一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂及其制备方法和应用 (Near-infrared light controlled oxygen supply on-demand nano diagnosis and treatment agent and preparation method and application thereof ) 是由 刘湘梅 田康 吴昊明 周严莉 赵强 黄维 刘淑娟 于 2019-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂及其制备方法和应用。该纳米诊疗试剂采用近红外光敏剂IR780和罗丹明B同时负载得到二氧化硅纳米复合材料,然后再通过聚乙烯吡咯烷酮修饰负载双氧水,得到生物相容性好、粒径小且均匀、稳定性好、并能按需供氧的纳米诊疗剂,并测试其性能。该纳米诊疗剂有利于癌细胞以及肿瘤的自供氧光动力治疗,其具有制备工艺简单、成本低以及适用范围广等技术优势,因此在生物医药、化工工业、功能材料等领域具有重要的应用前景。(The invention discloses a near infrared light control oxygen supply on-demand nano diagnosis and treatment agent, and a preparation method and application thereof. The nano diagnosis and treatment reagent adopts near infrared photosensitizer IR780 and rhodamine B to load simultaneously to obtain a silicon dioxide nano composite material, then polyvinyl pyrrolidone is used for modifying and loading hydrogen peroxide to obtain the nano diagnosis and treatment reagent which has good biocompatibility, small and uniform particle size and good stability and can supply oxygen according to needs, and the performance of the nano diagnosis and treatment reagent is tested. The nano diagnosis and treatment agent is beneficial to the self-oxygenation photodynamic therapy of cancer cells and tumors, has the technical advantages of simple preparation process, low cost, wide application range and the like, and has important application prospect in the fields of biological medicine, chemical industry, functional materials and the like.)
技术领域
本发明属于纳米材料的制备技术和特种材料技术领域，具体涉及一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
半个世纪以前，癌症对中国人来说还是一个陌生的词汇。但短短五十年，癌症已成为和人们关系最为密切的疾病之一，发病率和死亡率都位居“前三甲”。由国家癌症中心主任赫捷院士牵头完成的《2015年中国癌症统计》预计，中国2015年新增429.2万癌症病例，癌症死亡病例或超过281.4万。
缺氧是实体肿瘤的一个标志类型特征，但是这和高效PDT的条件是相悖的，所以肿瘤的缺氧环境是限制实体肿瘤中的一个主要因素。除此之外，光动力治疗过程中消耗氧气从而使得肿瘤组织处缺氧情况进一步加剧，导致肿瘤缺氧的状态会持续存在。在光动力治疗过程中可能会对肿瘤微区的血管造成伤害，血管的损伤导致氧气运输障碍进一步加剧组织缺氧。目前为止，科研工作者已经探索出一些方法来改善影响光动力疗效的氧气浓度，例如通过增加血管密度、扩张血管来增加氧运输量。但是实验结果证明肿瘤组织处的内源性的过氧化氢含量不足以提供治疗所需的氧气，而外源性的氧气也很难运输到肿瘤组织处。
