阅读说明：本技术 治疗神经内分泌肿瘤的方法 (Method of treating neuroendocrine tumors ) 是由 戴伦·西格尔 于 2018-08-21 设计创作，主要内容包括：本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法,包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂,其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法,包括：从个体获得NET遗传物质的样品；确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。(Disclosed herein are methods of treating a neuroendocrine tumor (NET) in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an agent that inhibits a tropomyosin-receptor-kinase (Trk) protein, wherein the NET is associated with a Trk protein that undergoes a genetic translocation or a Trk protein that is an NTRK gene fusion protein. Also disclosed herein are methods of treating a neuroendocrine tumor (NET) in a subject in need thereof, comprising: obtaining a sample of NET genetic material from an individual; determining whether NET tumors comprise an NTRK translocation or gene fusion; and administering to the subject a therapeutically effective amount of an agent that inhibits a tropomyosin-receptor-kinase (Trk) protein.)

治疗神经内分泌肿瘤的方法

交叉引用

本申请要求于2017年8月22日提交的美国非临时专利申请号15/683,630的权益，该非临时申请通过引用全文并入本文。

发明背景

转移性神经内分泌肿瘤(NET)患者的中位生存期仅为33个月，其预后比以前预期的要差。据报道，在过去三十年中，NET的发病率增加了五倍，患病率达100,000分之35，NET的诊断和治疗已成为未得到满足的重要医疗需求。

发明内容

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含NTRK1、NTRK2或NTRK3酪氨酸激酶信号传导域。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白是组成性活性的。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含核酸序列，该核酸序列包含：(a)第一区域，其对应于来自MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1基因序列的序列；以及(b)第二区域，其对应于NTRK1、NTRK2或NTRK3基因序列。

在本文公开的上述方法中，在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白是ETV6-NTRK基因融合蛋白。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1多肽序列的序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，N-端多肽区域包含ETV6多肽序列。在一些实施方案中，C-端多肽区域包含TrkC多肽序列。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA多肽序列，其中C-端多肽包含TrkA激酶活性；其中融合蛋白是TP53-TrkA、LMNA-TrkA、CD74-TrkA、TFG-TrkA、TPM3-TrkA、NFASC-TrkA、BCAN-TrkA、MPRIP-TrkA、TPR-TrkA、RFWD2-TrkA、IRF2BP2-TrkA、SQSTM1-TrkA、SSBP2-TrkA、RABGAP1L-TrkA、C18ORF8-TrkA、RNF213-TrkA、TBC1D22A-TrkA、C200RF112-TrkA、DNER-TrkA、ARHGEF2-TrkA、CHTOP-TrkA、PPL-TrkA、PLEKHA6-TrkA、PEAR1-TrkA、MRPL24-TrkA、MDM4-TrkA、LRRC71-TrkA、GRIPAP1-TrkA、EPS15-TrkA、DYNC2H1-TrkA、CEL-TrkA、EPHB2-TrkA或TGF-TrkA融合蛋白。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkB多肽序列，其中C-端多肽包含TrkB激酶活性；其中融合蛋白是NACC2-TrkB、QKI-TrkB、AFAP1-TrkB、PAN3-TrkB、SQSTM1-TrkB、TRIM24-TrkB、VCL-TrkB、AGBL4-TrkB或DAB2IP-TrkB融合蛋白。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkC多肽序列，其中C-端多肽包含TrkC激酶活性；其中融合蛋白是ETV6-TrkC、BTBD1-TrkC、LYN-TrkC、RBPMS-TrkC、EML4-TrkC、HOMER2-TrkC、TFG-TrkC、FAT1-TrkC或TEL-TrkC融合蛋白。

在本文公开的上述方法中，在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是激酶抑制剂。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是恩曲替尼(entrectinib)、RXDX-102、奥曲替尼(altiratinib)、拉罗替尼(larotrectinib)、LOXO-195、西曲替尼(sitravatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、美乐替尼(merestinib)、多韦替尼(dovitinib)、克唑替尼(crizotinib)、TSR-011、DS-6051、PLX7486、来他替尼(lestaurtinib)、达鲁舍替(danusertib)、F17752、AZD6918、AZD7451或AZ-23或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是恩曲替尼。在一些实施方案中，NET是前肠NET、中肠NET或后肠NET。在一些实施方案中，NET是胃肠(gastrointestinal)NET。在一些实施方案中，NET是小肠NET(SI-NET)。在一些实施方案中，NET是大肠NET。在一些实施方案中，NET是直肠NET。在一些实施方案中，NET是胃小肠(gastric intestine)NET。在一些实施方案中，NET是胰腺NET(PNET)。在一些实施方案中，NET是支气管NET。在一些实施方案中，NET是阑尾NET、卵巢NET或甲状腺NET。在一些实施方案中，NET的原发起源未知。在一些实施方案中，原发NET已经转移到继发组织。在一些实施方案中，继发组织是淋巴结、肠系膜、肝、骨、肺或脑。在一些实施方案中，该药剂被用作初级或一线疗法。在一些实施方案中，该药剂被用作次级或挽救疗法。在一些实施方案中，个体在先前的化疗治疗方案后有稳定或进行性疾病。在一些实施方案中，先前的化疗治疗方案包括采用卡培他滨(capecitabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、链脲霉素(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、沙利度胺(thalidomide)或其任何组合的治疗。

