植物转基因筛选载体pCALSm1及其应用
阅读说明：本技术 植物转基因筛选载体pCALSm1及其应用 (Plant transgenic screening vector pCALSm1 and application thereof ) 是由 欧阳超 安保光 陈思兰 赵惠敏 李丹 龙湍 吴永忠 黄培劲 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体涉及植物转基因筛选载体pCALSm1及其应用。本发明提供的植物遗传转化筛选载体利用包含水稻乙酰乳酸合成酶突变基因的表达盒作为筛选标记,在愈伤组织筛选阶段使用嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂作为筛选剂,所获得的转基因植株具备对嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂的高抗性。该载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用,在转基因过程中利用植物内源基因,不引入菌源等外源筛选标记基因,不仅丰富了植物转基因筛选方法,还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物的担忧,有利于转基因植物的商业化应用,市场价值和社会效益均良好。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to a plant transgenic screening vector pCALSm1 and application thereof. The plant genetic transformation screening vector provided by the invention uses an expression cassette containing a rice acetolactate synthase mutant gene as a screening marker, and herbicides such as pyrimidinylsalicylic acid and imidazolinone are used as screening agents in a callus screening stage, so that the obtained transgenic plant has high resistance to the herbicides such as pyrimidinylsalicylic acid and imidazolinone. The vector can be used as a transgenic screening vector with other additional functional elements, plant endogenous genes are utilized in the transgenic process, exogenous screening marker genes such as bacterial sources and the like are not introduced, the transgenic screening method of the plant is enriched, potential safety risks of the transgenic plant caused by the exogenous genes and public concerns about the transgenic plant can be effectively reduced, the commercial application of the transgenic plant is facilitated, and the market value and the social benefit are good.)
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物转基因筛选表达盒、含有该表达盒的植物转基因筛选载体及其应用。
背景技术
随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展，转基因技术的应用范围越来越广泛。转基因技术具有诸多的优点，如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作物于1996年被批准商业化种植，截至2017年，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计，2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物，面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。
目前，随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险，其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风险和担忧。
乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-Estrella L,BlockM D,M essens E,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plantcells.The EM BO Journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物中没有该酶，故可通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成，进而达到清除植物杂草的目的，而且对人畜无害。目前，已针对该酶研发和应用多种除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂等。ALS氨基酸序列中某个位点的突变，可使得ALS蛋白结构发生改变，导致ALS抑制剂无法结合ALS，使得ALS对除草剂的敏感性降低，从而对相关除草剂产生抗性(Tan S,Evans RR,Dahm er M L,et al.Imidazolinone-tolerant crops：history,currentstatus and future.Pest Management Science,2005,61(3)：246-257；Duggleby RG,McCourt JA,Guddat LW.Structure and mechanism of inhibition of plantacetohydroxyacid synthase.Plant Physiology and Biochemistry,2008,46(3)：309-324；Lee H,Rustgi S,Kumar N,et al.Single nucleotide mutation in the barleyacetohydroxy acid synthase(AH AS)gene confers resistance to imidazolinoneherbicides.Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(21)：8909.)。
发明内容
本发明的目的是为解决目前基因遗传转化中因使用外源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题，提供一种利用植物内源基因作为筛选标记应用于植物遗传转化筛选的载体。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种植物转基因筛选表达盒，其以植物内源基因作为筛选标记，所述植物内源基因为ALS突变基因。
优选地，所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因。
更优选地，所述水稻ALS突变基因(ALSm1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明发现，序列如SEQ ID NO.1所示的ALS突变基因更适于作为筛选标记，在植物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能。
所述植物转基因筛选表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动子和终止子。
所述启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子。
其中，所述植物组成型启动子可为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子可为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。
优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子。
所述终止子可为在植物中可以终止基因转录的DNA序列，包括水稻ALS基因终止子、Ubi终止子等。
优选地，所述终止子为水稻Ubi终止子。
本发明发现，采用水稻ALS基因启动子和Ubi终止子配合调控水稻ALS突变基因的转录，能够更好地控制ALS突变基因的高效、稳定、适度表达，使得ALS基因突变体更好地发挥筛选标记的功能。
作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供所述ALS突变基因在作为植物遗传转化的筛选标记中的应用。
基于上述植物转基因筛选表达盒，本发明进一步提供一种植物遗传转化筛选载体，该载体含有上述的植物转基因筛选表达盒。
优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化；所述其他表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。
更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、HindIII等，以便后续克隆目的基因进入。
作为本发明的优选方案，本发明提供的植物遗传转化筛选载体为pCALSm1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到：
(1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.1所示的ALS突变基因置于该基因自身启动子ALSpro驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如SEQ ID NO.2所示的植物转基因筛选表达盒；
(2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310，获得植物遗传转化筛选载体。
本发明还提供所述植物转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化、制备转基因植物或使得植物具备除草剂高抗性中的应用。
本发明所述除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂。所述的应用具体为：将植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段将愈伤组织接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。
所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。
优选地，所述筛选培养基中，含有0.25～1μmol/L双草醚、200～1000μg/L灭草烟或300～1000μg/L咪唑乙烟酸。
所述筛选培养基中，优选含有0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选地，含有0.4μmol/L双草醚可获得良好的筛选效率；或优选含有200-500μg/L灭草烟，更优选地，含有250-300μg/L灭草烟可获得良好的筛选效率；或优选含有300-500μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有400-500μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的筛选效率。