专利CN109395081A公开了一种能近红外光激发和自供氧的纳米光动力试剂，采用近红外的具有光动力效果和光热效果的光敏剂IR780作为光热和光动力治疗试剂，采用小尺寸的海胆状的二氧化锰纳米材料作为纳米平台，同时采用牛血清蛋白包覆；该发明中复合纳米材料通过二氧化锰纳米粒子与肿瘤内源性的过氧化氢反应改善氧浓度。虽然该专利能够缓解肿瘤组织的乏氧环境，但是不能为肿瘤组织定点定时提供氧气。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂，既能改善近红外光敏剂的生物相容性，又能使该纳米诊疗剂按需供氧改善组织乏氧问题，也能够通过近红外光敏剂的有效递送实现深层光动力治疗。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂，是将近红外染料、荧光染料通过原位共混负载在二氧化硅纳米材料中，再将聚乙烯吡咯烷酮、双氧水依次负载在二氧化硅纳米材料表面的纳米材料。
优选地，所述近红外染料为近红外光敏剂IR780；
优选地，所述荧光染料为罗丹明B(RB)。
优选地，所述二氧化硅纳米材料的粒径为60～80nm。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮的相对数均分子量为28K～40K。
优选地，所述双氧水的浓度为5.9mol/L～10.58mol/L。采用外加的足量的H2O2，能够为纳米诊疗剂提供足够的氧气，补充肿瘤组织处的内源性的H2O2含量不足的缺点；如果H2O2的浓度过高，负载在PVP外层的H2O2的量会达到饱和，造成H2O2的浪费；如果H2O2的浓度过低，会使肿瘤组织处的氧气供应不足，达不到治疗效果。
发明人通过原位掺杂将近红外光敏剂IR780和罗丹明B负载在二氧化硅纳米粒子中，所制备的纳米粒子具有分子释放、结构坍塌的能力，这将有利于光敏剂的肿瘤深层穿透；再在纳米粒子表面通过PVP、双氧水依次负载在纳米粒子表面，得到纳米诊疗剂。该纳米诊疗剂不仅改善了光敏剂IR780的生物相容性，同时能按需供氧改善组织乏氧问题，也能够通过光敏剂的有效递送实现深层光动力治疗。因此，该纳米诊疗剂将有利于自供氧光动力治疗和光热治疗。
本发明还提供了上述一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：室温下将20～30mg近红外光敏剂IR780和8～12mg罗丹明B溶解在无水乙醇中，并搅拌25～45min；
S2：室温下将70～100uL的四乙氧基硅烷缓慢滴加到步骤S1制备的溶液中，并搅拌20～30min；
S3：室温下将3～5mL氨水迅速加入到步骤S2制备的溶液中，在600r/min的搅拌速度下反应20～24h，再用超纯水对产物离心洗涤3次并干燥；得到纳米粒子固体产物；
S4：室温下将4mg步骤S3制得的纳米粒子固体产物溶解在2mL的超纯水中，将16～20mg的聚乙烯吡咯烷酮溶解在2mL的超纯水中，将纳米粒子溶液逐滴加入到聚乙烯吡咯烷酮的超纯水溶液中，并搅拌8～12h；
S5：室温下将步骤S4的产物分散在双氧水溶液中，搅拌3～6h，得到最终产物。
优选地，上述制备方法步骤S1中，所述近红外光敏剂IR780和罗丹明B的质量比为5：2。如果罗丹明B过低时，在罗丹明B从二氧化硅纳米粒子内部释放后，不足以使二氧化硅纳米粒子坍塌，不能完全分解二氧化硅纳米粒子；当罗丹明B质量过高时，会使掺杂的近红外光敏剂IR780的量变低，不能实现高效的光动力治疗。
优选地，上述制备方法步骤S4中，所述纳米粒子固体产物和PVP的质量比为1：4～6。当PVP的含量过少时，近红外光敏剂IR780的相容性差；当PVP的含量过高时，所制备的纳米诊疗剂复合纳米粒子的粘结性很强。
本发明提供的一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂，用于光动力、光热材料和荧光材料在癌细胞和肿瘤的荧光成像指导的自供氧光动力治疗和光热治疗中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所述纳米诊疗剂不仅能够提高光动力治疗的效果，更重要的是该纳米诊疗剂是通过光热转换材料控制氧气的定点定时释放，能够有效用于癌细胞和肿瘤的诊疗中，具有较好的体内生物医学应用前景；
2.本发明所述的纳米诊疗剂作为一个良好的热控按需供氧智能材料，能够有效改善肿瘤的乏氧情况，增强光动力治疗；同时改善了近红外光敏剂IR780的生物相容性以及递送效率问题，同时所述复合纳米材料改善了光动力治疗中光的穿透深度问题；
3.本发明所述的复合纳米粒子水合粒径小、生物相容性好、比表面积高，在可视化指导的光动力治疗方面具有良好的应用前景；
