligoDT引物反转录为cDNA模板，对水稻的OsWx内源基因和OsActin 1基因(内参)进行qRT-PCR检测；按照以下qRT-PCR反应体系和qRT-PCR反应程序，用表5所示的引物F-Wx-qRT/R-Wx-qRT(序列分别如SEQ ID NO.57～58所示)检测OsWx内源基因的表达，用表5所示的引物F-Actin-qRT/R-Actin-qRT(序列分别如SEQ ID NO.59～60所示)检测OsActin 1基因的表达。

qRT-PCR反应体系为(20μL)：2×RealStar Green Fast Mixture 10μL，10μM引物F-Wx-qRT/R-Wx-qRT 0.5μL，或10μM引物F-Actin-qRT/R-Actin-qRT 0.5μL，cDNA模板35ng，ddH₂O补足到20μL。

qRT-PCR反应程序为：预变性95℃2min，40个PCR循环(95℃10s，58℃15s，72℃20s)，延伸72℃1min。

表5 qRT-PCR反应所用的引物及其序列

2、实验结果

水稻突变系的胚乳OsWx基因相对表达量检测结果如图5所示，可以看出，与野生型转化受体籼稻(天丰B)相比，OsWx^a基因启动子调控区的双靶点(T1/T2，T3/T4，T5/T6，T7/T8，T9/T10)编辑突变系，能够有效地使得OsWx基因相对表达量不同程度降低，最高能够降低4.33倍；OsWx^a基因5’UTR调控区单靶点(T11)编辑突变系，也能够有效地使得OsWx基因相对表达量不同程度降低，最高能够降低9.23倍。

以上结果表明：OsWx^a基因启动子调控区和OsWx^a基因5’UTR调控区的基因编辑，能够有效地使水稻突变系的胚乳OsWx基因相对表达量有不同程度的降低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccatgagct gattgcctga ttagacggta agaatgcatc cctgagaagc aaatgcatca 60

