用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用
阅读说明：本技术 用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用 (Yolk antibody for inhibiting human enterovirus 71, preparation method and application thereof ) 是由 张秀芳 杨昌顺 于 2020-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用,其中抗原为含有EV71病毒VP1抗原,其为将VP1蛋白对应的核苷酸序列经优化后,克隆到pET28a,pET30或pColdII原核表达载体内,经原核表达菌BL21,Rosetta或OrigamiB表达得到的含有EV71病毒VP1抗原,将该抗原免疫产蛋母鸡得到含卵黄抗体鸡蛋,经过提纯得到含有抗EV71的卵黄抗体,该抗EV71卵黄抗体IgY具有较强的中和EV71的活性,能够阻断EV71的感染,能够有效阻断EV71的传染,进而预防EV71引发的手足口疾病。(The invention discloses a yolk antibody for inhibiting human intestinal 71-type virus, a preparation method and application thereof, wherein the antigen is VP1 antigen containing EV71 virus, the nucleotide sequence corresponding to VP1 protein is optimized, the VP1 antigen is cloned into pET28a, pET30 or pColdII prokaryotic expression vector, the VP1 antigen containing EV71 virus is obtained by prokaryotic expression of prokaryotic expression bacteria BL21, Rosetta or OrigamiB, egg containing yolk antibody is obtained by immunizing laying hens with the antigen, and the yolk antibody containing EV71 is obtained by purification, the EV71 yolk IgY antibody has strong activity of neutralizing EV71, can block infection of EV71, can effectively block infection of EV71, and further prevent hand-foot-mouth disease caused by EV 71.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用。
背景技术
手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种在儿童间流行的季节性传染病，一般由多种肠道病毒引起，在全球范围内具有传播。早期症状较轻，及时治疗患者预后良好，仍有少数患者发展为重症，伴有无菌性脑炎等中枢神经系统疾病及肺水肿等呼吸并发症，在5岁以下儿童中有较高的致死率。人肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71) 与柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CoxA16)是目前最主要的两种病原体，其中 EV71具有嗜神经毒性，严重者伴有中枢神经系统疾病、心肺衰竭，是继脊髓灰质炎病毒后，重要的中枢神经毒性的病原体之一。病毒传播途径主要为粪-口途径或是接触患者鼻咽分泌物，偶尔也会因接触病毒污染的物品而间接感染。
自1969年从近20例伴有神经系统并发症的手足口病患者粪便中分离得到EV71病毒以来，已多次引起世界范围内尤其是亚太地区手足口病大规模爆发，我国卫生部门将手足口病列为丙类传染病，2019年11月统计的全国发病传染病统计表显示手足口病的病例数超过10万例，在丙类传染病中感染人数仅次于流行性感冒，具有严重的社会危害性。尽管近年来，不断有新的研究成果的出现，但是目前人们尚未找到行之有效的预防和治疗手段。