4.所述功能化的复合纳米材料原料丰富、易于制备、适用范围广、可用于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的纳米诊疗剂的透射电子显微镜图；
图2为对比例1制备的纳米诊疗剂的透射电子显微镜图；
图3为对比例2制备的纳米诊疗剂的透射电子显微镜图；
图4为实施例1制备的纳米诊疗剂的复合纳米粒子的水合粒径图；
图5为实施例1制备的纳米诊疗剂的复合纳米粒子的紫外可见吸收光谱图；
图6为实施例1制备的纳米诊疗剂的复合纳米粒子光热能力测试图
图7为实施例1制备的纳米诊疗剂在激光触发氧气释放的荧光光谱图；
图8为实施例1制备的纳米诊疗剂在水浴加热触发氧气释放的荧光光谱图；
图9为实施例1制备的纳米诊疗剂的不同条件的单线态氧产生图；
图10为应用例8中双氧水浓度不同的单线态氧产生图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供的一种近红外光控制按需供氧纳米诊疗剂，其制备方法如下：
S1：室温下将25mg近红外光敏剂IR780和10mg罗丹明B溶解在75mL无水乙醇中，并搅拌30min；
S2：室温下将80uL的四乙氧基硅烷缓慢滴加到步骤S1制备的溶液中，并搅拌30min；
S3：室温下将4mL氨水迅速加入到步骤S2中，在600r/min的搅拌速度下反应24h，并用超纯水对产物离心洗涤3次并干燥；
S4：室温下将4mg步骤S3制得的产物溶解在2mL的超纯水中，将20mg相对数均分子量为40K的聚乙烯吡咯烷酮溶解在2mL的超纯水中，将纳米粒子的溶液逐滴加入到聚乙烯吡咯烷酮的超纯水溶液中，并搅拌10h；
S5：室温下将S4的产物分散在浓度为10mol/L的4mL的双氧水溶液中，搅拌4h，得到最终产物纳米诊疗剂；
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，S5：双氧水的浓度为2.9mol/L；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，S5：双氧水的浓度为5.9mol/L；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于，S5：双氧水的浓度为10.58mol/L；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于，S5：双氧水的浓度为11.17mol/L；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，S4：所加入的聚乙烯吡咯烷酮为40mg；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，S1：室温下将24mg近红外光敏剂IR780和16mg罗丹明B溶解在无水乙醇中，并搅拌30min；其余步骤与实施例1一致，制备纳米诊疗剂。
为了更好地理解本实施例获得的目标物质的性能，通过以下测试进行表征：
应用例1
对实施例1-5和对比例1-2制备的纳米诊疗剂的形貌和粒径分布测试
具体测试步骤是：取15μL浓度为0.1mg/mL的纳米诊疗剂的样品溶液滴在铜网上，待样品干燥后进行形貌测试。
图1为实施例1中纳米诊疗剂的复合纳米粒子的透射电子显微镜图，图1为在水中透析8天的透射电子显微镜图，从图中可以看出，复合纳米粒子的粒径为70-100nm，从图1的透射电子显微镜图示结果可以看出本发明提供的复合纳米试剂的单分散性良好，粒径分布均一，且纳米粒子之间无粘结；实施例2-5的形貌和粒径分布与实施例1的类似，这里将不再对图作出重复。
图2为对比例1制备的纳米诊疗剂透射电子显微镜图，从复合纳米粒子的电镜图可以看出，当采用步骤S4中纳米粒子固体产物和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：10时，纳米粒子之间粘连比较严重。
图3为对比例3制备的纳米诊疗剂透射电子显微镜图，从左到右依次为在水中透析1天，5天，8天后的透射电子显微镜图；从复合纳米粒子的电镜图可以看出，透析1天时纳米粒子的形貌几乎没有变化，5天时表层结构开始破坏，8天时基本结构已经坍塌。
应用例2
对实施例1-5和对比例1-2的纳米诊疗剂的水合粒径进行测试
具体测试为：取2mL浓度为0.2mg/mL的样品于石英比色皿中，进行水合粒径的测试。图4为实施例1中纳米诊疗剂的复合纳米粒子的水合粒径图，从图中可以看出，实施例1中水合粒径分布为70-100nm，从水合粒径测试结果分析可知所制备的复合纳米粒子单分散性良好，且粒径分布较为均匀。
实施例2-5和对比例1-2的水合粒径分布与实施例1的类似，这里将不再对图作出重复。
应用例3
