阅读说明：本技术 一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统 (Carrier system for methylation/demethylation of rice epigenome ) 是由 谷晓峰 胡桂花 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统。本发明提供了一套用于水稻表观基因组去甲基化的载体系统。该系统通过随机去甲基化水稻基因组来快速产生DNA甲基化变异。该系统涉及水稻OsALKBH DNA 6mA去甲基化酶的表达,导致广泛的低甲基化。该“诱变”技术对于具有重要农业意义的植物,可能导致通常由DNA甲基化沉默的等位基因的差异表达,从而揭示先前隐藏的表型变异的应用具有重要意义。(The invention discloses a set of carrier system for methylation/demethylation of rice epigenome. The invention provides a set of carrier system for rice epigenome demethylation. The system rapidly generates DNA methylation variation by randomly demethylating the rice genome. The system involves expression of rice OsALKBH DNA6mA demethylase, resulting in extensive hypomethylation. This "mutagenesis" technique is of great importance to the use of plants of agronomic importance, possibly resulting in differential expression of alleles that are normally silenced by DNA methylation, thereby revealing previously hidden phenotypic variations.)

一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统

技术领域

本发明涉及基因定向表达线路合成技术领域，具体涉及一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统。

背景技术

基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段。随着基因编辑工具锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEs)以及CRISPR/Cas9系统的开发利用，靶定和修饰特异的基因组序列来研究相关基因功能的条件已经变得非常成熟。越来越多的研究将基因编辑工具用于表观遗传修饰以及基因调控。

水稻是世界上主要的粮食作物之一，也是功能基因组研究的模式植物。基于水稻基因组的研究已经相对成熟，然而，可能引起水稻表型强烈变化的表观修饰研究还处于起步阶段。

DNA甲基化对于基因调控、转座沉默及基因印记都十分重要。尽管特异DNA甲基化模式的产生对于这些进程非常重要，然而在每个位点上甲基化是如何被调控的还不清楚。已有研究发现，植物基因启动子DNA甲基化有时会导致转录抑制，甲基转移酶突变体DNA甲基化缺失导致基因表达改变和严重发育缺陷。然而，许多情况下自然发生的DNA甲基化变异已经被报道，由此改变表达的差异甲基化基因是负责农学上的重要性状。操纵植物甲基化来产生表观遗传学上不同的个体的能力对于育种和研究目的可能是无价的。

发明内容

本发明的目的是提供一套高效在水稻中实现基因组DNA甲基化/去甲基化的载体系统。

本发明首先保护一种表达载体，包括表达盒1和表达盒2；

所述表达盒1由水稻特异性Act1启动子启动功能片段甲表达；

所述表达盒2由水稻特异性Act1启动子启动功能片段乙表达；

所述功能片段甲包括10个拷贝GCN4肽的编码序列和dCas9的编码序列；

所述功能片段乙包括sfGFP的编码序列、特定酶的编码序列和单链可变片段scFv的GCN4抗体的编码序列；所述特定酶为水稻特异性甲基化酶或水稻特异性去甲基化酶。

所述功能片段甲还包括3×SV40 NLS序列。

所述功能片段乙还包括2×SV40 NLS序列。

所述特定酶具体可为水稻特异性DNA 6mA去甲基酶。

所述水稻特异性DNA 6mA去甲基酶具体可为OsALKBH1；

所述OsALKBH1是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQ ID No.2生的蛋白质；

(a3)与SEQ ID No.2自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述水稻特异性Act1启动子为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)SEQ ID No.1自5’端所第第2889-3731位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

(b3)与(b1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

所述表达盒1具体可如SEQ ID No.1自5’端第2889-10115位所示；

所述表达盒2中启动子序列具体可为SEQ ID No.1自5’端第1-843位的反向互补序列；所述表达盒2中其他元件的反向互补序列具体可如SEQ ID No.1自5’端第20825-23917位所示。

所述表达载体具体可为SEQ ID No.1所示的环状质粒。

第二方面，本发明保护前文所述的表达载体在水稻基因组甲基化或去甲基化中的应用。

第三方面，本发明水稻基因组DNA去甲基化的方法，包括如下步骤：将前文所述的表达载体导入受体水稻，实现水稻基因组DNA去甲基化。

所述水稻基因组DNA去甲基化发生在水稻细胞核内。

所述受体水稻具体可为日本晴水稻。

本发明提供了一套用于水稻表观基因组去甲基化的载体系统。该系统通过随机去甲基化水稻基因组来快速产生DNA甲基化变异。该系统涉及水稻OsALKBH DNA 6mA去甲基化酶的表达，导致广泛的低甲基化。该“诱变”技术对于具有重要农业意义的植物，可能导致通常由DNA甲基化沉默的等位基因的差异表达，从而揭示先前隐藏的表型变异的应用具有重要意义。

附图说明

图1为荧光显微镜检测原生质体检测情况。

图2为利用Dot Blot检测DNA 6mA水平变化。

图3为利用LC/MS检测DNA 6mA水平变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体的建立

一、载体构建

人工合成SEQ ID No.1所示的环状质粒。

所述质粒包括表达盒1和表达盒2。

所述表达盒1如序列表的SEQ ID No.1自5’端第2889-10115位所示。其中，水稻Act1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第2889-3731位所示，TMVΩ增强子的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第3784-3839位所示，dCas9的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第3856-7956位所示，1×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第7960-7986位所示，3×SV40 NLS的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第8005-8082位所示，10×GCN4_v4的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第8146-9378位所示，OCS终止子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1自5’端第9408-10115位所示。

所述表达盒2的启动子为水稻Act1启动子，其反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第1-843位所示。所述表达盒的其余元件如SEQ ID No.1自5’端第20825-23917位所示。其中，单链抗体scFv-GCN4的核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第23077-23907位所示，1×HA标签的核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第22288-22314位和第23140-23166位所示，sfGFP的核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第22339-23049所示，2×SV40 NLS的核苷酸序列如SEQ ID No.1自5’端第22222-22269位所示，水稻去甲基化酶OsALKBH1的核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第21088-22203位所示，NOS终止子的核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID No.1自5’端第20825-21087位所示。

所述载体包括两部分，第一部分为由水稻特异性Act1启动子启动与10×GCN4融合的dCas9表达，第二部分为由水稻特异性Act1启动子启动与超级折叠子-GFP(sfGFP)和水稻特异性DNA 6mA去甲基酶融合的单链抗体scFv-GCN4表达。上述载体可实现水稻基因组去甲基化。此外，所述载体还在scFv中添加了SV40型NLS，以确保在水稻细胞核中表达。