进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的分化阶段，将从筛选培养基中得到的阳性愈伤采用含有除草剂的分化培养基进行分化培养。
所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。
优选地，所述分化培养基中，含有0.05-1μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸。
所述分化培养基中，优选含有0.05-0.25μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双草醚可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的分化效率，同时有效抑制非转基因愈伤分化成苗。
进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的生根阶段，将分化培养得到的阳性苗采用含除草剂的生根培养基进行生根培养。
所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。
优选地，所述生根培养基中，含有0.05-10μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸。
所述生根培养基中，优选含有0.05-5μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双草醚可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的生根效率，同时有效抑制非转基因分化苗生根。
本发明所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。
以水稻为例，其他植物转基因方法可参考水稻：
1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30-50天；
2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；
3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；
4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；
5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗；
6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；
以上所涉培养基的具体配方如下：
诱导培养基为N6D培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；
悬浮培养基为N6-AA培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为5.4的培养基；
共培养基为N6-AS培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉(Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基；
筛选培养基为N6S培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L。筛选培养基中筛选剂双草醚浓度为0.25-1μmol/L，或灭草烟浓度为200-1000μg/L，或咪唑乙烟酸浓度为300-1000μg/L，pH值为5.8的培养基；
分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。分化培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-1μmol/L、或灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.9的培养基；
生根培养基为1/2MSR培养基，其为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。生根培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-10μmol/L、灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.8的培养基；
本发明的有益效果至少包括：本发明提供了利用水稻ALS突变基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体以及相应的基因转化筛选方法。本发明的植物遗传转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物基因转化。本发明的筛选标记为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。
附图说明
图1为本发明实施例1中pCALSm1载体经NcoI和PstI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为未酶切的pCALSm1重组质粒，1-5为酶切的pCALSm1重组质粒，可切出大小约为2.2kb片段。
图2为本发明实施例2中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为pCALSm1重组质粒阳性对照，2-6为转pCALSm1重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。
图3为本发明实施例1中pC0310载体图谱。
图4为本发明实施例1中pCALSm1载体图谱。
图5为本发明实施例3中普通水稻苗期双草醚临界浓度测试比较图；其中，苗盆左侧为9311，右侧为ZH11，其中，0代表未添加双草醚，10×代表300mg/L，20×为600mg/L。
图6为本发明实施例3中普通水稻苗期灭草烟临界浓度测试图；其中，0.2×代表19.6mg/L，0.5×，1×，2×，5×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。
图7为本发明实施例3中普通水稻苗期咪唑乙烟酸临界浓度测试；其中，5×代表375mg/L，20×，50×，100×，300×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。
图8为本发明实施例4中水稻愈伤对双草醚抗性临界浓度测试结果；其中，N6为愈伤在不添加筛选压的培养上筛选40d结果，N6+分别为添加0.25、0.5、1及2μmol/L双草醚筛选压。
图9为本发明实施例8中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。
图10为本发明实施例14、20和28中分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸分化愈伤组织30d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的分化培养，3和4为添加灭草烟(50μg/L)的分化培养，5和6为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的分化培养；其中，1、3、5为非转基因愈伤进行分化，2、4、6为转基因阳性愈伤进行分化。
图11为本发明实施例37、47和55中生根培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸生根15d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的生根培养，3和4为添加灭草烟(50μg/L)的生根培养，5和6分为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的生根培养；其中，1、3、5为非转基因分化苗进行生根，2、4、6为转基因阳性分化苗进行生根。
图12为本发明实施例63中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为H2O、2为ZH11非转基因植株基因组DNA，3为质粒阳性对照，5-24为筛选获得的转基因植株基因组DNA。
图13为本发明实施例64中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：双草醚筛选株系移栽后喷施60mg/m2双草醚结果；a-d分别为喷施前，喷施后7天、14天、21天，图中箭头表示野生型对照ZH11，在喷施14天时已完全死亡；e和f：灭草烟筛选株系移栽后喷施0.5×(49mg/L)灭草烟，e：喷施前，f：喷施21天后；g-h：咪唑乙烟酸筛选株系后，喷施5×(375mg/L)咪唑乙烟酸，g：喷施前，h：喷施21天后；其中，ZH11为野生型对照，9311及MH63均为普通栽培稻对照，47-1、48-2、61-1和63-1均为转基因株系。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1植物遗传转化筛选载体的构建
1、植物转基因筛选表达盒的制备
本发明的植物转基因筛选表达盒OsALSP-ALSm1-OsUbiT的构建方法如下：
设计引物0310-AAU-F/0310-AAU-Rv1从水稻基因组中扩增启动子OsALSP片段；利用引物0310-AAU-F2/0310-AAU-Rv2从合成的水稻ALS突变基因(ALSm1)片段中扩增获得目的基因ALSm1片段；利用引物0310-AAU-F3/0310-AAU-Rv从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。其中，引物0310-AAU-F和0310-AAU-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-AAU-Rv1与0310-AAU-F2，0310-AAU-Rv2与0310-AAU-F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。
上述引物序列如下：
0310-AAU-F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggCGTAAAGTCTTCACTCCTCCCCC(SEQID NO.4)；
0310-AAU-Rv1：CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG(SEQ ID NO.5)；
0310-AAU-F2：CACCCACCATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.6)；
0310-AAU-Rv2：GGCTGAGGACAGGCCTTTAATACACAGTCCTGCCATCA(SEQ ID NO.7)；
0310-AAU-F3：ATTAAAGGCCTGTCCTCAGCCATAGAGCTG(SEQ ID NO.8)；
0310-AAU-Rv:TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ IDNO.9)。
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。
引物0310-AAU-F和0310-AAU-Rv1扩增的PCR产物为OsALSP片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为2180bp产物；引物0310-AAU-F2和0310-AAU-Rv2扩增的PCR产物为ALSm1片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1941bp；引物0310-AAU-F3和0310-AAU-Rv扩增的PCR产物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。
2、植物遗传转化筛选载体的构建
使用Gibson Assembly方法，将上述1中的扩增产物插入到pC0310载体(pC0310为发明人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物时降低公众对转基因担忧，载体图谱见图3)BstXI和PstI双酶切位点间，具体方法如下：
(1)用BstXI+PstI对载体质粒pC0310进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A. Extraction kit(Omega,下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0310线性片段。