EV71病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属A组肠道病毒，含有单股正链RNA，无包膜，基因组长约7.4kb，包括5’非编码区、P1、P2和P3三大编码区以及3’非编码区，其中P1区主要编码VP1～VP4四种结构蛋白，P2和P3区则分别编码NS2A～NS2C 和NS3A～NS3D七种非结构蛋白。EV71进入细胞后经过脱衣壳后释放出基因组RNA，即刻翻译出1个多聚蛋白体，经2A蛋白酶水解为前体蛋白P1、P2和P3，P1被3CD 蛋白(病毒3C蛋白酶和3D RNA聚合酶复合体)切割为VP1、VP0和VP3三种结构蛋白，组装为二十面体病毒核衣壳结构，VP0又继续水解为VP2和VP4；病毒RNA复制过程主要发生在囊泡复合体处，依赖于3D RNA聚合酶，最终病毒基因组与衣壳组装为成熟子代病毒颗粒，随宿主细胞破裂后释放到细胞间质而开始新的感染；而在此过程中，宿主细胞蛋白合成则完全被病毒2A蛋白酶中止。根据VP1序列差异，EV71分为A、 B、C共3种基因型，11种基因亚型，其中A型仅包含1种原型株BrCr，而B型和C 型则分别有B1～B5和C1～C5五种基因亚型。
卵黄抗体(Immunoglobulin Y,IgY)是指鸟类、两栖动物以及爬行动物的主要血清抗体，与哺乳动物IgG和IgE具有共同的祖先，功能上IgY类似于IgG。目前，鸡IgY 是应用最广泛的IgY，鸡体内IgY在免疫球蛋白的75％。由于卵黄膜上特异性受体的选择性作用，只有IgY能够透过该膜，并被运输至卵黄中。通过抗原或灭活病原体免疫产蛋母鸡，蛋黄内会存在相应的特异抗体，将其中IgY提取后可以制成各种制品，可以用于相应疾病的预防和治疗。
IgY稳定性较IgG好，在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。有研究表明IgY在4℃存放5年，置室温6个月，抗体活性没有降低。在用pH4以上的胃蛋白酶处理，有60％左右的IgY仍保留抗原结合活性，表明IgY对胃蛋白酶具有很好的抵抗力。反复冻融对哺乳动物类抗体的抗原结合活性有较大的影响，但IgY在经过5次冻融后抗体活性几乎不受影响。
由于禽类和人亲缘关系较远，种系差别大，使得IgY在检测诊断上具有稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等优点。已经证明，口服特异性IgY抗体对包括牛和人轮状病毒、肠毒性大肠杆菌、牛冠状病毒、沙门菌属、葡萄球菌、假单胞菌等多种肠道菌具有抵抗作用。另外IgY已成功应用于口腔疾病、咽喉炎、流感、鼻炎和鼻窦炎、妇科感染、胃炎、艾滋病等粘膜性疾病防治。
目前手足口病的治疗方法有痰热清注射液、热宁、延胡宁、阿昔洛韦、利巴韦林、干扰素、西洋平等，这些方法虽然能够部分缓解疾病的症状，但是没有特异抑制 EV71，阻断EV71引起的疾病，同时控制其传染。
发明内容
发明目的：针对目前EV71的致病性和传染性，本申请利用目前EV71病毒的蛋白VP1保守序列获得抗原制备蛋黄球蛋白，改进免疫方案和纯化方法提高卵黄抗体的得率和纯度，获得一种能够抗EV71的卵黄抗体，该IgY具有较强的中和EV71的活性，能够阻断EV71的感染，能够有效阻断EV71的传染。
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种含有EV71病毒VP1抗原的制备的方法。
本发明另一目的在于提供采用上述抗原免疫的得到的用于抑制人肠道EV71的卵黄抗体的制备方法。
本发明的第三目的在于提供采用上述方法制备的抑制人肠道EV71的卵黄抗体。
本发明第四目的在于提供上述抑制人肠道EV71的卵黄抗体在制备复合卵黄抗体产品、食品、食品添加剂、保健食品、药品、化妆品、消毒用品、日用品中的应用。
本发明第四目的在于提供上述抑制人肠道EV71的卵黄抗体在诊断手足口病中的应用。
技术方案：本发明所述一种含有EV71病毒VP1抗原，其为将VP1蛋白对应的核苷酸序列经优化后，克隆到pET28a，pET30或pColdII原核表达载体内，经原核表达菌 BL21，Rosetta或OrigamiB表达得到的含有EV71病毒VP1抗原；
其中VP1蛋白对应的核苷酸序列L1为：
ggcgaccgtgtggcggatgttatcgaaagcagcattggtgacagcgtgagccgtgcgctgacccatgcgctgccggcgccgaccggccagaac acccaagtgagcagccaccgtctggacaccggcaaggttccggcgctgcaagcggcggagattggtgcgagcagcaacgcgagcgatgagagcatg attgaaacccgttgcgtgctgaacagccacagcaccgcggaaaccaccctggacagcttctttagccgtgcgggtctggttggcgagatcgatctgccgct gaagggtaccaccaacccgaacggctacgcgaactgggacatcgatattaccggttatgcgcaaatgcgtcgtaaagtggaactgttcacctacatgcgtt ttgatgcggagttcacctttgttgcgtgcaccccgaccggcgaagtggttccgcagctgctgcaatatatgttcgtgccgccgggtgcgccgaaaccggat