实际应用中，也可将水稻特异性DNA 6mA去甲基酶替换为水稻特异性甲基化酶，可实现水稻基因组甲基化。

二、载体效果验证

1、水稻原生质体的制备及转化所需溶液配制

100mM MES(4-吗啉乙磺酸)缓冲液：称取1.95g MES溶于100mL ddH₂O，用KOH调节溶液pH值5.7。

100mM KCl：称取0.7455g KCl溶于100mL ddH₂O。

1M MgCl₂：称取10.165g MgCl₂溶于50mL ddH₂O。

0.1M MgCl₂：称取2.03g MgCl₂溶于100mL ddH₂O。

1M CaCl₂：称取7.351g CaCl₂溶于50mL ddH₂O。

0.1M CaCl₂：称取1.47g CaCl₂溶于100mL ddH₂O。

水稻叶鞘原生质体酶解液配方见表1。

MMG溶液配方见表2。

W5溶液配方见表3。

表1

表2

表3

40％PEG溶液：(1)称取4g Sigma PEG3350(Sigma-Fluka,#81240)溶解于3mLddH₂O；(2)1.093g甘露醇溶解于2mL ddH₂O，再加入1mL 1M CaCl₂溶液，可加热至65℃助溶。将上述两种液体完全混合均匀，用KOH调节溶液pH值7.5-8.0，最后定容至10mL。

2水稻叶鞘原生质体制备及转化

(1)水稻日本晴种子(Oryza.Sativa L.spp.japonica)露白后，移至96孔板中避光培养8-10天，每天更换一次自来水。用蓝吉列刀片将40棵水稻幼苗茎切为1mm小段，置于盛有20mL酶解液的小烧杯(包裹锡纸)中，酶解液使用时全程避光。

(2)用锡纸封住烧杯口，用枪头扎一个小洞，30分钟抽真空，压力0.6-0.8；抽真空后将烧杯轻轻转移至28度摇床，50rpm，振荡4h后镜检。

(3)将剪过的蓝枪头用火烧一下，保证边缘平滑，在酶解液底部吸取300-400μL，转移至双凹载玻片上，用普通光学显微镜镜检，一般用10×物镜，若能轻易找到原生质体，且无破碎则可进行下一步；若原生质体少，则延长酶解时间，若原生质体在酶解4h时就大量破碎，则可能于溶液配制或水稻幼苗材料的状态有关。

(4)贴壁缓缓加入等体积的W5溶液，经300目的筛子过滤，将滤液收集培养皿中。用剪过的蓝枪头将滤液转移至50mL离心管。全程动作轻柔，以防破坏原生质体。

(5)低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1。

(6)用移液器转移离心后上清，弃去上清(上清不可能全部去除，保留少量不影响，只要保证枪头不接触底部沉淀)。贴壁缓缓加入15-20mLW5溶液(清洗原生质体)，不用吹打混匀。

(7)低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1。

(8)用移液器转移离心后上清，弃去上清(上清不可能全部去除，保留几十微升液体对结果无影响)。加入MMg溶液250μL，轻轻混匀。用细胞计数板在显微镜下计数，一般8×10⁴至2×10⁵(8万-20万)个细胞每100μL比较好。

(9)加入质粒：100μg第一部分制备的载体。质粒浓度必须大于1μg/μL。轻轻混匀，然后加入此时细胞悬浮液1.1倍体积的40％PEG(250μL体系对应275μL PEG)。PEG较粘稠，吸取时注意剪枪头，缓慢加入，盖紧盖子后轻轻转动管体使体系均匀。28℃避光放置20min。

(10)加入此时体系10倍体积的W5溶液(10×(250+275μL))，可取近似值：加入W5溶液体积为10×500μL。低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1。

(11)用移液器吸取离心后上清液，弃去上清(上清不可能全部去除，保留几十微升液体对结果无影响)。再次加入W5溶液5mL，低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1。

(12)离心完成后，转移并弃去绝大部分上清液，最后保留1mL上清液及沉淀于管底。加入1μL羧苄(100mg/mL)，发挥抑菌作用。轻轻混匀，28℃避光静止培养16h。

3、荧光蛋白检测(激光共聚焦显微镜)

使用荧光显微镜LSM700观察步骤2处理后的的原生质体样品和没有转化目标载体的原生质体样本。结果如图1所示。结果显示：结果表明：瞬时转化目的载体后的水稻原生质体内观察到明显的绿色荧光信号，说明通过目的基因去甲基酶系统可以得到表达。

4、Dot Blot检测DNA 6mA

Dot-blot法，即斑点印迹杂交法，是一种快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。该方法通过将核酸样品直接转移到适当的杂交滤膜上，然后利用抗体与核酸修饰的特异性结合，从而达到定性检测核酸样品中特异性修饰的目的。

提取步骤2得到的转化前和转化后的水稻叶鞘原生质体的基因组DNA，进行Dot-blot检测转化前后的水稻叶鞘原生质体的DNA 6mA的变化趋势。

(1)在200μL PCR管内使用ddH₂O设置DNA浓度梯度，PCR仪内95℃变性3min后，立即将PCR管取出，置于冰上3min以上。

(2)取合适大小的NC膜置于塑料培养皿内，取1μLDNA样品点在NC膜上。

(3)待膜干燥后，调整紫外交联仪至200KJ/cm²，将培养皿打开盖子后放置在交联仪内进行紫外交联，20s后即可取出。

(4)在皿内加入20mL 5％脱脂奶粉封闭1h。

(5)倒掉培养皿内的脱脂奶粉，使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(6)使用5mL PBST溶液按照1:1000比例稀释anti-6mA抗体(Synaptic Systems202003)后，加入到培养皿内，4℃过夜。

(7)回收一抗至离心管内，4℃保存。使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(8)使用10mL PBST溶液按照1:5000比例稀释辣根过氧化物酶标记的anti-mouseIgG抗体后，加入到培养皿内，室温孵育1h。

(9)使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(10)将膜上的液体使用无尘纸吸干后，各取500μL ECL发光底物A液和B液充分混匀后，将膜浸没至发光底物中反应2min。

(11)使用化学发光检测成像系统检测信号并拍照分析。

结果如图2所示。结果显示，转化前后，从瞬时转化目的载体的水稻原生质体中提取基因组DNA进行6mA点杂交，转化后基因组DNA 6mA修饰水平降低，说明目的基因模块转化后发挥去甲基化修饰功能。

5、LC/MS检测DNA 6mA

LC-MS/MS法为液相色谱-串联质谱法，即将液相色谱仪与质谱仪联用来对复杂混合物进行定性与定量分析的方法，并且简化了样品的先处理过程，使得样品的分析更加简便。LC-MS/MS可以通过采集质谱得到总离子色谱图，由于电喷雾是一种软电离源，通常很少或没有碎片，谱图中只有准分子离子，因而只能提供未知化合物的分子量信息，之后再串联使用一个单级MS，不使用软电离源，而用EI电离源的话，就可以得到碎片离子峰，从而定性分析结构信息。即LC-MS/MS可以对样品进行定量与定性地分析。