在一些实施方案中，本文中公开的上述方法进一步包括向个体施用附加疗法。在一些实施方案中，附加疗法是抑制Trk蛋白的第二药剂。在一些实施方案中，附加疗法包括PI3K/Akt/mTOR途径抑制剂、TGF-β途径抑制剂、细胞周期抑制剂、促生长素抑制素类似物、干扰素或血管发生抑制剂。在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物是奥曲肽(octreotide)、奥曲肽酸(octreotate)、帕瑞肽(pasireotide)或兰乐肽(lanreotide)。在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物经放射性标记。在一些实施方案中，经放射性标记的促生长素抑制素类似物为[DOTA⁰,Tyr³]奥曲肽酸(镥氧奥曲肽(Lutathera))。在一些实施方案中，干扰素是I型干扰素。在一些实施方案中，I型干扰素是IFN-α。在一些实施方案中，附加疗法是依维莫司(everolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、贝伐单抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)或索拉非尼(sorafenib)。在一些实施方案中，附加疗法包括手术、化疗或放疗。在一些实施方案中，个体患有类癌综合征。在一些实施方案中，本文公开的上述方法进一步包括向个体施用针对类癌综合征的治疗。在一些实施方案中，针对类癌综合征的治疗是抗5-羟色胺剂。在一些实施方案中，抗5-羟色胺剂是促生长素抑制素类似物。在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物是奥曲肽、奥曲肽酸、帕瑞肽或兰乐肽。

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。在一些实施方案中，NET遗传物质的样品是从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤活检样品获得的总核酸。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对NET遗传物质进行测序，以确定肿瘤样品是否包含NTRK易位或基因融合。在一些实施方案中，NET遗传物质通过全基因组DNA测序、全外显子组测序、靶向DNA测序、靶向RNA测序或全转录组RNA测序进行测序。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合之前，使用NTRK1、NTRK2或NTRK3特异性引物扩增NET遗传物质。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括检测NET肿瘤样品中的NTRK表达量或Trk蛋白水平，其中NTRK表达水平或Trk蛋白水平的升高表示NTRK易位或基因融合。

在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的胃肠(GI)神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含NTRK1、NTRK2或NTRK3酪氨酸激酶信号传导域。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白是组成性活性的。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1多肽序列的序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，N-端多肽区域包含ETV6多肽序列。在一些实施方案中，C-端多肽区域包含TrkC多肽序列。

在本文公开的用于治疗GI-NET的上述方法中，在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA多肽序列，其中C-端多肽包含TrkA激酶活性；其中融合蛋白是TP53-TrkA、LMNA-TrkA、CD74-TrkA、TFG-TrkA、TPM3-TrkA、NFASC-TrkA、BCAN-TrkA、MPRIP-TrkA、TPR-TrkA、RFWD2-TrkA、IRF2BP2-TrkA、SQSTM1-TrkA、SSBP2-TrkA、RABGAP1L-TrkA、C18ORF8-TrkA、RNF213-TrkA、TBC1D22A-TrkA、C200RF112-TrkA、DNER-TrkA、ARHGEF2-TrkA、CHTOP-TrkA、PPL-TrkA、PLEKHA6-TrkA、PEAR1-TrkA、MRPL24-TrkA、MDM4-TrkA、LRRC71-TrkA、GRIPAP1-TrkA、EPS15-TrkA、DYNC2H1-TrkA、CEL-TrkA、EPHB2-TrkA或TGF-TrkA融合蛋白。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkB多肽序列，其中C-端多肽包含TrkB激酶活性；其中融合蛋白是NACC2-TrkB、QKI-TrkB、AFAP1-TrkB、PAN3-TrkB、SQSTM1-TrkB、TRIM24-TrkB、VCL-TrkB、AGBL4-TrkB或DAB2IP-TrkB融合蛋白。在一些实施方案中，NTRK基因融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkC多肽序列，其中C-端多肽包含TrkC激酶活性；其中融合蛋白是ETV6-TrkC、BTBD1-TrkC、LYN-TrkC、RBPMS-TrkC、EML4-TrkC、HOMER2-TrkC、TFG-TrkC、FAT1-TrkC或TEL-TrkC融合蛋白。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是激酶抑制剂。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是恩曲替尼、RXDX-102、奥曲替尼、拉罗替尼、LOXO-195、西曲替尼、卡博替尼、美乐替尼、多韦替尼、克唑替尼、TSR-011、DS-6051、PLX7486、来他替尼、达鲁舍替、F17752、AZD6918、AZD7451或AZ-23或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，药剂为恩曲替尼或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，胃肠NET是小肠、大肠、胰腺、阑尾、胃、直肠或未知原发起源的NET。在一些实施方案中，原发NET已经转移到继发组织。在一些实施方案中，继发组织是淋巴结、肠系膜、肝、骨、肺或脑。

在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的胃肠神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。在一些实施方案中，NET遗传物质的样品是从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤活检样品获得的总核酸。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对NET遗传物质进行测序，以确定肿瘤样品是否包含NTRK易位或基因融合。在一些实施方案中，NET遗传物质通过全基因组DNA测序、全外显子组测序、靶向DNA测序、靶向RNA测序或全转录组RNA测序进行测序。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合之前，使用NTRK1、NTRK2或NTRK3特异性引物扩增NET遗传物质。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括检测NET肿瘤样品中的NTRK表达量或Trk蛋白水平，其中NTRK表达水平或Trk蛋白水平的升高表示NTRK易位或基因融合。

援引并入

本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中特别地提出。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1A-B例示了患者的FDG-PET成像。图1A例示了就诊时患者的FDG-PET成像，揭示出在已知的疾病区域中广泛的FDG吸收，包括伴有左侧骨盆侧壁的融合性大肿块的大块髂骨淋巴结病，多处代谢过盛性肝脏病变，以及整个骨骼的无数病变。图1B例示了经2个周期的恩曲替尼治疗后患者的FDG-PET成像，显示先前融合性骨病(与右股骨近端相比)有所改善，并且骨盆淋巴结病的体积和强度有所下降。在接受恩曲替尼治疗后，在骨盆中观察到的最强烈的活动是膀胱伸长，向右侧偏移。

