阅读说明：本技术 具备骨诱导活性的同种骨修复材料及其制法及其用途 (Allogeneic bone repair material with bone induction activity and preparation method and application thereof ) 是由 尹曼莉 王耀宏 张娟 李晶 张顺聪 于 2019-02-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种同种骨修复材料。具体地本发明提供了一种纤维状同种骨材料和该同种骨材料的制备方法和使用方法。本发明的同种骨修复材料具备骨诱导活性并保留了大量哈氏系统结构。(The invention provides an allogeneic bone repair material. In particular to a fibrous same bone material and a preparation method and a use method thereof. The allogeneic bone repair material has bone induction activity and reserves a large number of Hastelloy system structures.)

具备骨诱导活性的同种骨修复材料及其制法及其用途

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体地涉及具备骨诱导活性的同种骨修复材料及其制法及其用途。

背景技术

社会人口老龄化、交通事故、自然灾害等原因造成的骨组织损伤的发病率剧增，已经严重危害人类的生命健康。因此，对于骨缺损的修复已经成为近年来医学界不断深入研究的课题。

自体骨移植被称为骨移植方面的“金标准”，因为它不会引起排斥反应、能与宿主组织完美融合，但同时也存在明显的不足。自体骨移植一般取自患者髂骨，来源十分有限，而且容易引起并发症、增加患者痛苦。

同种骨的移植具有悠久的历史，大量临床试验证实同种骨移植的成功率接近自体骨。随着同种骨的大量应用，越来越多的品种和工艺制备得到不断完善和创新。

脱矿骨基质(demineralized bone matrix,DBM)是一种由胶原蛋白、非胶原蛋白以及较低浓度的生长因子等组成的复合物天然骨移植材料。1965年，Urist首次在DBM中发现可以诱导骨形成的物质，并将其定义为骨形态发生蛋白(bone morphogeneticproteins,BMP)。研究表明，DBM植入物是有效的、比较理想的骨修复支架材料。

由于其来源于新鲜同种异体骨，容易引起的免疫排斥反应，是移植失败的主要原因，因此需要对其进行降抗原处理。然而，脱钙骨基质的抗原性与骨诱导性具有共同的物质基础，在消除抗原性的同时也破坏了诱导成骨物质。

目前，DBM材料为粉末状或片状，使用效果尚难以令人满意。

综上所述，本领域迫切需要开发一种新的既具有优异骨修复性能、又具有低或无免疫原性的骨修复材料。

发明内容

本发明的目的就是一种新的既具有优异骨修复性能、又具有低或无免疫原性的骨修复材料。

在本发明的第一方面，提供了一种同种骨修复材料，所述同种骨修复材料为纤维状同种骨材料。

在另一优选例中，所述同种骨修复材料为带状同种骨材料。

在另一优选例中，所述同种骨材料具有哈氏系统结构。

在另一优选例中，所述同种骨材料的厚度δ为0.001～2mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的厚度δ为0.02mm-1mm；优选地，所述的骨纤维的厚度δ为0.05～0.5mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的平铺面积S为0.9～120mm²。

在另一优选例中，所述同种骨材料的平铺面积与厚度的比值即S/δ的值为3～12000。

在另一优选例中，所述同种骨材料的平铺面积与厚度的比值为9～5000；优选地为9～1000；更优选地为9～500或9～300。

在另一优选例中，所述同种骨材料的长度范围(L范围)为0.1～200mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的长度范围为0.9～120mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的平均长度为20～100mm。

在另一优选例中，约50％～90％的同种骨材料的长度L为30～80mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的宽度W为0.2～10mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的平均长度为20～100mm。

在另一优选例中，约50％～90％的纤维状同种骨材料的长度L为30～80mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料的宽度W为0.5～5mm；更优选地，为0.5～2mm。

在另一优选例中，所述同种骨材料为干燥的。

在另一优选例中，所述同种骨材料的含水量为约1-5wt％，较佳地1.5-4wt％。

在另一优选例中，所述同种骨材料在复水后，呈半透明状，和/或呈浅白色至暖白色。

在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述的同种骨修复材料的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供经预处理的同种骨；

(2)将经预处理的同种骨加工成纤维状，得到纤维状同种骨；

(3)对步骤(2)得到纤维状同种骨进行脱矿处理，得到经脱矿的同种骨；和

(4)清洗，和/或干燥步骤(3)得到的经脱矿的同种骨，得到所述同种骨修复材料。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述的清洗为用PBS，和/或水(优选地为纯水)清洗。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述的清洗为用PBS清洗1～20次后，在用水清洗3～20次。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述的干燥为冷冻干燥。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-20℃。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述冷冻干燥的时间为1～14天。