提取步骤2得到的转化前和转化后的水稻叶鞘原生质体的基因组DNA，利用LC-MS/MS法定量检测转化前后水稻叶鞘原生质体DNA 6mA修饰量的变化。

(1)用核酸酶P1(1U)、磷酸二酯酶I(0.01U)、30mM醋酸钠和2mM氯化锌调整RNA(1μg)至400μL体系。

(2)37℃孵育3h后，加入1μL细菌碱性磷酸酶(10U/μl)。

(3)继续37℃孵育1h，将RNA消解成单个核糖核苷。

(4)使用10kDa超滤管，12000rpm离心15min，将超滤管2mL收集管中的液体转移至进样瓶内。

(5)使用安捷伦6400三重四级杆液相色谱质谱联用仪器，屈臣氏蒸馏水(0.1％甲酸)和乙腈(0.1％甲酸)作为流动相，GOLDaQ柱子(100mm*2.1mm)孔径1.9μm，设定离子对进样检测。

液相色谱中，A相为乙腈,B相为0.1％(体积比)甲酸水溶液；液相色谱中，洗脱过程如下：第0-7min，A相占流动相的体积比由0线性上升至1％；第7-10.5min，A相占流动相的体积比由1％线性上升至6％；第10.5-15min，A相占流动相的体积比由6％线性上升至100％；第15-20min，A相占流动相的体积份数由100％线性下降至0。

结果如图3所示。结果显示，转化前后，从瞬时转化目的基因的水稻原生质体中提取基因组DNA利用LC/MS进行6mA修饰水平检测，转化后基因组DNA 6mA修饰水平降低，说明目的基因模块转化后发挥基因组去甲基化修饰功能。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggttgggg ggatgggagg agaggggggg gtatgtatat agtggcgatg gggggcgttt 60