BstXI+PstI双酶切反应体系如下：
(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒连接OsALSP-ALSm1-OsUbiT表达盒到pC0310载体上，连接体系如下：
连接程序：50℃，30min。
(3)转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(如图1)，保菌并送测序。命名为pCALSm1，载体图谱见图4，测序得到其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
引物序列：
0310-F2:GGGCCATACTTGTTGGATATCAT(SEQ ID NO.10)；
0310-R2:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.11)。
实施例2农杆菌转化及鉴定
取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例1中得到的测序正确pCALSm1质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)进行菌液PCR验证(如图2)，可扩增得到约900bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。
实施例3普通水稻苗期双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸的临界浓度测试
双草醚是稻田用除草剂，普通水稻对其具有抗性，因此在水稻上喷施药剂规定浓度的除草剂不会对水稻造成伤害，多数喷施安全浓度在30mg/L；灭草烟是一种非选择性灭生性除草剂，普通水稻对其不具抗性，多数推荐喷施浓度为95-98mg/L；咪唑乙烟酸属咪唑啉酮类除草剂，主要用于豆科作物防除禾本科杂草及阔叶杂草，具有选择性强、杀草谱广及活性高等优点，推荐浓度为75mg/L，普通水稻对其抗性较弱。
本实施例分析水稻对双草醚、灭草烟和咪唑乙烟酸抗性的临界浓度，通过实验测试，结果如图5、图6和图7所示。对于双草醚，无论是粳稻中花11(ZH11)还是籼稻9311，在苗期喷施20×(600mg/L)浓度以上均枯萎死亡，所以可选600mg/L作为临界浓度；对于灭草烟，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施0.5×(49mg/L)浓度以上均枯萎死亡，所以可选0.5×(49mg/L)作为临界浓度；对于咪唑乙烟酸，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施5×(375mg/L)浓度以上均枯萎死亡，所以可选5×(375mg/L)作为临界浓度。
实施例4愈伤时期ZH11双草醚的筛选压力测试
本实施例研究愈伤时期ZH11对双草醚抗性的临界浓度，通过测试，结果如图8所示。对于双草醚，在N6培养基上添加0.25μmol/L以上就使愈伤增殖受到抑制。
实施例5双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(1)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.6μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。
实施例6双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(2)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.8g/L+Pro0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.25μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。
实施例7双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(3)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.3μmol/L)上，30℃暗培养30-50d。
实施例8双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(4)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.4μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤(如图9)。
实施例9双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(5)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.8g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.5μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。
实施例10双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(6)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.8μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。
实施例11双草醚-pCALSm1遗传转化体系——筛选(7)
以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚1μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。
实施例12 pCALSm1遗传转化体系——筛选统计
通过实施例5-11中利用不同浓度的双草醚进行筛选的阳性率比较发现(见表1)，筛选培养基中添加0.3-0.4μmol/L双草醚，均可得到超过40％的阳性愈伤，添加低浓度的筛选压都会使阳性愈伤率降低，高浓度的筛选压也会使阳性愈伤率降低，推测是由于随筛选压浓度升高导致愈伤完全被抑制而无法获得阳性愈伤。因此在筛选培养基中优选添加0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选添加0.4μmol/L双草醚可获得良好的筛选效率。
表1不同浓度双草醚的筛选结果统计
实施例13双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(1)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.05μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例14双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(2)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.1μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。
实施例15双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(3)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.25μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例16双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(4)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.5μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例17双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(5)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.8μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例18双草醚-pCALSm1遗传转化体系——分化(6)
将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚1μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例19灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(1)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟25μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例20灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(2)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟50μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。
实施例21灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(3)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟100μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例22灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(4)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟250μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例23灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(5)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟375μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例24灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(6)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟500μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例25灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(7)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟800μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例26灭草烟-pCALSm1遗传转化体系——分化(8)
将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟1000μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例27咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(1)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸25μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例28咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(2)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸50μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。