ccaaatttgt agcttagata aatgctgtga cctgcaagaa aataaaatta aaatcaaaat 120

aaaagaaaag cgcaggtaat tgacacccca cgcatacaag tgtagatgca taacacgttc 180

atctaatcat cttaattaga cttaggtaaa actacaatga ggtttatgtc ctacggaatg 240

acgataagct agcagcacag aggcacagat catatcgtct ccagactcaa gtgcacgttg 300

atcattcgct cactgcttca tcgatcatcc ctttgtcgag gcgttagttg gcaggcacta 360

atagctacag taaagtaaag agcaacgtgc caacgtacgc acgctaacgt gagtcatgta 420

gcgtaattcc aagttctttt ttttttgtca gcacgtacaa gcagccgcta gcctcgccct 480

gcatgagaag ctcgcggcgc gccaccaaac tggcaggcac tcagctcgct gctggtcccg 540

cacgtcgcca cacgatcgac gtacgcacgc gagcgagatc caccgatggt ttacgcgtac 600

gccgacggct cacacatccc ccggtgccca acagaaacca cacaccaccc gcacgaaaaa 660

aaccgaaccg cacgtgcgcg cgcgctccac gcacacccaa aacagacggc acggcgggag 720

cgcgcgcgcg cacgcgagcc gaggagaaaa caaacggggg aaacaagctg gaaaagcaaa 780

aggggaaaag aacggagcgg aggcttcacc cacggccacc gcgacgcgcc accagcgtgc 840

ggtgcaatgc aacgtacgcc aagccgaaac ggcaggcagc atcgcgcacg cacgcacaca 900

caggccacag cacacgcgag cgacgtacgc gagtgcatgc agatgcatgc gcggggctcg 960

cgcgagaccg gccgatgggt tcgcttctct tctctctccc gtcccgttgc gtcgtcatgg 1020

acaaaagtcg gttttgcttt tggttttttg gttctgaggc actgacgtgc gggccagcgt 1080

acgcctgcgt gccccgcatg tcatcgtcga caccggccgg ggaccgggta aaatgtgttg 1140

cgggagggag agggggagag agagatcgcg cgggcttcac gcaacggcgc tacaaatagc 1200

cacccacacc accaccccct ctctcaccat tccttcagtt ctttgtctat ctcaagacac 1260

aaataactgc agtctctctc tctctctctc tctctgcttc acttctctgc ttgtgttgtt 1320

ctgttgttca tcaggaagaa catctgcaag gtatacatat atgtttataa ttctttgttt 1380

cccctcttat tcagatcgat cacatgcatc tttcattgct cgtttttcct tacaaatagt 1440

ctcatacatg ctaatttctg taaggtgttg ggctggaaat taattaatta attaattaat 1500

tgacttgcca agatccatat atatgtcctg atattaaatc ttcgttcgtt atgtttggtt 1560

aggctgatcg atgttattct agagtctaga gaaacatacc caggggtttt ccagctagct 1620

ccacaagatg gtgggctagc tgacctagat ttaagtctca ctctttctaa ttatttgata 1680

ttagatcatt ttctaatatt tgcgtctttt tttattctag agtctagatc ttgtgttcaa 1740

ctctcgttaa atcatgtctc tcgccactgg agaaacagat caggagggtt tattttgggt 1800

ataggtcaaa gctaagattg aaattcacaa atagtaaaat cagaatccaa ccaattttag 1860

tagccgagtt ggtcaaagga aaatgtatat agctagattt attgttttgg caaaaaaaaa 1920

tctgaatatg caaaatactt gtatatcttt gtattaagaa gatgaaaata agtagcagaa 1980

aattaaaaaa tggattatat ttcctgggct aaaagaattg ttgatttggc acaattaaat 2040

tcagtgtcaa ggctttgtgc aagaattcag tgtgaaggaa tagattctct tcaaaacaat 2100

ttaatcattc atctgatctg ctcaaagctc tgtgcatctc cgggtgcaac ggccaggata 2160

tttattgtgc agtaaaaaaa tgtcatatcc cctagccacc caagaaactg ctccttaagt 2220

ccttataagc acatatggca ttgtaatata tatgtttgag ttttagcgac aattttttta 2280

aaaacttttg gtccttttta tgaacgtttt aagtttcact gtcttttttt ttcgaatttt 2340

aaatgtagct tcaaattcta atccccaatc caaattgtaa taaacttcaa ttctcctaat 2400

taacatctta attcatttat ttgaaaacca gttcaaattc ttttaggctc accaaacctt 2460

aaacaattca attcagtgca gagatcttcc acagcaacag ctagacaacc accatgtcgg 2520

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgagaagc aaatgcatca cca 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgataagct agcagcacag agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaacgtacg cacgctaacg tga 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgcacgtgc gcgcgcgctc cac 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccgaggaga aaacaaacgg ggg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacgtacgc caagccgaaa cgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgatgggtt cgcttctctt ctc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggttctgagg cactgacgtg cgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcgcgcggg cttcacgcaa cgg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctctctcac cattccttca gtt 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catcaggaag aacatctgca agg 23

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagaagcaaa tgcatcacca cggcagccaa gccagca 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggtgatgca tttgcttctc gttttagagc tagaaat 37

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgtgctgct agcttatcgt caacacaagc ggcagc 36

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgataagct agcagcacag gttttagagc tagaaat 37

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgtacgcac gctaacgtga cggcagccaa gccagca 37

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcacgttagc gtgcgtacgt gttttagagc tagaaa 36

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cacgtgcgcg cgcgctccac aacacaagcg gcagc 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggagcgcgc gcgcacgtgg ttttagagct agaaa 35

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgtttgttt tctcctcggc ggcagccaag ccagca 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccgaggagaa aacaaacggg ttttagagct agaaat 36

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tttcggcttg gcgtacgttg caacacaagc ggcagc 36

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caacgtacgc caagccgaaa gttttagagc tagaaat 37

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgggttcgc ttctcttctc ggcagccaag ccagc 35

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agaagagaag cgaacccatg ttttagagct agaaat 36

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cacgtcagtg cctcagaacc aacacaagcg gcagc 35

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gttctgaggc actgacgtgg ttttagagct agaaat 36

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttgcgtgaag cccgcgcgat cggcagccaa gccagca 37

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atcgcgcggg cttcacgcaa gttttagagc tagaaat 37

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctctcaccat tccttcagtt caacacaagc ggcagc 36

<210> 32

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aactgaagga atggtgagag gttttagagc tagaaat 37

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgcagatgtt cttcctgatg cggcagccaa gccagca 37

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

catcaggaag aacatctgca gttttagagc tagaaat 37

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcagaggtc tctaccgact agtcacgcgt atggaatcgg cagcaaa 47

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agcgtgggtc tcgctcgacg cgtatccatc cactccaagc 40

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tgcaataact tcgtataggc t 21

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ctaatttcaa gtccagccca gc 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gaattacgct acatgactca cg 22

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ccacgcatat aagtgtagat ac 22

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ctgcctgccg tttcggcttg g 21

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gtacgcacgc gagcgagatc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccatgacgac gcaacgggac 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gaacggagcg gaggcttcac c 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gtgtcttgag atagacaaag 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

agatgcatgc gcggggctcg 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

cagaaattag catgtatgag 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gcatgtcatc gtcgacaccg 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

agctagctgg aaaacccctg 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ctgacgctaa cctcgacaag 20

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ccgatctagt aacatagatg acacc 25

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

catcggcagg ctggaggaac 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

catgatgaga tgagcaagcg 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gcatctctca gcacattcca 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

accacaggta gcaataggta 20