对实施例1-5和对比例1-2的纳米诊疗剂进行紫外可见光谱测试
具体测试步骤是：分别取2mL样品水溶液和近红外光敏剂IR780材料的无水乙醇溶液以及荧光染料罗丹明B的水溶液于比色皿中，测得三种材料的紫外可见吸收光谱。
图5为实施例1中纳米诊疗剂的复合纳米粒子的紫外可见吸收光谱图，由图5可知,复合纳米粒子的的吸收峰与近红外光敏剂IR780以及罗丹明B的吸收峰一致，说明纳米粒子成功吸附了光敏剂IR780和荧光染料罗丹明B。
实施例2-5和对比例1-2的紫外可见吸收光谱图与实施例1的类似，这里将不再对图作出重复。
应用例4
对实施例1-5和对比例1-2的纳米诊疗剂进行光热测试
具体测试步骤是：所述复合纳米粒子材料配制成两种浓度的溶液(0和150ug/mL)，在785nm的激光器下用1W/cm2的功率光照6min，得到两种不同浓度的材料的温度随时间的变化曲线。
图6为实施例1中复合纳米粒子的光热能力测试图。所得到的两种不同浓度的材料的温度随时间的变化曲线如图6所示，从图6可知，本发明所制备的复合纳米粒子具有明显的光热效应。
实施例2-5和对比例1-2的光热测试图与实施例1中浓度为150ug/mL的曲线类似，这里将不再对图作出重复。
应用例5
对实施例1-5和对比例1-2的纳米诊疗剂在进行激光照射下氧气释放性能测试
具体实验步骤是：首先配置复合纳米粒子的水溶液(150ug/mL)，然后在溶液中通入30min氮气除去溶液中的氧气，并加入已经除氧的氧气探针(RDPP)的乙醇溶液100uL(5×10-6M)，并使用液体石蜡封口，使用波长为785nm的激光器，功率为1W/cm2，每次照射60s，照射6次，测试氧气探针RDPP的荧光强度。
图7为实施例1中纳米诊疗剂在激光触发氧气释放的发射光谱图；分析测试结果图可以发现随着光照时间的增加，RDPP的荧光逐渐下降，表明产生的氧气逐渐增多。
实施例2-5和对比例1-2的在激光照射下的光热测试图与实施例1的类似，这里将不再对图作出重复。
应用例6
对实施例1-5和对比例1-2的纳米诊疗剂在进行水浴加热触发氧气释放性能测试
具体实验步骤是：首先配置复合纳米粒子的水溶液溶液(150ug/mL)，然后在溶液中通入30min氮气除去溶液中的氧气，并加入已经除氧的氧气探针(RDPP)的乙醇溶液100uL(5X 10-6M)，并使用液体石蜡封口。使用温度为50℃的水浴锅对其进行加热，间隔5min对RDPP的荧光强度进行跟踪测试。
图8为实施例1中纳米诊疗剂在水浴加热触发氧气释放的荧光光谱图；分析测试结果图可以发现随着加热时间的增加RDPP的荧光逐渐下降，表明产生的氧气逐渐增多。通过和图5对比可以发现，水浴加热的情况下氧气产生的速度明显低于激光光照产热，这是由于激光照射为内部加热速度较快，而水浴加热为外部加热所致。
实施例2-5和对比例1-2的在水浴加热触发的光热测试图与实施例1的类似，这里将不再对图作出重复。
应用例7
对实施例1和对比例1-2的纳米诊疗剂单线态氧测试
具体实验步骤是：首先配置除氧的未负载双氧水的纳米材料的水溶液(150ug/mL)，然后配置负载双氧水的复合纳米粒子的水溶液(150ug/mL)，水浴加热30min后，使用波长为785nm的激光器，功率为50mW/cm2，每次照射60s,照射6次，依DPBF作为单线态氧指示剂。
图9为实施例1制备的纳米诊疗剂的不同条件的单线态氧产生图，可以发现未负载双氧水的溶液中DPBF吸收强度几乎没有下降，而负载了双氧水的溶液光照时间的增加单线态氧的产量逐渐提高，在350s后，仍能持续释放氧气，说明在癌细胞和肿瘤治疗时，双氧水负载在复合纳米粒子的外层，能够使纳米诊疗剂控制氧气的定点定时释放。
对比例1的单线态氧测试与实施例1中的负载双氧水的复合纳米粒子的水溶液的曲线类似，这里将不再对图作出重复。对比例2中复合纳米粒子的单线态氧测试与实施例1中的未负载双氧水的复合纳米粒子的水溶液的曲线类似，这里将不再对图作出重复。
应用例8
对实施例1-5的纳米诊疗剂单线态氧测试
具体实验步骤与应用例7一样。
图10为在实施例1-5的纳米诊疗剂和未加载双氧水的纳米诊疗剂在光照时间360s后单线态氧测试图，可以发现未负载双氧水的溶液中DPBF吸收强度几乎没有下降，而负载了双氧水的溶液随着双氧水浓度的增加，单线态氧的产量逐渐提高，当双氧水的浓度为2.9mol/L时，纳米诊疗剂释放的氧气含量比较低，导致治疗效果不显著；当双氧水的浓度为5.9mol/L-10.58mol/L，单线态氧的产量逐渐提高，且处于一个很高的含量，能够有效用于癌细胞和肿瘤的诊疗中；继续增加双氧水的浓度为11.17mol/L时，单线态氧的产量达到一个饱和值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。