实施例29咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(3)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸100μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例30咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(4)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸250μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例31咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(5)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸375μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例32咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(6)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸500μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例33咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(7)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸800μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例34咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系——分化(8)
将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸1000μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。
实施例35 pCALSm1遗传转化体系——分化统计
通过实施例13-18、19-26及27-34中添加不同浓度的双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸进行分化培养的出苗率比较发现(见表2、表3及表4)，分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸均可抑制ZH11的愈伤分化，而转基因阳性愈伤的有较高的分化率。因此在分化培养基中优选添加0.05-0.25μmol/L双草醚、30-100μg/L灭草烟或30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选添加0.1μmol/L双草醚、50μg/L灭草烟或50μg/L咪唑乙烟酸在抑制非转基因时可获得良好的分化效率。
表2不同浓度双草醚分化结果统计
表3不同浓度灭草烟分化结果统计
表4不同浓度咪唑乙烟酸分化结果统计
表2、3、4中MSRe代表未添加筛选剂的分化培养基，培养基成分见发明内容部分；BS代表双草醚，BS0.05代表添加双草醚0.05μmol/L。
实施例36双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(1)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.05μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例37双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(2)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.1μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。
实施例38双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(3)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.2μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例39双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(4)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.3μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例40双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(5)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.4μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例41双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(6)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.5μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例42双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(7)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚1μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例43双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(8)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚3μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例44双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(9)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚5μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例45双草醚-pCALSm1遗传转化体系——生根(10)
经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚10μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例46灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(1)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟25μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例47灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(2)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟50μg/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。
实施例48灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(3)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟100μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例49灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(4)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟250μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例50灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(5)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟375μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例51灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(6)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟500μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例52灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(7)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟625μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例53灭草烟-pCALSm1遗传转化体系-生根(8)
经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟1000μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例54咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(1)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸25μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例55咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(2)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸50μg/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。
实施例56咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(3)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸100μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例57咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(4)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸250μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例58咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(5)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸375μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例59咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(6)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸500μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例60咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(7)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸625μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例61咪唑乙烟酸-pCALSm1遗传转化体系-生根(8)