agccgtgaaagcctggcgtggcagaccgcgaccaacccgagcgtgttcgttaaactgagcgatccgccggcgcaagtgagcgttccgtttatgagcccg gcgagcgcgtaccaatggttctacgacggttatccgacctttggcgagcacaagcaagaaaaagatctggagtatggtgcgtgcccgaacaacatgatgg gcaccttcagcgtgcgtaccgttggtaccagcaagagcaaatacccgctggttgtgcgtatctatatgcgtatgaaacacgttcgtgcgtggattccgcgtcc gatgcgtaaccagaactacctgtttaaggcgaacccgaactatgcgggtaacagcatcaaaccgaccggtgcgagccgtaccgcgattaccaccctgtaa ；
含有EV71病毒VP1抗原的蛋白序列为L2：
GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMI ETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLKGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMR FDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMS PASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVR AWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGASRTAITTL。
进一步地，所述核苷酸序列优化的具体方法为：根据表达宿主大肠杆菌密码子使用的偏爱性优化需要表达的核酸序列，优化后的核酸序列克隆到所述原核表达菌载体内；蛋白表达后需要纯化，选择四种不同的蛋白标签克隆到核酸序列的3’端，蛋白标签的核酸序列如下：
6×His：CATCACCATCACCATCAC；
Myc：GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG；
HA:TACCCATACGATGTT CCAGATTACGCT；
Flag：GACTACAAAGACGATGACGACAAG。
本发明还提供了上述含有EV71病毒VP1抗原的制备方法，包括如下步骤：
(11)原核细菌培养：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB 培养板上，放30～40℃培养箱过夜，第二天，挑取单菌落于LB培养基内，30～40℃， 200～350rpm摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:50～100接种到新鲜的LB 培养基内，30～40℃，3000～4000rpm培养1-2h至OD600至0.5～0.7，将细菌培养液转入离心管内，冰上放置10分钟，4℃3000～4000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M 的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置30分钟，4℃4000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，每管100～200μl 分装，液氮速冻后，-70℃保存；
(12)将含有VP1的质粒转化至原核表达细菌内，具体如下：从-60～70℃冰箱中取出原核表达细菌感受态，室温使其解冻，解冻后冰上放置；分别将所述质粒50ng加入到感受态内；40～45℃水浴热击90秒，然后冰上放置2分钟；加入1ml LB培养， 30～40℃，150rpm振荡培养45分钟；取100μl菌液涂布到含有对应的抗性的琼脂糖培养板上；
(13)VP1抗原原核表达：挑取平板上的单个菌落，加入10ml LB培养，30～40℃250rpm过夜培养，1:100～1:500接种到含有对应抗性的LB培养基中，继续培养，待 OD600至1.0加入IPTG诱导表达，继续培养2～3小时；4℃，4000rpm离心10分钟，去上清，加入适量PBS重悬，加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10分钟；超声破碎10～30分钟，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况；
(14)VP1抗原纯化：将超声上清菌液，过合适的亲和柱纯化，纯化后的蛋白溶液，经脱盐柱处理，所得蛋白溶液经超滤浓缩，获得含有EV71病毒VP1抗原。
本发明还提供了含有抗EV71卵黄抗体鸡蛋的制备方法，包括如下步骤：
(21)将上述获得的VP1抗原采用佐剂进行乳化；