图2A-B例示了患者的奥曲肽扫描(octreoscan)成像。图2A例示了患者在就诊时的前向和后向奥曲肽扫描成像(前向和后向，平面)，揭示出疾病的广泛分布，包括广泛的骨骼转移和大块的骨盆淋巴结病。图2B例示了经6个周期的恩曲替尼治疗后患者的前向和后向奥曲肽扫描成像。尽管患者在肝脏、骨骼和骨盆仍显示出疾病体征，但与就诊时奥曲肽扫描相比，肿瘤负担总体上明显减轻。最大和最活性的病灶对应于大块的左侧骨盆侧壁和骶前肿块。

图3A-B例示了患者的增强的轴向腹部CT。图3A例示了在替莫唑胺和卡培他滨化疗的初步试验后获得的增强的轴向腹部CT，其显示了大块增强的左骨盆侧壁和骶前结节肿块。图3B例示了经1个周期的恩曲替尼治疗后获得的增强的腹部轴向CT，其显示了左骨盆侧壁肿块的外观发生了巨大的变化，看起来肿胀并且体积更大，但密度降低。

具体实施方式

原肌球蛋白受体激酶(Trk)家族成员TrkA、TrkB和TrkC的过度表达、激活、突变或易位在许多不同类型的癌症中都有报道，包括卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤和肺癌。在癌症的临床前模型中，Trk抑制剂在抑制肿瘤生长和肿瘤转移方面都是有效的。神经内分泌肿瘤(NET)是一种罕见的、生长缓慢的癌症形式，由分布在全身的神经内分泌细胞引起。NET整体上是一组异质性瘤，其特征可能因起源组织的不同而不同。迄今为止，对于绝大多数NET，尚未发现明确的致癌因素或分子孤雌生殖的迹象。

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

某些术语

除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与要求保护的本发明主题所属领域的技术人员普遍理解的含义相同的含义。应当理解，前述一般描述和以下详细描述仅为示例性和解释性的，并非限制所要求保护的任何主题。在本申请中，除非上下文另有明确规定，否则单数的使用包括复数。例如，如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此外，除非上下文另有明确规定，“或”的使用表示“和/或”。术语“包括”以及其他形式如“包含”的使用并不旨在仅限于所列举的项目。本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足量的药剂或化合物(例如本文所述的Trk抑制剂)，其将在某种程度上缓解正在治疗的疾病或病况的一个或多个症状。结果可以是减少和/或减轻疾病的体征、症状或病因，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，术语“有效量”或“治疗有效量”包括预防有效量。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，该误差范围将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以指在一个或超过一个标准偏差内。或者，“约”可以指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程时，该术语可指在值的一个数量级内，5倍内，更优选在2倍内。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，以指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人类。在一些实施方案中，哺乳动物包括但不限于鼠、猿猴、人类、农场动物、竞技动物和宠物。在一些实施方案中，包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。如本文所用，这些术语都不需要医疗专业人员的监督。

神经内分泌肿瘤(NET)

神经内分泌细胞是高度特化的神经样细胞，其响应于神经或化学信号释放激素。神经内分泌系统是由神经内分泌细胞的网络组成，这些神经内分泌细胞排列在单个器官中并作为弥散元素广泛分布于全身。例如，神经内分泌细胞散布在整个胃肠道中并分泌调节肠运动的激素(例如5-羟色胺)。另一方面，垂体是神经内分泌腺，其分泌调节多种生理过程(包括生长、血压和代谢)的激素(例如生长激素)。

神经内分泌肿瘤(NET)是一种罕见的、典型的由神经内分泌细胞组成的生长缓慢的瘤。NET起源于多种器官，是小肠瘤中最常见的类型。在一些情况下，NET被称为“类癌肿瘤”，通常是指起源于弥漫性神经内分泌系统，主要是胃肠道和呼吸道的NET。胃肠NET最常见的部位是小肠，最常见于回肠，但NET也经常起源于直肠、结肠、阑尾和胃。

由于缺乏标准化的命名、分期和分级系统，使得目前对NET的理解模糊不清。此外，由于NET是一种罕见的癌症形式且常常表现出非特异性的临床表现，因此在鉴别诊断中经常忽视NET。此外，即使是小NET(<2cm)也可能具有侵袭性和易转移性，给诊断临床医生带来相当大的挑战。大多数关于NET的研究都集中在最常见的部位，如胰腺和小肠，这限制了对其他不太常见疾病形式的广泛了解。

有些特征是所有NET共有的，而其他特征则归因于它们的起源器官(例如，胃肠NET在基因组上趋于稳定，而胰腺NET则经常表现出染色体不稳定性)。在这种程度的临床异质性下，NET的分子发病机理仍然难以捉摸，确切的疾病致癌因素尚未确定。尽管大多数胰脏或胃肠NET是偶发的，但许多遗传疾病是发展该疾病的风险因素。例如，1型多发性内分泌瘤(遗传性MEN1突变)、1型神经纤维瘤病(遗传性NF1突变)、von Hippel-Lindau病(遗传性VHL突变)和结节性硬化(遗传性TSC1或TSC2突变)都是增加NET可能性的疾病。

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

在一些实施方案中，NET是前肠NET、中肠NET或后肠NET。在一些实施方案中，NET是胃肠道NET。在一些实施方案中，NET是小肠NET(SI-NET)。在一些实施方案中，NET是大肠NET。在一些实施方案中，NET是胰腺NET(PNET)。在一些实施方案中，NET是阑尾NET。在一些实施方案中，NET是胃NET。在一些实施方案中，NET是直肠NET。在一些实施方案中，NET是支气管NET。在一些实施方案中，NET是卵巢NET。在一些实施方案中，NET是甲状腺NET。在一些实施方案中，NET是未知的原发NET，其中无法鉴定起源器官。在一些实施方案中，原发NET已经转移到继发组织。在一些实施方案中，继发组织是淋巴结、肠系膜、肝、骨、肺或脑。