在另一优选例中，步骤(1)中所述的经预处理的同种骨由同种骨原料通过预处理步骤得到，且所述预处理步骤包括：

(a)提供同种骨原料：

(b)去除所述同种骨原料的软组织，得到去除软组织的同种骨；和

(c)对所述去除软组织的同种骨进行脱脂处理和病毒灭活处理，得到经预处理的同种骨。

在另一优选例中，所述的同种骨原料为新鲜尸体骨。

在另一优选例中，步骤(c)中，所述脱脂处理为通过清洗进行脱脂处理

在另一优选例中，步骤(c)中，所述清洗为超声清洗。

在另一优选例中，步骤(c)中，所述脱脂处理的处理时间为1～7天。

在另一优选例中，所述脱脂处理和病毒灭活处理可以同时进行或者依次进行。

在另一优选例中，进行脱脂处理后再进行病毒灭活处理，或者进行病毒灭活处理后再进行脱脂处理。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的脱矿处理为用稀盐酸进行脱矿处理。

在另一优选例中，所述稀盐酸为0.1M-1M的盐酸水溶液。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述脱矿处理的处理时间为0.1～96h；优选地，为0.1-24h。

在本发明的第三方面，提供了如第一方面所述的同种骨修复材料的使用方法，包括步骤：将如第一方面所述的骨修复材料与复水用液体混合复水，得到复水后的骨修复材料。

在另一优选例中，所述复水用液体为生理盐水。

在另一优选例中，所述骨修复材料与生理盐水的用量比(g:ml)为1：(1～10)；优选地，为1:(3～7)。

在另一优选例中，所述的方法还包括：将复水后的骨修复材料与额外的治疗剂进行混合，从而形成用于骨修复的制剂，其中，所述的额外的治疗剂选自下组：BMP、细胞因子、成骨细胞、干细胞、抗生素、骨水泥、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法还包括：将复水后的骨修复材料与自体血液和/或自体骨碎片进行混合。

在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。

在本发明的第四方面，提供了一种促进新骨和/或骨髓形成的方法，所述方法包括步骤：

(i)将如第一方面所述的骨修复材料与复水用液体混合复水，得到复水后的骨修复材料；和

(ii)将复水后的骨修复材料植入对象所需部位。

在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。

在本发明的第五方面，提供了一种所述同种骨修复材料的用途，用于促进新骨和/或骨髓形成。

在另一优选例中，所述同种骨修复材料用于骨缺损、骨不连和/或骨延迟愈合或不愈合的填充修复。

在另一优选例中，所述同种骨修复材料用于脊柱融合、关节融合和/或矫形植骨修复。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了本发明不同厚度的同种骨修复材料复水后的效果。

图1B显示了本发明的同种骨修复材料复水后的效果。

图2为不同厚度的同种骨修复材料、普通松质骨粒的细胞毒性实验结果图。

图3为不同厚度的同种骨修复材料、普通松质骨粒的共同培养细胞形态图。

图4为不同厚度脱矿骨纤维在裸鼠体内异位成骨HE染色结果图。

图5显示了已被植入同种骨修复材料样品的裸鼠。

图6显示了本发明同种骨修复材料的样品。

图7显示了图6同种骨修复材料复水后的样品。

图8为本发明同种骨修复材料的骨纤维扫描电镜图片(×100)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入地研究，首次开发了一种纤维状的同种骨修复材料。具体地，本发明的同种骨修复材料通过其特殊的纤维状同种骨材料从而保留了皮质骨天然微结构，每根骨纤维均含有数量较多的哈氏系统结构，从而为骨传导创造了优良的微环境。此外，本发明同种骨修复材料不仅保留了促进骨形成的结构，还保留了一些促进骨形成的成分，且一些成分暴露于本发明骨修复材料的表面或位于浅层，从而在植入骨缺损部位后可通过骨传导及骨诱导等方式有效促进成骨，并且促进完成爬行取代后与周围组织形成结合最终完成骨修复。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“脱钙骨基质”、“脱矿骨基质”可互换使用，指由同种异体骨经脱钙处理后，形成的免疫原性降低的骨移植材料。