ctttggaagc ggagggaggg cgggcctcgt cgctggctcg cgatcctcct cgcgtttccg 120

gcccccacga cccggaccca cctgctgttt tttctttttc ttttttttct ttcttttttt 180

ttttttggct gcgagacgtg cggtgcgtgc ggacaactca cggtgatagt gggggggtgt 240

ggagactatt gtccagttgg ctggactggg gtgggttggg ttgggttggg ttgggctggg 300

cttgctatgg atcgtggata gcactttggg ctctaggaac tttaggggtt gtttttgtaa 360

atgttttgag tctaagttta tcttttattt ttactagaaa aaatacccat gcgctgcaac 420

gggggaaagc tattttaatc ttattattgt tcattgtgag aattcgcctg aatatatatt 480

tttctcaaaa attatgtcaa attagcatat gggttttttt aaagatattt cttatacaaa 540

tccctctgta tttacaaaag caaacgaact taaaacccga ctcaaataca gatatgcatt 600

tccaaaagcg aataaactta aaaaccaatt catacaaaaa tgacgtatca aagtaccgac 660

aaaaacatcc tcaattttta taatagtaga aaagagtaaa tttcactttg ggccaccttt 720

tattaccgat attttacttt ataccacctt ttaactgatg ttttcacttt tgaccaggta 780

atcttacctt tgttttattt tggactatcc cgactctctt ctcaagcata tgaatgacct 840

cgacctagga aacaagttgt aatgagttgc tggcctctct tgggattgtt catcaaagta 900

gctgtcccta cacaccacaa cagaatggtg ttgtggagag aaagcacaga cacatccttg 960

agatggcaag ggcacttaag tttcagagtg gtgtacctac caggttttgg ggagactgtg 1020

tcaagactgt tgtatacctg atcaatagac tccctactcc aatcttacaa ggcaaatgtc 1080

catatgaact actctatcag aaacatgcca agcttgatca cttgagagtg tttgggtgtc 1140

ttgcttttgc agcaacactg cccaaaggtg acaaacttgc acctagagcc aagcgaacca 1200

tcttcattgg ttattctgag actcaaaagg gttacaggtt gtatgacttg gataataagg 1260

tgatcatagt gagcagggat gtagttttca gagagtttca gttccctttc aaagagtcca 1320

tctcccatga acctgatatg ttcactcgag caggttcact tagctctgaa gatacagctt 1380

tgcagctagt gtataatgat atttttcctt ccagctttca tactgatgat gatgatactc 1440

cagttcttat tcctgacatt gtagaggcca atgaggatat cactttgggg actcattcta 1500

cccaaaatca tatcacttca gctgatgctg caccttcagg ccacctgcat gctcctgcag 1560

agtcagttga gtcagctgag cctgacctag caaatgctga atttgagcac catactgctg 1620

tagctgatcc ctctctagtt ccagcaaacc tgcacactag acctaaacgc aatgcaggtc 1680

ctcccatctg gctcaaggac tttgtgacac tgaacaaagg ctctagggat gttccatacc 1740

ctatagccaa ctatgtttcc tatgatcact tgcctgttca ctatcaagct tatttgagtg 1800

ctttctccac ttatactgaa cctaaatcct tcaaagaagc agctcaagat gagaaatgga 1860

tggaggccat gtcccttgag atacaggctc ttgaggataa taacacctgg gagattgtcc 1920

ctttaccccc tggtaaacag cctatagggt ccaaatgggt gtacaaaatt aaatacaaag 1980

ctaatggtga agttgacagg tttaaggcaa ggctagtggc caagggatac actcagcaag 2040

aaggccttga ctaccatgaa actttttctc cagtggccaa aatggtcact gtaaaagctg 2100

tcatatctgt tgctgcttcc aagggctggt tccttttcca gatggatgtc aacaatgctt 2160

ttctacaagg tgacctcatg gaagaagttt atatgtctct gcctcagggt tttcacagcc 2220

aaggggagac caaagtgtgc aggctgttga atccctctat ggtttaaagc aagcatcaag 2280

gcagtggaac atcaagctta ccactgtcct tatgcaggct ggttttatgc aaagtgctta 2340

tgatcactcc ttgtttacca aaagagaggg gactgacctt gtcataatcc tgatttatgt 2400

ggatgatctg ttaataacag gcagcagcaa tgttttgatt tcagaagcaa aggcaaccct 2460

gcatcagcat ttcaagatga aagatttggg agaactaaaa tacttcttag gcattgaggt 2520

gctgagatca gaaaagggaa tcctactgaa ccagaggaag tatgcactgg aactgatatc 2580

aggtgttggt ctgggaggct gcagaccagt gtcaacacca atggaacaga accaaaggct 2640

gactactgta gaatatgaca agcacttagg aaagactgat gatgcagagt tagaggatgt 2700

gggttcctat cagagactgg tgggaaagct tctctacttg acaatcacaa ggccagatat 2760

cagctttgca gtgcaggtgc tgagtcaatt catgcagcaa cccaaacagt cacacctgga 2820

agcagcattg agggttgtga agtacataaa aggttctcca ggtgttagga agcggccgca 2880

tgcatatgtc gaggtcattc atatgcttga gaagagagtc gggatagtcc aaaataaaac 2940

aaaggtaaga ttacctggtc aaaagtgaaa acatcagtta aaaggtggta taaagtaaaa 3000

tatcggtaat aaaaggtggc ccaaagtgaa atttactctt ttctactatt ataaaaattg 3060

aggatgtttt tgtcggtact ttgatacgtc atttttgtat gaattggttt ttaagtttat 3120

tcgcttttgg aaatgcatat ctgtatttga gtcgggtttt aagttcgttt gcttttgtaa 3180

atacagaggg atttgtataa gaaatatctt taaaaaaacc catatgctaa tttgacataa 3240

tttttgagaa aaatatatat tcaggcgaat tctcacaatg aacaataata agattaaaat 3300

agctttcccc cgttgcagcg catgggtatt ttttctagta aaaataaaag ataaacttag 3360

actcaaaaca tttacaaaaa caacccctaa agttcctaga gcccaaagtg ctatccacga 3420

tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtcca gccaactgga 3480

caatagtctc cacacccccc cactatcacc gtgagttgtc cgcacgcacc gcacgtctcg 3540

cagccaaaaa aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg 3600

gtcgtggggg ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccc gccctccctc 3660

cgcttccaaa gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc 3720

cccccaaccc tggatcatca acaagtttgt acaaaaaagc aggctcttta aagtattttt 3780

acaacaatta ccaacaacaa caaacaacaa acaacattac aattactatt tacaattaca 3840

aaaaaagtta acatggacaa gaagtacagc atcggcctgg ccatcggcac caactctgtg 3900

ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgcccagca agaaattcaa ggtgctgggc 3960

aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac ctgatcggcg ccctgctgtt cgacagcgga 4020

gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga accgccagaa gaagatacac cagacggaag 4080

aaccggatct gctatctgca agagatcttc agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc 4140

ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac 4200

cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc caccatctac 4260

cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggccg acctgcggct gatctatctg 4320

gccctggccc acatgatcaa gttccggggc cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc 4380

gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc 4440

gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg gacgccaagg ccatcctgtc tgccagactg 4500

agcaagagca gacggctgga aaatctgatc gcccagctgc ccggcgagaa gaagaatggc 4560

ctgttcggca acctgattgc cctgagcctg ggcctgaccc ccaacttcaa gagcaacttc 4620

gacctggccg aggatgccaa actgcagctg agcaaggaca cctacgacga cgacctggac 4680

aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctgt ttctggccgc caagaacctg 4740

tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg agagtgaaca ccgagatcac caaggccccc 4800

ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac gagcaccacc aggacctgac cctgctgaaa 4860

gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag tacaaagaga ttttcttcga ccagagcaag 4920

aacggctacg ccggctacat cgatggcgga gccagccagg aagagttcta caagttcatc 4980

aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc gaggaactgc tcgtgaagct gaacagagag 5040

gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac aacggcagca tcccccacca gatccacctg 5100

ggagagctgc acgccattct gcggcggcag gaagattttt acccattcct gaaggacaac 5160

cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc cgcatcccct actacgtggg ccctctggcc 5220

aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc agaaagagcg aggaaaccat caccccctgg 5280

aacttcgagg aagtggtgga caagggcgcc agcgcccaga gcttcatcga gcggatgacc 5340

aacttcgata agaacctgcc caacgagaag gtgctgccca agcacagcct gctgtacgag 5400

tacttcaccg tgtacaacga gctgaccaaa gtgaaatacg tgaccgaggg aatgagaaag 5460

cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaaa gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac 5520

cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag gactacttca agaaaatcga gtgcttcgac 5580

tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg ttcaacgcct ccctgggcac ataccacgat 5640

ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc ctggacaatg aggaaaacga ggacattctg 5700

gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt gaggacagag agatgatcga ggaacggctg 5760

aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa gtgatgaagc agctgaagcg gcggagatac 5820

accggctggg gcaggctgag ccggaagctg atcaacggca tccgggacaa gcagtccggc 5880

aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac ggcttcgcca acagaaactt catgcagctg 5940

atccacgacg acagcctgac ctttaaagag gacatccaga aagcccaggt gtccggccag 6000

ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat ctggccggca gccccgccat taagaagggc 6060

atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag ctcgtgaaag tgatgggccg gcacaagccc 6120

gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag aaccagacca cccagaaggg acagaagaac 6180

agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag ggcatcaaag agctgggcag ccagatcctg 6240

aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg cagaacgaga agctgtacct gtactacctg 6300

cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag gaactggaca tcaaccggct gtccgactac 6360

gatgtggacg ctatcgtgcc tcagagcttt ctgaaggacg actccatcga taacaaagtg 6420

ctgactcgga gcgacaagaa ccggggcaag agcgacaacg tgccctccga agaggtcgtg 6480

aagaagatga agaactactg gcgccagctg ctgaatgcca agctgattac ccagaggaag 6540

ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc ggcctgagcg aactggataa ggccggcttc 6600

atcaagagac agctggtgga aacccggcag atcacaaagc acgtggcaca gatcctggac 6660

tcccggatga acactaagta cgacgagaac gacaaactga tccgggaagt gaaagtgatc 6720

accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc cggaaggatt tccagtttta caaagtgcgc 6780

gagatcaaca actaccacca cgcccacgac gcctacctga acgccgtcgt gggaaccgcc 6840

ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac 6900

gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag caggaaatcg gcaaggctac cgccaagtac 6960

ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc aagaccgaga ttaccctggc caacggcgag 7020

atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac ggcgaaacag gcgagatcgt gtgggataag 7080

ggccgggact ttgccaccgt gcggaaagtg ctgtctatgc cccaagtgaa tatcgtgaaa 7140

aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc aaagagtcta tcctgcccaa gaggaacagc 7200

gacaagctga tcgccagaaa gaaggactgg gaccctaaga agtacggcgg cttcgacagc 7260

cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg gccaaagtgg aaaagggcaa gtccaagaaa 7320

ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc accatcatgg aaagaagcag cttcgagaag 7380

aatcccatcg actttctgga agccaagggc tacaaagaag tgaaaaagga cctgatcatc 7440

aagctgccta agtactccct gttcgagctg gaaaacggcc ggaagagaat gctggcctct 7500

gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg gccctgccct ccaaatatgt gaacttcctg 7560

tacctggcca gccactatga gaagctgaag ggctcccccg aggataatga gcagaaacag 7620

ctgtttgtgg aacagcacaa acactacctg gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc 7680

tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat ctggacaagg tgctgagcgc ctacaacaag 7740

cacagagaca agcctatcag agagcaggcc gagaatatca tccacctgtt taccctgacc 7800

aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac tttgacacca ccatcgaccg gaagaggtac 7860

accagcacca aagaggtgct ggacgccacc ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac 7920

gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga ggcgacgcct atccctatga cgtgcccgat 7980

tatgccagcc tgggcagcgg ctcccccaag aaaaaacgca aggtggaaga tcctaagaaa 8040

aagcggaaag tggaagatgc tccaaagaag aagagaaagg tcgacggcat tggtagtggg 8100

agcaacggca gcagcggatc caacggtccg actgacgccg cggaagaaga acttttgagc 8160

aagaattatc atcttgagaa cgaagtggct cgtcttaaga aaggttctgg cagtggaggt 8220

tctggctccg gatctggtgg ttcgggctca ggcgggtccg gatcaggcga agaactgctt 8280

tcaaagaatt accacctgga aaatgaggta gctagactga aaaaggggag cggaagtggg 8340

ggctccgggt cgggctcagg gggctccggt tcgggaggct cagggtcggg ggaggagttg 8400

ctgagcaaaa attatcattt ggagaacgaa gtagcacgac taaagaaagg gtccggatcg 8460

ggtggttcag gatctggatc cggaggatca gggtccggtg ggtcgggctc aggagaggag 8520

ttactctcga aaaattatca tctcgaaaac gaagtggctc ggctaaaaaa gggcagtggt 8580

tctggaggat ctgggtcggg gtcaggcggg tctggatctg ggggatctgg atctggtgaa 8640

gagctattat ctaaaaacta ccacctcgaa aatgaggtgg cacgcttaaa aaagggaagt 8700

ggcagtggtg ggtcgggatc tggctctggt ggctcaggct cgggaggttc aggttccggg 8760

gaagagctac tatccaagaa ttatcatctt gagaacgagg tagcgcgttt gaagaagggt 8820

tccggctcag gaggatctgg gtcaggatcg gggggttccg ggtcaggcgg gtccgggtca 8880

ggcgaggaac tgctctcgaa gaactatcat cttgaaaatg aggtcgctcg attaaaaaag 8940

ggatcgggca gtggtgggtc cggctccggt tccggaggat cgggatctgg gggctcggga 9000

tccggggagg aactactttc aaagaattac cacctcgaaa acgaagtagc tcgattaaag 9060

aaaggttcag ggtcgggtgg ctcaggttcg ggatcaggtg ggtcaggctc cggtggttca 9120

ggttcgggag aagaattact gagtaaaaat tatcatctgg aaaatgaggt agcgagacta 9180

aaaaagggga gtggttctgg cggttcggga tctggctctg ggggctctgg gtcgggaggg 9240

tctgggtctg gcgaggaatt gctatcgaaa aattatcatc ttgagaacga agttgctagg 9300

ctcaaaaagg gctcaggctc aggcgggtcc gggtcagggt cgggaggttc cggatccggg 9360

ggatcaggct cagggtaacc cgggggcgcg ccatgataac tagagtcctg ctttaatgag 9420

atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat ttgctttcaa ttctgttgtg cacgttgtaa 9480

aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt accgccggtt tcggttcatt ctaatgaata 9540

tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa taatattctc cgttcaattt actgattgta 9600

ccctactact tatatgtaca atattaaaat gaaaacaata tattgtgctg aataggttta 9660

tagcgacatc tatgatagag cgccacaata acaaacaatt gcgttttatt attacaaatc 9720

caattttaaa aaaagcggca gaaccggtca aacctaaaag actgattaca taaatcttat 9780

tcaaatttca aaagtgcccc aggggctagt atctacgaca caccgagcgg cgaactaata 9840

acgctcactg aagggaactc cggttccccg ccggcgcgca tgggtgagat tccttgaagt 9900

tgagtattgg ccgtccgctc taccgaaagt tacgggcacc attcaacccg gtccagcacg 9960

gcggccgggt aaccgacttg ctgccccgag aattatgcag catttttttg gtgtatgtgg 10020

gccccaaatg aagtgcaggt caaaccttga cagtgacgac aaatcgttgg gcgggtccag 10080

ggcgaatttt gcgacaacat gtcgaggctc agcaggaccg gcatgcaagc tagcttacta 10140

gtgatattct atagtgtcac ctaaatctgc ggccgcggta ccactagtac gcgtaggcct 10200

gagctctttg acaggatata ttggcgggta aacgatatcg gcaccttcga ccgcctgttc 10260

cgcagaggtg caggcctcga tctgaaaccc gaaccgctgg agattgcggg agcagcgagc 10320

agtagcctcg gggtcgatgt cgtaaagtcg tatccgatcg acgccgatca gcgccttgaa 10380

ggccaaagcc tggaactcac tttgggcacc gttgccgatc agcgccatcg tgcgcgaatc 10440

tttacgggcc agatactttg ccgcgatcgc ggaggtcgcg gccgttcgca aggccgtcag 10500

gattgtcatt tccgacagca gcagcggata gccgctatcg acatcggaga gcacgccgaa 10560

cgcggttacc ggcctcttca tcgggaatgc gcgcgacctt cagcatcgcc ggcatgtccc 10620

cctggcggac gggaagtatc cagctcgacc tcgacggatc ttttccgctg cataaccctg 10680

cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac gatatacagg 10740

attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc agccgggcag 10800

gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc cttattcgca 10860

cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg ccggcgtaac 10920

agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc aggggtgatg ctgccaactt 10980

actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 11040

gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 11100

agcgctatct ctgctctcac tgccgtaaaa catggcaact gcagttcact tacaccgctt 11160

ctcaacccgg tacgcaccag aaaatcattg atatggccat gaatggcgtt ggatgccggg 11220

caacagcccg cattatgggc gttggcctca acacgatttt acgtcactta aaaaactcag 11280

gccgcagtcg gtaacctcgc gcatacagcc gggcagtgac gtcatcgtct gcgcggaaat 11340

ggacgaacag tggggctatg tcggggctaa atcgcgccag cgctggctgt tttacgcgta 11400

tgacagtctc cggaagacgg ttgttgcgca cgtattcggt gaacgcacta tggcgacgct 11460

ggggcgtctt atgagcctgc tgtcaccctt tgacgtggtg atatggatga cggatggctg 11520

gccgctgtat gaatcccgcc tgaagggaaa gctgcacgta atcagcaagc gatatacgca 11580

gcgaattgag cggcataacc tgaatctgag gcagcacctg gcacggctgg gacggaagtc 11640

gctgtcgttc tcaaaatcgg tggagctgca tgacaaagtc atcgggcatt atctgaacat 11700

aaaacactat caataagttg gagtcattac ccaaccagga agggcagccc acctatcaag 11760

gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa aggcggcggc ggccggcatg 11820

agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca aaatcacggg cgtcgtggac 11880

tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc tgggccgcct gggcggcctg 11940

ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt tcggtgatgc cacgatcctc 12000

gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg gcaaggtcat gatgggcgtg 12060

gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa aacggccggg gggtgcgcgt 12120

gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc gacttcgcgg agctggtatt 12180

cgtgcagggc aagattcgga ataccaagta cgagaaggac ggccagacgg tctacgggac 12240

cgacttcatt gccgataagg tggattatct ggacaccaag gcaccaggcg ggtcaaatca 12300

ggaataaggg cacattgccc cggcgtgagt cggggcaatc ccgcaaggag ggtgaatgaa 12360

tcggacgttt gaccggaagg catacaggca agaactgatc gacgcggggt tttccgccga 12420

ggatgccgaa accatcgcaa gccgcaccgt catgcgtgcg ccccgcgaaa ccttccagtc 12480

cgtcggctcg atggtccagc aagctacggc caagatcgag cgcgacagcg tgcaactggc 12540

tccccctgcc ctgcccgcgc catcggccgc cgtggagcgt tcgcgtcgtc tcgaacagga 12600

ggcggcaggt ttggcgaagt cgatgaccat cgacacgcga ggaactatga cgaccaagaa 12660

gcgaaaaacc gccggcgagg acctggcaaa acaggtcagc gaggccaagc aggccgcgtt 12720

gctgaaacac acgaagcagc agatcaagga aatgcagctt tccttgttcg atattgcgcc 12780

gtggccggac acgatgcgag cgatgccaaa cgacacggcc cgctctgccc tgttcaccac 12840

gcgcaacaag aaaatcccgc gcgaggcgct gcaaaacaag gtcattttcc acgtcaacaa 12900

ggacgtgaag atcacctaca ccggcgtcga gctgcgggcc gacgatgacg aactggtgtg 12960

gcagcaggtg ttggagtacg cgaagcgcac ccctatcggc gagccgatca ccttcacgtt 13020

ctacgagctt tgccaggacc tgggctggtc gatcaatggc cggtattaca cgaaggccga 13080

ggaatgcctg tcgcgcctac aggcgacggc gatgggcttc acgtccgacc gcgttgggca 13140

cctggaatcg gtgtcgctgc tgcaccgctt ccgcgtcctg gaccgtggca agaaaacgtc 13200

ccgttgccag gtcctgatcg acgaggaaat cgtcgtgctg tttgctggcg accactacac 13260

gaaattcata tgggagaagt accgcaagct gtcgccgacg gcccgacgga tgttcgacta 13320

tttcagctcg caccgggagc cgtacccgct caagctggaa accttccgcc tcatgtgcgg 13380

atcggattcc acccgcgtga agaagtggcg cgagcaggtc ggcgaagcct gcgaagagtt 13440

gcgaggcagc ggcctggtgg aacacgcctg ggtcaatgat gacctggtgc attgcaaacg 13500

ctagggcctt gtggggtcag ttccggctgg gggttcagca gccagcgctt tactggcatt 13560

tcaggaacaa gcgggcactg ctcgacgcac ttgcttcgct cagtatcgct cgggacgcac 13620

ggcgcgctct acgaactgcc gataaacaga ggattaaaat tgacaattgt gattaaggct 13680

cagattcgac ggcttggagc ggccgacgtg caggatttcc gcgagatccg attgtcggcc 13740

ctgaagaaag ctccagagat gttcgggtcc gtttacgagc acgaggagaa aaagcccatg 13800

gaggcgttcg ctgaacggtt gcgagatgcc gtggcattcg gcgcctacat cgacggcgag 13860

atcattgggc tgtcggtctt caaacaggag gacggcccca aggacgctca caaggcgcat 13920

ctgtccggcg ttttcgtgga gcccgaacag cgaggccgag gggtcgccgg tatgctgctg 13980

cgggcgttgc cggcgggttt attgctcgtg atgatcgtcc gacagattcc aacgggaatc 14040

tggtggatgc gcatcttcat cctcggcgca cttaatattt cgctattctg gagcttgttg 14100

tttatttcgg tctaccgcct gccgggcggg gtcgcggcga cggtaggcgc tgtgcagccg 14160

ctgatggtcg tgttcatctc tgccgctctg ctaggtagcc cgatacgatt gatggcggtc 14220

ctgggggcta tttgcggaac tgcgggcgtg gcgctgttgg tgttgacacc aaacgcagcg 14280

ctagatcctg tcggcgtcgc agcgggcctg gcgggggcgg tttccatggc gttcggaacc 14340

gtgctgaccc gcaagtggca acctcccgtg cctctgctca cctttaccgc ctggcaactg 14400

gcggccggag gacttctgct cgttccagta gctttagtgt ttgatccgcc aatcccgatg 14460

cctacaggaa ccaatgttct cggcctggcg tggctcggcc tgatcggagc gggtttaacc 14520

tacttccttt ggttccgggg gatctcgcga ctcgaaccta cagttgtttc cttactgggc 14580

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taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 14700

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 14760

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 14820

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 14880

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 14940

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 15000

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 15060

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 15120

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 15180

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 15240

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 15300

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 15360

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 15420

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatatc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 15480