类癌综合征

类癌综合征可发生在一些携带NET的个体，尤其是患有晚期或转移性NET的个体中。类癌综合征是由NET细胞不受调节地向血液中分泌激素而引起的，这些激素根据NET的类型而引起各种体征和症状。类癌综合征最常见的体征和症状包括皮肤潮红、面部皮肤病变、腹泻、呼吸困难和心跳加快。类癌综合征患者常出现诊断延迟或误诊，因为症状可能被误认为其他疾病，如肠易激综合征(IBS)或绝经。

在一些实施方案中，个体患有类癌综合征。在一些实施方案中，本文描述的方法进一步包括施用针对类癌综合征的治疗。在一些实施方案中，针对类癌综合征的治疗是抗5-羟色胺剂。在一些实施方案中，抗5-羟色胺剂是促生长素抑制素类似物。在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物是奥曲肽、奥曲肽酸、帕瑞肽或兰乐肽。

NTRK易位与基因融合

酪氨酸激酶受体的原肌球蛋白受体激酶(Trk或Trk)家族是多域跨膜蛋白，在广泛的神经元反应(包括生存，分化，生长和再生)中发挥重要作用。Trk受体在神经系统以及许多其他非神经元细胞类型和组织(包括单核细胞、肺、骨和胰腺β细胞)中大量表达。Trk家族有三个成员：TrkA、TrkB和TrkC，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。TrkA、TrkB和TrkC的特征为针对天然存在的神经营养蛋白的高亲和力受体，天然存在的神经营养蛋白属于蛋白生长因子家族，其中包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。成熟的神经营养蛋白以相对高的亲和力结合选择性Trk受体(例如TrkB-BDNF、TrkA-NGF和TrkC-NT-3)，导致介导神经营养蛋白功能(例如神经元生长和存活)的细胞内酪氨酸激酶信号传导级联(例如SHC-RAS-MAPK、PI3K-AKT或PLCγ-PKC)的激活。

NTRK易位与基因融合蛋白

基因融合，是将两个或更多个不同基因的完整或部分序列融合成单个嵌合基因或转录物的过程，可能是易位、缺失或倒位的结果。虽然一些基因融合产物是惰性的，不会引起明显的表型变化，但其他融合蛋白已显示具有致癌活性。在不同类型的癌症中，癌症中基因融合的发生率差异很大。例如，在50％以上的前列腺癌患者中发现了TMPRSS2-ERG融合。另外，一些基因融合，如KIF5B-RET融合，只在1-2％的肺腺癌中发现。

由翻译或基因融合事件引起的致癌活性通常是由于其中一个相关基因的失调(例如，将强启动子与原癌基因融合)，从而导致功能丧失(例如，通过截短肿瘤抑制基因)或形成具有致癌功能的融合蛋白(例如，引起酪氨酸激酶的结构性激活，如本文所述的NTRK基因)。致癌酪氨酸激酶基因融合的典型基因结构是催化激酶域(受体酪氨酸激酶的细胞内C-端区域)与来源于另一基因的N-端区域融合。所得的新癌基因由外源启动子异常表达，并可导致激酶域的结构性激活(例如，通过由N-端域介导的融合蛋白二聚化)。

NTRK基因家族是混杂的基因融合伴侣，并且已知能产生多种致癌易位和融合蛋白。在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

在一些实施方案中，NTRK易位是NTRK1、NTRK2或NTRK3基因的至少一部分向同一染色体内的另一位置的易位(包括倒位)。在一些实施方案中，NTRK易位是NTRK1、NTRK2或NTRK3基因的至少一部分向不同染色体的易位。在一些实施方案中，NTRK易位是NTRK1、NTRK2或NTRK3基因的至少一部分的易位，其导致NTRK1、NTRK2或NTRK3基因在外源启动子的转录控制下，从而导致异常的NTRK表达。在一些实施方案中，NTRK易位导致组成性活性的NTRK1、NTRK2或NTRK3基因。

在一些实施方案中，NTRK融合蛋白(也称为Trk融合蛋白)由NTRK1、NTRK2或NTRK3基因的至少一部分与另一基因的至少一部分的遗传易位产生。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含NTRK1、NTRK2或NTRK3酪氨酸激酶信号传导域。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白在外源启动子的转录控制下，导致NTRK的异常表达。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白产生组成性活性的NTRK基因。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含：对应于除TrkA、TrkB或TrkC蛋白以外的蛋白质的N-端区域和对应于TrkA、TrkB或TrkC蛋白的C-端区域。在一些实施方案中，对应于TrkA、TrkB或TrkC蛋白的C-端区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。如本文所用，短语“激酶活性”意指具有本领域技术人员所理解的激酶酶活性，并且包括例如氨基酸侧链如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的磷酸化。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白产生组成性活性的TrkA、TrkB或TrkC融合蛋白。在一些实施方案中，组成性活性的TrkA、TrkB或TrkC融合蛋白包含来自除TrkA、TrkB或TrkC以外的蛋白质的N-端区域，该N-端区域导致Trk融合蛋白二聚化。

在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含核酸序列，该核酸序列包含：(a)第一区域，其对应于来自MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1基因序列的序列；以及(b)第二区域，其对应于NTRK1、NTRK2或NTRK3基因序列。

在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含核酸序列，该核酸序列包含：(a)第一区域，其对应于来自MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1基因序列的序列的一部分；以及(b)第二区域，其对应于NTRK1、NTRK2或NTRK3基因序列的一部分。