如本文所用，术语“纤维状”和“带状”可互换使用，指本发明第一方面所述的同种骨修复材料的外形。

如本文所用，术语“平铺面积”是指，取本发明第一方面所述的同种骨修复材料中，并将其平铺后的面积。

如本文所用，长度、宽度、厚度和平铺面积均是指未复水的同种骨修复材料的尺寸。

同种骨修复材料

本发明提供了一种同种骨修复材料，所述同种骨修复材料为纤维状(或称带状)同种骨材料。

在一个优选例中，如图6所示，本发明的未复水的同种骨修复材料呈带黄光的白色。

在一个优选例中，如图7所示，将单条同种骨材料复水后并展开平铺后，该同种骨材料的平铺面基本呈长方形或正方形(边缘可以是平整的或不平整，例如边缘为毛边或齿边)。

优选地，所述同种骨材料的平铺面的长度为0.1～200mm(更优选地，长度为0.9～120mm)；优选地，其平铺面的宽度为0.2～10mm(更优选地，为0.5～5mm)。

本发明的同种骨修复材料可以方便地进行复水处理，并且经复水后仍具有优异的机械性能(尤其具有优异的柔软性)，并且多条同种骨修复材料可方便地形成各种所需的形状，从而适用于各种不同形状的骨修复部位。通常，复水后单条同种骨材料呈带状(且在一些情况下，该带状的长度L和宽度W基本相同)，且柔软可随意弯曲，呈半透明，且为白色。复水成团后，本发明的同种骨修复材料呈乳白色至米黄色。

本发明的所述同种骨材料具有哈氏系统结构，其中，包括完整的或不完整的哈氏系统结构；更优选地，每1mm²截面的同种骨材料通常可见(或存在)0.2-10个哈氏系统结构。

同种骨修复材料的的制备方法

本发明提供了一种同种骨修复材料的的制备方法，所述制备方法包括步骤：

将新鲜的同种骨(如尸体骨)去除软组织；经清洗(如1～7天)和病毒灭活后得到经预处理的同种骨；

通过机械加工将经预处理的同种骨制成纤维状(优选地，长度小于200mm(如0.9mm～120mm)；和/或，厚度小于3mm(如0.01mm～2mm，优选地，0.03～1mm；更优选0.05～0.7mm))；

对制成纤维状的同种骨利用稀盐酸脱矿(如脱矿0.1h～96h)；

随后用PBS清洗(如清洗1～20遍)；

随后用纯化水清洗(如清洗3～20遍)

冷冻干燥(温度-80℃～-20℃，和/或时间1～14天)。

同种骨修复材料的用途

本发明提供了所述同种骨修复材料用于促进新骨和/或骨髓形成的用途。

本发明还提供了所述同种骨修复材料用于骨缺损、骨不连和/或骨延迟愈合或不愈合的填充修复的用途，和/或用于脊柱融合、关节融合和/或矫形植骨修复的用途。

同种骨修复材料的使用方法

本发明的同种骨修复材料的使用方法为：将脱矿骨纤维放入无菌器皿内，按1g产品加入5ml复水用液体的比例加入复水用液体(如无菌生理盐水)复水至自粘成团状，然后植入准备好的植骨床。

优选地，在植入前，将患者血液或准备骨创面时得到的自体骨碎片与本发明的同种骨修复材料混合，以获得更好的效果。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的同种骨修复材料保留了皮质骨天然微结构，每根骨纤维都含有数个完整及非完整的哈氏系统结构，为骨传导创造力良好的微环境。

(b)本发明的同种骨修复材料保留了大量具有活性的BMP等骨形态发生蛋白，并且这些骨形成蛋白位于表面或浅层，因此具有优异的的骨诱导效果，可有效促进大量新骨和骨髓的形成。

(c)本发明的同种骨修复材料的免疫原性非常低或几乎没有，不易引起免疫排斥反应。

(d)本发明的同种骨修复材料复水成团效果好，可以方便地形成与修复部位对应的形状。

(e)本发明的同种骨修复材料在复水后具有优秀的塑形能力适用于不同部位的骨修复，且复水速度快(一般仅需1-5min时间就可完成复水)，吸水率≥300wt％(远远优于颗粒状的同种骨骨修复材料)，复水后有优良的柔韧性和机械强度。

(f)稳定性好，在室温条件下的保质期至少3年以上。实验表明，本发明的同种骨修复材料在室温、密封条件下保存6个月后，相比于刚制备得到的样品在外观、含水量、钙含量、酸碱度均无变化调节。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料