经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸1000μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。
实施例62pCALSm1遗传转化体系——生根统计
通过实施例36-45、46-53及54-61中添加不同浓度的双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸进行生根培养的生根存活率比较发现(见表5、表6及表7)，生根培养基中添加0.05-10μmol/L双草醚或25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸，均可抑制ZH11的分化苗存活，而大部分转基因阳性分化苗存活率还分别达到80％以上。根据分析结果，在生根培养基中优选添加0.05-5μmol/L双草醚、50-100μg/L灭草烟或50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选添加0.1μmol/L双草醚、50μg/L灭草烟或50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的生根存活效率。
表5不同浓度双草醚生根结果统计
表6不同浓度灭草烟生根结果统计
表7不同浓度咪唑乙烟酸生根结果统计
实施例63转基因株系鉴定
为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。
首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解DNA。
为了区分水稻内源基因，设计一对引物(0310-F3/0310-R3)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因表达盒为模板扩增获得片段大小为875bp。
引物序列如下：
0310-F3:TGCTTCTGTGGCTAACCCAGGT(SEQ ID NO.12)；
0310-R3:AGGCGGGAAACGACAATCTAAG(SEQ ID NO.13)。
以转化用质粒DNA作为阳性对照，ZH11基因组DNA作为阴性对照。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。
PCR反应体系如下：
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图12所示。电泳结果表明，大部分转基因样品中含有875bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而阴性对照ZH11无法扩出条带。
实施例64抗性表型鉴定
选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施60mg/m2双草醚(图13的a，b)。喷施后3-7天，野生型出现叶片枯黄。7天后，野生型对照ZH11已枯黄致死，转基因株系多数植株生长正常，部分出现黄化。14天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已完全死亡，存活株系为双草醚抗性株系(图13的c，d)。
选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施49mg/L灭草烟(图13的e)，21天后，野生型对照ZH11、9311或MH63出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为灭草烟抗性株系(图13的f)。
选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施375mg/L咪唑乙烟酸(图13的g)，21天后，野生型对照ZH11、9311或MH63出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为咪唑乙烟酸抗性株系(图13的h)。
上述结果表明，通过筛选获得的转基因株系高抗双草醚，同时也高抗灭草烟、咪唑乙烟酸。上述三种除草剂仅为所属除草剂类别的代表，获得的转基因株系不仅具备这三种除草剂的高抗性，还具备其他磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类除草剂如氯磺隆、灭草喹等的高抗性。
上述结果表明，本申请已成功建立基于双草醚/灭草烟/咪唑乙烟酸-ALSm1筛选标记的遗传转化全时期筛选系统，可用于水稻遗传转化。
本发明获得的pCALSm1作为植物双元表达载体，可以通过克隆其他表达盒进入该载体，进行遗传转化，获得相应的性状。如：将荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒、其他功能基因等。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 植物转基因筛选载体pCALSm1及其应用
<130> KHP191114025.4
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1935
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60
ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120
gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180
ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240
ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccag gcggcgcgtc gatggagatc 300
caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360
gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420
acctccggcc ccggcgcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480
gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540
caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600
gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660
cctggcccgg tgctggtgga catccccaag gacatccagc agcagatggc cgtgccggtc 720
tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780
gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840
ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt ttgttgagct gactggtatc 900
ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgacgaccc gttgtccctg 960
cggatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg ccgtggataa ggctgacctg 1020
ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080
agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag agattggaaa gaacaagcaa 1140
ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag ctcgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200
caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260
cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320
gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa tcatcgctac tggtgttggg 1380
cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440
tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgccg cagctggtgc ttctgtggct 1500
aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560
gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620
catttgggta tggtggtgca attggaggat aggttttaca aggcgaatag ggcgcataca 1680
tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaag 1740
gggttcaata ttccggcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800
aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccgca ccaggagcat 1860
gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920
aggactgtgt attaa 1935
<210> 2
<211> 4431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtaaagtct tcactcctcc ccctttctct ctagttagcg gagacatgac aaccagtcat 60
ccgattaggt ttatagtggc attgcaagca gtcagcaaat gaataaatga aagaggcaat 120
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gacaataagt taacaagaaa taaatttaaa gtactaaaca caataagcca attagcatgg 540
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tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat atatcatggg tgtaccgcca 840
atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa aatataaatg cactatgctc 900
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tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc aaatattgca atgcaaacct 1020
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cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata ttctttttag tagctcacag 1140