在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含MPRIP、CD74、RABGAP1L、TPM3、TPR、TFG、PPL、CHTOP、ARHGEF2、NFASC、BCAN、LMNA、TP53、QKI、NACC2、VCL、AGBL4、TRIM24、PAN3、AFAP1、SQSTM1、ETV6、BTBD1、LYN、RBPMS、RFWD2、IRF2BP2、SSBP2、C18ORF8、RNF213、TBC1、DNER、PLEKHA6、PEAR1、MRPL24、MDM4、GRIPAP1、EPS15、DYNC2H1、CEL、EPHB2、EML4、HOMER2、TEL或FAT1多肽序列的序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA、TrkB或TrkC多肽序列，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。在一些实施方案中，NTRK融合蛋白是ETV6:NTRK融合蛋白，并且包含含有ETV6多肽序列的N-端多肽区域和含有TrkA、TrkB或TrkC多肽序列的C-端多肽区域，其中C-端多肽区域具有TrkA、TrkB或TrkC激酶活性。

在一些实施方案中，Trk融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkA多肽序列，其中C-端多肽包含TrkA激酶活性；并且其中融合蛋白是TP53-TrkA、LMNA-TrkA、CD74-TrkA、TFG-TrkA、TPM3-TrkA、NFASC-TrkA、BCAN-TrkA、MPRIP-TrkA、TPR-TrkA、RFWD2-TrkA、IRF2BP2-TrkA、SQSTM1-TrkA、SSBP2-TrkA、RABGAP1L-TrkA、C18ORF8-TrkA、RNF213-TrkA、TBC1D22A-TrkA、C200RF112-TrkA、DNER-TrkA、ARHGEF2-TrkA、CHTOP-TrkA、PPL-TrkA、PLEKHA6-TrkA、PEAR1-TrkA、MRPL24-TrkA、MDM4-TrkA、LRRC71-TrkA、GRIPAP1-TrkA、EPS15-TrkA、DYNC2H1-TrkA、CEL-TrkA、EPHB2-TrkA或TGF-TrkA融合蛋白。

在一些实施方案中，Trk融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkB多肽序列，其中C-端多肽包含TrkB激酶活性；并且其中融合蛋白是NACC2-TrkB、QKI-TrkB、AFAP1-TrkB、PAN3-TrkB、SQSTM1-TrkB、TRIM24-TrkB、VCL-TrkB、AGBL4-TrkB或DAB2IP-TrkB融合蛋白。

在一些实施方案中，Trk融合蛋白包含：(a)N-端多肽区域，其包含除TrkA、TrkB或TrkC多肽序列以外的多肽序列；以及(b)C-端多肽区域，其包含TrkC多肽序列，其中C-端多肽包含TrkC激酶活性；并且其中融合蛋白是ETV6-TrkC、BTBD1-TrkC、LYN-TrkC、RBPMS-TrkC、EML4-TrkC、HOMER2-TrkC、TFG-TrkC、FAT1-TrkC或TEL-TrkC融合蛋白。在一些实施方案中，Trk融合蛋白是ETV6-NTRK3(ETV6-TrkC)融合蛋白。

治疗方法

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

在一些实施方案中，抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂是恩曲替尼。恩曲替尼(RXDX-101/NMS-E628)是分别由NTRK1-3基因编码的TrkA、TrkB和TrkC受体酪氨酸激酶的选择性抑制剂。除了其对天然Trk蛋白的活性外，恩曲替尼还是由例如NTRK基因的遗传易位或重排产生的Trk融合蛋白的有效抑制剂。恩曲替尼还抑制ROS1和ALK蛋白以及ROS1和ALK基因融合产物。恩曲替尼是一种取代的吲唑衍生物，其化学名为N-[5-(3,5-二氟苯基)-1h-吲唑-3-基]-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(四氢吡喃-4-基氨基)苯甲酰胺。针对恩曲替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他取代的吲唑衍生物激酶抑制剂的描述参见美国专利8,299,057，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是RXDX-102(NMS-P360)。RXDX-102是可口服的选择性酪氨酸激酶抑制剂，被设计为癌基因靶向治疗候选药物，用于治疗携带TrkA、TrkB或TrkC蛋白的激活性改变的癌症患者。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是奥曲替尼(DCC-2701)。奥曲替尼是激酶抑制剂，被设计为同时阻断肿瘤细胞和肿瘤微环境中的多种癌症信号传导机制，以防止癌症的生长和扩散。奥曲替尼是MET、TIE2、VEGFR2和TrkA/B/C激酶抑制剂，其化学名为N-[4-[2-(环丙甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基-2,5-二氟苯基]-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺。针对奥曲替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他环丙基二甲酰胺化合物和类似物的描述参见美国专利8,637,672，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是拉罗替尼(LOXO-101/ARRY-470)。拉罗替尼是选择性Trk激酶抑制剂，目前在携带NTRK融合的晚期实体瘤中进行试验，其化学名为(S)-N-[5-[(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酰胺。针对拉罗替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物的描述参见美国专利8,513,263，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是LOXO-195。LOXO-195是二代选择性TRK抑制剂，表现出对TRK融合蛋白的强力抑制，并且不受某些获得性耐药突变(例如TRKAG595R、TrkA G667C或TrkC G623R)的影响，这些突变可能出现在接受拉罗替尼(LOXO-101)或具有抗TRK活性的多激酶抑制剂的患者中。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是西曲替尼(MGCD516)。西曲替尼是临床阶段、可口服的、强力的小分子激酶抑制剂，靶向一系列密切相关的酪氨酸激酶，包括RET、CBL、CHR4q12、DDR和TRK。西曲替尼有效抑制TRK融合蛋白，化学名为N-[3-氟-4-[2-[5-[(2-甲氧基乙基氨基)甲基]吡啶-2-基]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基]苯基]-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺。针对西曲替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他化合物的描述参见美国专利8,404,846，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是卡博替尼(XL184)。卡博替尼是针对RET、MET、VEGFR-1/2/3、KIT、TRKB、FLT-3、AXL和TIE-2的可口服的小分子激酶抑制剂。卡博替尼已被临床批准用于治疗患有晚期肾细胞癌(RCC)或进行性转移性甲状腺髓样癌的患者，其化学名为N-(4-(6,7-二甲氧基喹啉-4-基氧基)苯基)-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺。针对卡博替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他化合物的描述参见美国专利7,579,473，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是美乐替尼(LY2801653)。美乐替尼是可口服的小分子激酶抑制剂，干扰MET、MST1R、FLT3、AXL、MERTK、TEK、ROS1、TRKA/B/C、DDR1/2和MKNK1/2的信号转导。美乐替尼目前正在试验作为带有NTRK重排的晚期实体瘤患者的治疗，其化学名为N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺。针对美乐替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他酰氨基苯氧基吲唑化合物的描述参见美国专利8,030,302，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是多韦替尼(TKI258)。多维替尼是苯并咪唑-喹啉酮小分子激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。多维替尼与FGFR、PDGFR、VEGF、cKIT、FLT3、CSFR1、Trk和RET结合并抑制其磷酸化，目前正在临床试验用于治疗具有NTRK1易位的实体肿瘤和/或血液恶性肿瘤。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是唑替尼。唑替尼是可口服的小分子激酶抑制剂，被批准用于治疗患有局部晚期或转移性ALK阳性非小细胞性肺癌(NSCLC)的患者。唑替尼是除ALK、MET和ROS1之外还针对TRKA的抑制剂，已被用于治疗具有MPRIP-NTRK1融合的NSCLC。唑替尼的化学名为(R)-3-[1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺。针对唑替尼和可用作根据本公开内容的药剂的其他光学纯(enantiomerically pure)的氨基杂芳基化合物的描述参见美国专利8,785,632，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是TSR-011。TSR-011(Tesoro,Inc.)是针对ALK和TRK-A/B/C的可口服的小分子激酶抑制剂。TSR-011目前正在进行I/IIa期试验，用于具有NTRK改变的晚期实体瘤或淋巴瘤患者。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是DS-6051。DS-6051(Daiichi Sankyo,Inc.)是针对ROS1和TRK的可口服的激酶抑制剂。DS-6051正在早期临床试验中，用于治疗携带ROS1或NTRK基因融合的晚期实体恶性肿瘤。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是PLX7486。PLX7486(Plexxikon)是可口服的激酶抑制剂，处于早期临床试验中，用于治疗具有激活性Trk(NTRK)突变或NTRK基因融合的晚期实体恶性肿瘤。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是来他替尼(CEP-701)。来他替尼是针对FLT3、JAK2和TrkA/B/C的可口服的吲哚并咔唑衍生物激酶抑制剂。