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 15540

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 15600

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 15660

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 15720

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 15780

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 15840

caactttatc cgcctccatc cagtctatta aacaagtggc agcaacggat tcgcaaacct 15900

gtcacgcctt ttgtgccaaa agccgcgcca ggtttgcgat ccgctgtgcc aggcgttagg 15960

cgtcatatga agatttcggt gatccctgag caggtggcgg aaacattgga tgctgagaac 16020

catttcattg ttcgtgaagt gttcgatgtg cacctatccg accaaggctt tgaactatct 16080

accagaagtg tgagccccta ccggaaggat tacatctcgg atgatgactc tgatgaagac 16140

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acatggaacg atctagcctc tatcgaacac attgttgtgt cgcacacgca ccgaggcaaa 16260

ggagtcgcgc acagtctcat cgaatttgcg aaaaagtggg cactaagcag acagctcctt 16320

ggcatacgat tagagacaca aacgaacaat gtacctgcct gcaatttgta cgcaaaatgt 16380

ggctttactc tcggcggcat tgacctgttc acgtataaaa ctagacctca agtctcgaac 16440

gaaacagcga tgtactggta ctggttctcg ggagcacagg atgacgccta acaattcatt 16500

caagccgaca ccgtttcgcg gcgcggctta attcaggagt taaacatcat gagggaagcg 16560

gtgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 16620

gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 16680

cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 16740

gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 16800

gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 16860

cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 16920

gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 16980

ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 17040

gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 17100

aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 17160

aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 17220

cttgaagcta ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 17280

ttggaagaat ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt 17340

ctaacaattc gttcaagccg acgccgcttc gcggcgcggc ttaactcaag cgttagagag 17400

ctggggaaga ctatgcgcga tctgttgaag gtggttctaa gcctcgtact tgcgatggca 17460

tcggggcagg cacttgctga cctgccaatt gttttagtgg atgaagctcg tcttccctat 17520

gactactccc catccaacta cgacatttct ccaagcaact acgacaactc cataagcaat 17580

tacgacaata gtccatcaaa ttacgacaac tctgagagca aatacgataa tagttcatcc 17640

aattacgaca atagtcgcaa cggaaatcgt aggcttatat atagcgcaaa tgggtctcgc 17700

actttcgccg gctactacgt cattgccaac aatgggacaa cgaacttctt ttccacatct 17760

ggcaaaagga tgttctacac cccaaaaggg gggcgcggcg tctatggcgg caaagatggg 17820

agcttctgcg gggcattggt cgtcataaat ggccaatttt cgcttgccct gacagataac 17880

ggcctgaaga tcatgtatct aagcaactag cctgctctct aataaaatgt taggagcttg 17940

gctgccattt ttggggtgag gccgttcgcg gccgaggggc gcagcccctg gggggatggg 18000

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cggtcacgcg cacagggcgc agccctggtt aaaaacaagg tttataaata ttggtttaaa 18120

agcaggttaa aagacaggtt agcggtggcc gaaaaacggg cggaaaccct tgcaaatgct 18180

ggattttctg cctgtggaca gcccctcaaa tgtcaatagg tgcgcccctc atctgtcagc 18240

actctgcccc tcaagtgtca aggatcgcgc ccctcatctg tcagtagtcg cgcccctcaa 18300

gtgtcaatac cgcagggcac ttatccccag gcttgtccac atcatctgtg ggaaactcgc 18360

gtaaaatcag gcgttttcgc cgatttgcga ggctggccag ctccacgtcg ccggccgaaa 18420

tcgagcctgc ccctcatctg tcaacgccgc gccgggtgag tcggcccctc aagtgtcaac 18480

gtccgcccct catctgtcag tgagggccaa gttttccgcg aggtatccac aacgccggcg 18540

gccggccgcg gtgtctcgca cacggcttcg acggcgtttc tggcgcgttt gcagggccat 18600

agacggccgc cagcccagcg gcgagggcaa ccagcccggt gagcgtcgga aagggtcgag 18660

gaattccgcc taaccggctc agttctgcgt agaaaccaac atgcaagctc caccgggtgc 18720

aaagcggcag cggcggcagg atatattcaa ttgtaaatgg cttcatgtcc gggaaatcta 18780

catggatcag caatgagtat gatggtccca tcgataagct tggcaattcc cgatctagta 18840

acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta 18900

tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg 18960

tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa 19020

tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac 19080

gatcggggat cgatcccggt cggcatctac tctattcctt tgccctcgga cgagtgctgg 19140

ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc 19200

ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc 19260

atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt 19320

ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc ggagccgcgg cgatcctgca agctccggat 19380

gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga 19440

agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg 19500

ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt 19560

gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg 19620

acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg 19680

cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga 19740

acccgcttgt ctggctaaga tcggccgcag cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct 19800

gcagaacagc gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc 19860

gggagatgca ataggtcagg ctctcgctga atgccccaat gtcaagcact tccggaatcg 19920

ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc 19980

agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt 20040

cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact 20100

tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc ttattgcccc cctagagtcg 20160

agatctggat tgagagtgaa tatgagactc taattggata ccgaggggaa tttatggaac 20220

gtcagtggag catttttgac aagaaatatt tgctagctga tagtgacctt aggcgacttt 20280

tgaacgcgca ataatggttt ctgacgtatg tgcttagctc attaaactcc agaaacccgc 20340

ggctgagtgg ctccttcaac gttgcggttc tgtcagttcc aaacgtaaaa cggcttgtcc 20400

cgcgtcatcg gcgggggtca taacgtgact cccttaattc tccgctcatg atcttgatcc 20460

cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 20520

aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc 20580

ccagtctagc tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc 20640

gttttccctt gtccagatag cccagtagct gacattcatc cggggtcagc accgtttctg 20700

cggactggct ttctacgtgt tccgcttcct ttagcagccc ttgcgccctg agtgcttgcg 20760

gcagcgtgaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagaca cggggtggtt tggtttaaac 20820

aaacgtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 20880

ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 20940

aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 21000

atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 21060

tttgaacgat cggggaaatt cgagctccta atgctgcctg aatgtgaggt tcagacgccc 21120

aggtcgaagt tttgcttcat cggtcagcca atttggtgct gtttttggtt tgattctgga 21180

aaccccatgg aatatgagcc ttgatttacc accaaatatg agaacatcac cagattccag 21240

atcaaccttt gaagctttat ccacatcgtt cacgtcacca tacaagaatt ctgcagtgtc 21300

acctagcgaa aatgaaacaa caggcaatcc cttatgaagg ctgggtttcg tttcatcttt 21360

gtcctggtga agacctaact taccactgct ggtatagaag ttaacaaggc agatatctgg 21420

tgacagtgga ggaagttctt caacatcatt ggcaggtctg gctttttgtc tcaaaaattc 21480

attggaagct tggatggcat ctttaactat cttactgaat acttctggta tacttggtgg 21540

ttgagcacca tcaaatggac gtgtatctcc atatgaacgt gaatttggat cccagttctt 21600

ccctaagcac atcatctgca aacttaattt accaccatct ctgtagccag gagtataaaa 21660

tcctcctgag ccaataccaa gtttctggca gcgtctgata atgtcaacct gatcatcatg 21720

ctttaagaac tttttcaaca gaaccatccc aggtctcaaa tattgcaatg gagctgcctc 21780

cttggaaagt tgctcccttt ctcgtctttt ttctctgttg atttccagta aagaacgact 21840

taacttgatg gagcacttat catctctttt tatgcatatg tcaaatgggg cagctcctga 21900

accagatcct acagatccag aactgcatgg aatggttctt gggcctggag attcttgcag 21960

tcgaaccggt gtaaccatgt gctgtggtga ctctagcggt ttctgtggtt gaacaattgc 22020

tgcagccaat tggagtgggg acttgttact gctaactgaa ggagaggatg aacttggccc 22080

cttcttttgc tgttccaacg acttctcatg aaccggtccg cgagggaggc gagccttctg 22140

ccgcgggggg aagttcgccg gcgtcctgac cccgtggccg ccgccgccgc cgccgccgac 22200

catcccggat ccgccaccgc ccactttccg ctttttctta ggagcttcca ccttgcgttt 22260

tttcttggga gcgccgctgc ccaggctggc ataatcgggc acgtcatagg gatacgtacg 22320

accggtccga cctccacctt tgtagagctc atccatgcca tgtgtaatcc cagcagcagt 22380

tacaaactca agaaggacca tgtggtcacg cttttcgttg ggatctttcg aaaggacaga 22440

ttgtgtcgac aggtaatggt tgtctggtaa aaggacaggg ccatcgccaa ttggagtatt 22500

ttgttgataa tggtctgcta gttgaacgga accatcttca acgttgtggc gaattttgaa 22560

gttagctttg attccattct tttgtttgtc tgccgtgatg tatacattgt gtgagttaaa 22620

gttgtactcg agtttgtgtc caagaatgtt tccatcttct ttaaaatcaa taccctttaa 22680

ctcgatacga ttaacaaggg tatcaccttc aaacttgact tcagcacgcg tcttgtaggt 22740

cccgtcatct ttgaaagata tagtgcgttc ctgtacataa ccttcgggca tggcactctt 22800

gaaaaagtca tgccgtttca tgtgatccgg ataacgggaa aagcattgaa caccataggt 22860

cagagtagtg acaagtgttg gccacggaac aggtagtttt ccagtagtgc aaataaattt 22920

aagggtgagt tttccgtttg tagcatcacc ttcaccctct ccacggacag aaaatttgtg 22980

cccattaaca tcaccatcta attcaacaag aattgggaca actccagtga aaagttcttc 23040

tcctttgcta ccgcttccac ctccacctgg atccaagctt ccgccgcctc ctgaaccacc 23100

accgccacta cctcctcccc cagaacctcc gcctccacca gcgtaatctg gaacatcgta 23160

tgggtagctg ctcacggtca ccagggtgcc ctggccccag tagtcgaaca ggccggtcac 23220

gcagtagtac agggcggtgt cgtcgctgcg caccttgctc atctgcaggt acacggtgtt 23280

cttgccgttg tccttgctga tgatgaagcg gtccttcagg gcgctgttgt agtcggtgat 23340

gccgtcgccc cagatcacgc cgatccactc caggccgcgg ccgggggcct ggcgcaccca 23400

gttcacgccg tagtcggtca ggctgaagcc gctcacggcg cagctcagct tcaggctgcc 23460

gccgggctgc accaggccgc cgccgctctc cagcagcttc acctcgctgc cgccgccgct 23520

gctgccgccg ccgccgctgc cgccgccgcc gctgccgccg ccgccgcgct tcagctccac 23580

cttggtgccc tggccgaaca cccagtggtt gctgtaccac agggcgcaga agtaggtggc 23640

gaagtcctcg ggctgcaggc tgctgatggt cagggtggcc ttgtcgccga tcaggctgcc 23700

gctgaagcgg ctgggcacgc cgggggcgcg gttgttggtg ccgccgatca ggcccttgaa 23760

cagcttgccg ggcttctcct gcacccagct ggcgtagttg ctggtggtca cggcgccggt 23820

gctgctgcgg caggtgatgg tcacgcggtc gcccacgctg gcgctcaggc tgctggggct 23880

ctgggtcatc acgatgtcgg ggcccataaa ccctagg 23917

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly His Gly Val Arg Thr Pro Ala

1 5 10 15

Asn Phe Pro Pro Arg Gln Lys Ala Arg Leu Pro Arg Gly Pro Val His

20 25 30

Glu Lys Ser Leu Glu Gln Gln Lys Lys Gly Pro Ser Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Val Ser Ser Asn Lys Ser Pro Leu Gln Leu Ala Ala Ala Ile Val

50 55 60

Gln Pro Gln Lys Pro Leu Glu Ser Pro Gln His Met Val Thr Pro Val

65 70 75 80

Arg Leu Gln Glu Ser Pro Gly Pro Arg Thr Ile Pro Cys Ser Ser Gly

85 90 95

Ser Val Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ala Pro Phe Asp Ile Cys Ile Lys

100 105 110

Arg Asp Asp Lys Cys Ser Ile Lys Leu Ser Arg Ser Leu Leu Glu Ile

115 120 125

Asn Arg Glu Lys Arg Arg Glu Arg Glu Gln Leu Ser Lys Glu Ala Ala

130 135 140

Pro Leu Gln Tyr Leu Arg Pro Gly Met Val Leu Leu Lys Lys Phe Leu

145 150 155 160

Lys His Asp Asp Gln Val Asp Ile Ile Arg Arg Cys Gln Lys Leu Gly

165 170 175

Ile Gly Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Pro Gly Tyr Arg Asp Gly Gly Lys

180 185 190

Leu Ser Leu Gln Met Met Cys Leu Gly Lys Asn Trp Asp Pro Asn Ser

195 200 205

Arg Ser Tyr Gly Asp Thr Arg Pro Phe Asp Gly Ala Gln Pro Pro Ser

210 215 220

Ile Pro Glu Val Phe Ser Lys Ile Val Lys Asp Ala Ile Gln Ala Ser

225 230 235 240

Asn Glu Phe Leu Arg Gln Lys Ala Arg Pro Ala Asn Asp Val Glu Glu

245 250 255

Leu Pro Pro Leu Ser Pro Asp Ile Cys Leu Val Asn Phe Tyr Thr Ser

260 265 270

Ser Gly Lys Leu Gly Leu His Gln Asp Lys Asp Glu Thr Lys Pro Ser

275 280 285

Leu His Lys Gly Leu Pro Val Val Ser Phe Ser Leu Gly Asp Thr Ala

290 295 300

Glu Phe Leu Tyr Gly Asp Val Asn Asp Val Asp Lys Ala Ser Lys Val

305 310 315 320

Asp Leu Glu Ser Gly Asp Val Leu Ile Phe Gly Gly Lys Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Phe His Gly Val Ser Arg Ile Lys Pro Lys Thr Ala Pro Asn Trp

340 345 350

Leu Thr Asp Glu Ala Lys Leu Arg Pro Gly Arg Leu Asn Leu Thr Phe

355 360 365

Arg Gln His

370