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tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat gttgttccta caaataaaaa 1260
tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt tctagggttt aaccataagt 1320
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gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat cttaaacagc actaaaataa 1440
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ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa ggagaaagag atacggggta 1560
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gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg gagggcgtct tcaccgcccc 1740
gccgccgccg ccaccgccgc cgccgcccga gccggacttc tcgccgccac tgctcatctt 1800
gcgctgcgtt tgtgcgggtg cgggtgcggg tgctagactg ctaggtctcg cggttgcatc 1860
cgcatccgac tttgagatcg attttttatc gggttctgta ccctccaccc gttattggga 1920
ctgacccacc tgtcatcctc atccaatcga ctgacacgcg ggcccagatc gaccccgacg 1980
tggctgtgtg tcatcctatc ccaccgacat atggggccca ctgtgacgtg gccccacacg 2040
atcccatccg agccacacat cgcctcacgc tgcgtcaccg cgcgcggaca aaacacccac 2100
acccccacac tctccacccc tctctccctc tcgcccaaac ccagaaaccc tcgccgccgc 2160
cgccgccgcc accacccacc atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg 2220
ccgccgcgac ggccaagacc ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc 2280
gaggccgggt gggggcggcg gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt 2340
ccccggcgcc gccggccacg ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg 2400
cggacatcct cgtggaggcg ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccag 2460
gcggcgcgtc gatggagatc caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc 2520
tcttccgcca cgagcagggc gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc 2580
gcgtcggggt ctgcgtcgcc acctccggcc ccggcgcaac caacctcgtg tccgcgctcg 2640
ccgacgcgct gctcgactcc gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca 2700
tgatcggcac cgacgccttc caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca 2760
agcacaatta ccttgtcctt gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct 2820
tcctcgcgtc ctcgggccgt cctggcccgg tgctggtgga catccccaag gacatccagc 2880
agcagatggc cgtgccggtc tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc 2940
tgcccaagcc acccgcgaca gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac 3000
ggcgcccgat tctctatgtc ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt 3060
ttgttgagct gactggtatc ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca 3120
gtgacgaccc gttgtccctg cggatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg 3180
ccgtggataa ggctgacctg ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag 3240
ggaaaattga ggcttttgca agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag 3300
agattggaaa gaacaagcaa ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag ctcgctttac 3360
agggcttgaa tgctctgcta caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat 3420
ggcacaatga gttggaccag cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg 3480
aagagatccc accgcaatat gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa 3540
tcatcgctac tggtgttggg cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc 3600
ggccacggca gtggctgtct tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgccg 3660
cagctggtgc ttctgtggct aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta 3720
gcttcctcat gaacattcag gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg 3780
tgatggtgtt gaacaaccaa catttgggta tggtggtgca attggaggat aggttttaca 3840
aggcgaatag ggcgcataca tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag 3900
attttgtgac tattgctaag gggttcaata ttccggcagt ccgtgtaaca aagaagagtg 3960
aagtccgtgc cgccatcaag aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca 4020
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<210> 3
<211> 10933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcaggccc gggcagcgct gaagaacttc cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg 60
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aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 180
agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 240
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gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 420
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ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 1860
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caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 2040
gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 2100
agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 2160
caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 2220
gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 2280
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tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 2400
ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 2460
gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 2520
ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 2580
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gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 2700
ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 2760
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tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3960
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ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 4080
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attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4320
taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4380
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4440
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