在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂是达鲁舍替(PHA-739358)、F17752(Pierre Fabre)、AZD6918(Astra Zeneca)、AZD7451(Astra Zeneca)或AZ-23(CAS#:915720-21-7)。

上述Trk抑制剂的各种药物上可接受的盐、载体或赋形剂是可获得的，并且考虑将任何合适的药物上可接受的盐、载体或赋形剂与本文公开的Trk抑制剂一起使用。

在一些实施方案中，抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂被用作初级或一线疗法。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂被用作次级或挽救疗法。在一些实施方案中，抑制Trk蛋白的药剂被用作次级或挽救疗法，其中个体在先前的化疗治疗方案后有稳定或进行性疾病。多种化疗药剂是可获得的并且在本领域中是已知的，并且考虑将任何合适的化疗与本文公开的方法一起使用。示例性化疗治疗方案包括但不限于卡培他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素、依托泊苷、达卡巴嗪、链脲霉素、替莫唑胺、顺铂、环磷酰胺、沙利度胺或其任何组合。

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

在一些实施方案中，鉴定NTRK易位或基因融合的方法包括使用微阵列、表达序列标签(EST)作图、核型分析、细胞遗传学分析、磷酸酪氨酸信号传导筛选、磷酸蛋白质组分析、染色质相互作用分析、质量分光光度法、串联质量分光光度法分析，定量PCR(qPCR)、数字PCR、液滴数字PCR(例如Raindance RainDrop Plus^TM或Bio-Rad QX200^TMDropletDigital^TMPCR)、荧光原位杂交测定(FISH)或其任何组合。在一些实施方案中，鉴定NTRK易位或基因融合的方法包括对肿瘤遗传物质进行测序。在一些实施方案中，对肿瘤样品进行DNA测序、全基因组测序、外显子组测序或RNA测序，以确定肿瘤样品是否包含NTRK易位或基因融合。

有多种测序科技和技术可用，并且考虑将任何合适的测序技术与本文公开的方法一起使用。在一些实施方案中，测序技术是基于染料终止剂的测序方法学(例如，Sanger测序)。在一些实施方案中，测序技术是新一代测序(NGS)方法。在一些实施方案中，新一代测序方法是焦磷酸测序(例如，Roche 454系统)、合成测序(例如，Illumina的GA/HiSeq/MiSeq/NextSeq系统)、连接测序(例如，Applied Biosystem的SOLiD系统)、通过检测在DNA聚合过程中释放的氢离子而进行的测序(例如，Ion Torrent测序系统)、单分子测序(例如，Pacific Biosciences测序系统)或其任何组合。在一些实施方案中，遗传物质是DNA或互补DNA(cDNA)。在一些实施方案中，cDNA从RNA逆转录。在一些实施方案中，测序包括全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)、全基因组转录组测序(RNAseq)、靶向测序方法或其任何组合。在一些实施方案中，从分离的肿瘤遗传物质(例如，外显子组，或更优选地，含NTRK外显子)富集特定靶标。在一些实施方案中，在通过例如DNA或RNA测序来检测NTRK融合之前，扩增遗传物质。