材料：新鲜同种骨

实施例1

制备同种骨修复材料

制备方法：

将新鲜的同种骨去除软组织，超声清洗脱脂、病毒灭活后，获得经清洗脱脂和灭活的同种骨。

利用机床，将所述经清洗和灭活的同种骨加工成预定纤维状(见表1)。

然后，用稀盐酸对纤维状的同种骨材料进行脱矿处理。对经脱矿后的纤维状同种骨材料，用PBS清洗和纯水清洗。

对清洗后的同种骨材料，进行冷冻干燥处理(温度为约-80℃～-20℃)，从而得到冻干的同种骨修复材料。

表1

注：表中所述长度为平均值。

测试例

(1)复水成团效果

测试方法：分别取实施例1中制备的各个同种骨修复材料各1克，分别加入5ml无菌生理盐水观察成团效果。

结果：

实施例1中1#-15#的同种骨修复材料均可复水成团。部分复水成团的照片如图1A所示。结果表明，本发明的所述同种骨修复材料具有优异的复水成团性能，其中，厚度为0.05-0.5mm的同种骨修复材料的复水性能、操作性能等综合性能最佳。

图1B中显示了当复水后的同种骨修复材料通过镊子夹取时，仍保持团聚状态，这表明本发明的复水后同种骨修复材料具有优异的可塑性且具有操作便利性，这远远优于常规的颗粒状骨修复材料。

(2)含水量

测试方法：将水分测定仪设定在90℃，加一个天平秤盘，预热至自动停止，冷却至室温。用镊子快速将样品均匀铺洒在秤盘上，盖水分测定仪罩，待水分测定仪数值稳定后读取初始质量值W0。设定温度为90℃，时间为10～15分钟，并开启加热。当样品测定读数停止变化时，立即读取含水量。

结果：经测试，实施例1中1#-15#的同种骨修复材料的含水量为在1～4％范围内。

(3)酸碱度

测试方法：称取2g～10g样品浸泡入20倍容积新煮沸并放冷的纯化水(pH 5.5～7.0)，超声震荡10分钟后静置10分钟，利用酸度计测定其上清液的pH值,重复三次，取平均值。

结果：经测试，实施例1的所有同种骨修复材料的pH均为5.5～7.5。

(4)钙含量

测试方法：取0.5g冻干的脱矿骨纤维产品(即同种骨修复材料)，置入100mL容量瓶中，加5mL浓HNO₃，微波190℃消解18分钟，定容至100mL；取溶液1.5mL加入等离子发射光谱仪(ICP)进行检测，读取数值；重复三次，取平均值。

结果：经测试，实施例1中所有同种骨修复材料的钙含量均小于8％

(5)细胞毒性试验

样品1即实施例1的2#同种骨修复材料、样品2即实施例1的8#同种骨修复材料，样品3为市售普通松质骨粒。

对照(Control)为单纯培养基加MSC细胞。

测试方法：以含血清的MEM培养基为浸提介质，按照0.1g/mL的比例，在(37±1)℃条件下浸提24h，根据GB/T 16886.5-2017附件C中规定的MTT法进行试验。

结果：测试结果见图2及图3，从图2中可以看出脱矿骨纤维的的体外细胞毒性安全性级别明显强于普通松质骨粒子，从图3可以看出三种样品对细胞形态均无影响，细胞饱满，疏松贴壁无明显大面积凋亡现象(视野中黑色物质为未离心干净的骨纤维材料)。

就细胞生长密度而言，样品1≈样品2≥样品3，即样品1≈样品2的细胞生长密度高，而普通松质骨粒的浸提液内细胞生长密度较低。

(6)骨诱导活性

样品准备：将实施例1中制得的成品同种骨修复材料(厚度0.05mm、0.2mm)放入无菌器皿内，按1g产品加入5ml复水用液体的比例加入无菌生理盐水复水至自粘成团状。

测试方法：腹腔注射麻醉裸大鼠，取3只在后大腿肌间袋状空隙处左右侧植入样品(植入位置如图5中圆圈所示)，术后4周处死裸鼠，观察植骨处局部反应，取出植入骨，每块植入骨取一部分固定、包脉、组织学观察。

结果：测试结果见图4(A组为0.05mm厚，B组为0.2mm厚)，从图4可以看出有大量新骨和骨髓生成，说明实施例1的同种骨修复材料具有明显的骨诱导作用。

(7)扫描电镜测试

取实施例1的11#的同种骨修复材料，并通过电子显微镜进行观察，结果如图8所示，由图8中看出该同种骨修复材料保留了多个完整的或不完整的哈氏系统结构。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。