在一些实施方案中，在进行测序(例如，通过NGS)之前，将遗传物质分解成多个核酸片段以创建测序文库。有多种文库制备技术可用，并且考虑将用于创建测序文库的任何合适的方法与本文公开的方法一起使用。在一些实施方案中，在测序之前选择多个核酸片段的大小。在一些实施方案中，多个核酸片段包含用于例如在含有不同样品的多重反应中鉴定多个片段的条形码。在一些实施方案中，条形码是分子级条形码。在一些实施方案中，条形码是样品级条形码。在一些实施方案中，对遗传物质进行测序包括对多个核酸片段的一端(单端)进行测序。在一些实施方案中，对遗传物质进行测序包括对多个核酸片段的两端(配对端或成对端)进行测序。在一些实施方案中，鉴定NTRK易位或基因融合的方法包括配对端RNA测序(PE-RNAseq)。

在一些实施方案中，高通量测序方法与用于鉴定NTRK易位或基因融合的计算工具相配合。有多种计算工具可用，并且考虑将任何合适的计算工具与本文公开的方法一起使用。示例性计算工具包括但不限于FusionMetaCaller、INTEGRATE、IDP-fusion、JAFFA、TRUP、ChildDecode、FusionCatcher、PRADA、EBARDenovo、FusionQ、iFUSE、SOAPFuse、SOAPfusion、Bellerophontes、BreakFusion、elDorado、EricScript、FusionAnalyser、FusionFinder、LifeScope、nFuse、ChimeraScan、Comrad、deFuse、FusionHunter、FusionMap、ShortFuse、SnowShoes-FTD、TopHat-Fusion、FusionSeq或其任何组合。

在一些实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)，例如通过PCR、RT-PCR、qPCR或其任何组合，来验证基因融合。

联合疗法

在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂，其中NET与经历遗传易位的Trk蛋白或为NTRK基因融合蛋白的Trk蛋白相关。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的个体的神经内分泌肿瘤(NET)的方法，包括：(a)从个体获得NET遗传物质的样品；(b)确定NET肿瘤是否包含NTRK易位或基因融合；以及(c)向个体施用治疗有效量的抑制原肌球蛋白受体激酶(Trk)蛋白的药剂。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用附加疗法。在一些实施方案中，附加疗法是抑制Trk蛋白的第二药剂(例如，本文公开的Trk抑制剂)。在一些实施方案中，NET对抑制Trk蛋白的药剂具有原发耐药性。在一些实施方案中，NET对抑制Trk蛋白的药剂产生获得性(继发性)耐药性。在一些实施方案中，对抑制Trk蛋白的药剂具有获得性耐药性的NET包含在Trk蛋白的激酶域中的突变。在一些实施方案中，激酶域中的突变是TrkAG595R或G667C突变。在一些实施方案中，激酶域中的突变位于TrkB蛋白的激酶域中，并且对应于TrkA G595R或G667C突变。在一些实施方案中，激酶域中的突变位于TrkC蛋白的激酶域中，并且对应于TrkC G595R或G667C突变。人类TrkA、TrkB和TrkC的氨基酸序列可从各种合适的数据库(例如UniprotKB数据库或GenBank)获得，并且可以利用任何合适的比对程序(例如BLAST、MUSCLE工具等)来对齐TrkA、TrkB和TrkC的激酶域。在一些实施方案中，对抑制Trk蛋白的药剂具有原发耐药性的NET被施用抑制Trk蛋白的第二药剂，其中NET对第二药剂不具有耐药性。在一些实施方案中，对抑制Trk蛋白的药剂具有获得性耐药性的NET被施用抑制Trk蛋白的第二药剂，其中NET对第二药剂不具有耐药性。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用附加疗法，其中附加疗法包括施用PI3K/Akt/mTOR途径抑制剂、TGF-β途径抑制剂、细胞周期抑制剂、促生长素抑制素类似物、干扰素或血管发生抑制剂。在一些实施方案中，干扰素是I型干扰素。在一些实施方案中，I型干扰素是IFN-α。

在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物是奥曲肽、奥曲肽酸、帕瑞肽或兰乐肽。在一些实施方案中，促生长素抑制素类似物经放射性标记。在一些实施方案中，经放射性标记的促生长素抑制素类似物为[DOTA⁰,Tyr³]奥曲肽酸(镥氧奥曲肽)。在一些实施方案中，附加疗法是依维莫司(mTor抑制剂)、坦罗莫司(mTor抑制剂)、贝伐单抗(VEGF/血管发生抑制剂)、舒尼替尼或索拉非尼(VEGF/MAPK抑制剂)。在一些实施方案中，附加疗法包括手术、化疗或放疗。

实施例

以下实施例是说明性的并且不限于本文所述的配方和方法的范围。

实施例1-用Trk抑制剂恩曲替尼治疗NET

一名之前健康的28岁男性患者出现了进行性腰痛并且与上一年相比体重减轻了11kg。他从不抽烟，偶尔喝酒，并且酷爱跑步。患者没有相关的癌症家族史。患者的实验室分析揭示，碱性磷酸酶的水平升高(406U/升；正常范围38-126U/升)，而血清嗜铬粒蛋白A(29ng/ml；正常范围<95ng/ml)、24小时尿液5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)(7mg/天；正常范围0-15mg/天)和5-羟色胺(117ng/ml；正常范围50-200ng/ml)都是正常的。

右上象限超声发现肝脏有回声肿块。计算层析X射线照相术(CT)扫描发现了低密度肝脏病变、肾上腺肿块、腹膜后和骨盆有大块淋巴结病以及弥漫性骨病。腰椎磁共振成像(MRI)揭示出广泛异常的骨髓信号，多个椎体扩张导致硬膜外侵犯。¹⁸F-氟脱氧葡萄糖正电子成像术(FDG-PET)成像显示，在已知的疾病区域内有广泛的FDG吸收，其中最大和最严重的代谢过盛疾病对应于大块的髂骨淋巴结病，伴有左侧骨盆侧壁的融合性大肿块(图1A)。可见多处代谢过盛的肝脏病变，并且整个骨骼可见无数病变(图1A)。CT引导的左髂骨活检报告了分化良好的神经内分泌癌(NET)，可能来自下部的GI来源。活检组织的免疫组织化学(IHC)染色揭示了阳性的CD56、突触小泡蛋白、嗜铬粒蛋白A、CK20和绒毛蛋白染色，而TTF1、CDX-2、CK7和CK19均为阴性。在不到3％的肿瘤细胞中观察到Ki-67 IHC染色，并且样本未见坏死。对右髂骨软组织肿块的重复的CT引导核心活检证实没有高级别组分，与最初的活检一致。铟-111奥曲肽扫描(奥曲肽扫描)揭示出疾病的广泛分布，其中增加的闪烁法(scintigraphic)活性局限于骨骼、肝脏、以及大块的腹膜后和骨盆腺病处(图2A)。

该患者分10部分接受了3000cGy的L1-S3姑息放疗以管理疼痛，然后进行了替莫唑胺和卡培他滨化疗。然而，经历三个周期的化疗后，患者表现出进行性疾病，并且轴向对比增强的腹部CT扫描显示出大块的左侧骨盆侧壁和骶前肿块(图3A)。

化疗后，从患者的淋巴结获得肿瘤活检物，制备FFPE玻片，并首先通过免疫组织化学(IHC)分析了患者NET的NTRK状况。患者肿瘤的NTRK蛋白表达改变呈阳性，随后用RNAseqNGS分析了NET。在患者的肿瘤中鉴定出ETV6:NTRK3易位，并用研究药剂恩曲替尼开始治疗，恩曲替尼是针对TrkA、TrkB和TrkC的强力的口服酪氨酸激酶抑制剂。在接受恩曲替尼治疗的第1个周期(一个月)后，患者体重增加了6kg，报告的疼痛和精力水平显著改善。轴向对比增强的腹部CT扫描(图3B)揭示左骨盆侧壁肿块的外观发生了明显变化，看起来肿胀并且测量起来更大，但与之前的扫描相比密度更低。

在接受2个周期的恩曲替尼治疗后，FDG-PET-CT显示骨盆和骶前腺病更大，但与早期扫描相比，肿瘤坏死且FDG吸收减少(图1B和图2B；与图1A和图2A相比)。经2个周期的恩曲替尼治疗后，骨骼中明显改善(图1B，比较右股骨近端和图1A中的股骨)。随后几个月的后续CT扫描显示骨盆结节肿块持续缩小。在6个月的恩曲替尼治疗后，奥曲肽扫描证实总体疾病负担明显减轻，且肝脏、骨骼和骨盆肿块的活性降低但仍然持续(图2B)。虽然骨盆和骨骼中最大的病变部位已经显示出明显的改善，但一些肝转移处产生响应，而另一些则没有。临床上，患者在8个月时继续使用恩曲替尼，体重稳定增加12kg，精力和活动正常，疼痛控制要求明显减少。没有明显的不良事件。

实施例2-使用新一代测序(NGS)平台鉴定NET中的NTRK融合基因

肿瘤活检物取自患有或怀疑患有NET的患者。制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品，并用免疫组织化学方法进行测试，以鉴定可能有NTRK基因融合或易位的患者。然后通过新一代测序，对肿瘤样品显示NTRK蛋白表达水平升高的患者进行进一步测试，以确认NTRK基因并对其进行更详细的分析。

NTRK面板是靶向测序测定，可在事先不知道融合伴侣或断点的情况下检测和鉴定NTRK1、NTRK2和NTRK3融合。面板采用锚定多重PCR(AMP^TM)来生成NGS的靶向富集文库。AMP设计用于低核酸输入，采用对已知和未知突变进行富集的单向基因特异性引物(GSP)。NTRK面板设计用于鉴定包括NTRK1外显子8和10-13(GenBank登录号:NM_002529)；NTRK2外显子11-17(GenBank登录号:NM_006180)；和NTRK3外显子13-16(GenBank登录号:NM_002530和NM_001007156)的融合。

根据制造商的说明，采用用于的NTRK方案中阐述的修改，使用Agencourt FormaPure(目录号A33342)提取试剂盒从FFPE样品中提取TNA(总核酸，即包括DNA和RNA二者)。或者，可以从新鲜的非FFPE肿瘤活检样品中提取RNA。

使用用于的NTRK试剂盒(SK0031-ILMN)，从提取自活检肿瘤的RNA或TNA生成cDNA：

步骤1：将2-250ng提取的TNA或20-250ng RNA与随机引物杂交。

步骤2：为每个样品合成cDNA的第一链。

步骤3：利用cDNA的第一链，为每个样品合成cDNA的第二链。

步骤4：作为质量控制步骤，对cDNA样品进行qPCR，以确定cDNA起始材料的品质(QC也可以在第一链合成后与第二链生成并行进行)。

步骤5：进行cDNA的末端修复/dA-加尾。

步骤6：末端修复后，使用AMPure XP珠纯化试剂盒来纯化反应混合物，然后将MBC衔接子连接至cDNA。

步骤7：连接后，用AMPure珠纯化来清理反应，并用NTRK GSP(GSP1；#SA0103)进行第一次PCR。

步骤8：然后清理反应，并根据制造商的说明，用NTRK GSP(GSP2；#SA0104)进行第二次PCR。在第二次PCR后，使用AMPure珠来纯化PCR反应混合物。

步骤9：使用KAPA Biosystems qPCR试剂盒(目录号KK4824)进行文库定量，以确定文库的浓度(假定片段长度为200bp)。定量后，将条形码化的文库以等摩尔浓度合并，并根据制造商的说明在Illumina MiSeq或NextSeq测序平台上测序。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。