(22)免疫产蛋母鸡：选用10～40周龄健康产蛋母鸡隔离饲养，进行皮下注射，每只母鸡注射选择2～6个注射点，免疫用抗原量100μg/鸡，首次免疫后，每两周加强免疫一次；
(23)收集最后一次免疫所产的鸡蛋，即得到含有抗EV71卵黄抗体的鸡蛋。
进一步地，步骤(21)中所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或氢氧化铝佐剂。
本发明还提供了上述方案制备的含有抗EV71卵黄抗体鸡蛋。
本发明还提供了含有抗EV71卵黄抗体的制备方法，将含有抗EV71卵黄抗体的鸡蛋中分离纯化得到含有抗EV71卵黄抗体，具体为：将含有抗EV71的卵黄抗体鸡蛋经清洗消毒后，开口，让蛋清流出；将蛋黄在普通滤纸上翻滚若干次，去除蛋清，挑破卵黄膜收集卵黄；用2倍的卵黄体积的无菌PBS稀释卵黄，室温搅拌，慢慢加入40％PEG6000 溶液，至终浓度为3.5％，继续搅拌30分钟；在4℃下10000rpm离心10分钟，离心后收集上层溶液，经普通滤纸过滤去除不溶物；往上清中继续加入40％PEG6000溶液，至终浓度为9.5％，室温搅拌20min，再次4℃，10000rpm离心10分钟；沉淀用与卵黄等体积的PBS溶解，再加入40％PEG6000至终浓度为12％，室温搅拌30分钟，再次同样条件离心，弃上清，沉淀用卵黄体积的1/2的PBS重悬溶解；在4℃下，边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液，搅拌1小时，再次同样条件离心，弃上清；沉淀用卵黄体积的 1/10～1/20的PBS重悬溶解；溶解后的用PBS进行透析20小时，每4～6小时更换透析液，收集经过透析的卵黄抗体；收集经过透析的卵黄抗体，稀释50～100倍后，测定280nm 的吸光度计算卵黄抗体的含量；得到的卵黄抗体经SDS-PAGE电泳鉴定纯度。
本发明还提供了上述方法制备的含有抗EV71卵黄抗体。
本发明还提供了上述抗EV71卵黄抗体在制备复合卵黄抗体产品、食品添加剂、保健食品、药品、化妆品、消毒用品、日用品中的应用。
本发明还提供了上述抗EV71卵黄抗体在预防手足口病的喷剂中的应用。
有益效果：(1)本发明通过特有的制备方法，制备得到的含有EV71病毒VP1 抗原，并将该含有EV71病毒VP1抗原应用制备得到抗EV71卵黄抗体，该卵黄抗体相比于现有的产品具有良好的溶解性能，产品纯度大于98％，且抗体得率大于70％；该抗EV71卵黄抗体IgY具有较强的中和EV71的活性，能够阻断EV71的感染，能够有效阻断EV71的传染，进而预防EV71引发的手足口疾病；(2)本发明中提供了从鸡蛋中提取纯化卵黄抗体的方法，相对于现有技术可大大提高提取的卵黄抗体纯度，提高其对EV71的中和及抑制作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：含EV71病毒VP1抗原的制备方法及所得到的含EV71病毒VP1抗原
将VP1蛋白的对应的核苷酸经优化后，克隆到pET28a，pET30或pColdII原核表达载体内，经原核表达菌BL21，Rosetta或OrigamiB表达得到含EV71病毒VP1抗原，核苷酸的优化方法包括：根据表达宿主大肠杆菌密码子使用的偏爱性优化需要表达的核酸序列，优化后的核酸序列克隆到上述原核表达菌载体内，另外因蛋白表达后需要纯化，因不同蛋白标签对蛋白结构以及纯化效率的影响，本发明根据本方案需要纯化的蛋白特性选择四不同的蛋白标签克隆到核酸序列的3’端，蛋白标签的核酸序列如下：
6×His：CATCACCATCACCATCAC；
Myc：GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG；
HA:TACCCATACGATGTT CCAGATTACGCT；
Flag：GACTACAAAGACGATGACGACAAG。
(11)原核细菌培养：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB 培养板上，放37℃培养箱过夜，第二天，挑取单菌落于LB培养基内，37℃，250rpm摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:100接种到新鲜的LB培养基内，37℃， 4000rpm培养1-2h至OD600至0.6，将细菌培养液转入离心管内，冰上放置10分钟，4℃ 4000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置 30分钟，4℃4000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，每管100～200μl分装，液氮速冻后，-70℃保存；
(12)将含有VP1的质粒转化至原核表达细菌内，具体如下：从-70℃冰箱中取出原核表达细菌感受态，室温使其解冻，解冻后冰上放置；分别将上述质粒(50ng)加入到感受态内；42℃水浴热击90秒，然后冰上放置2分钟；加入1ml LB培养，37℃，150rpm 振荡培养45分钟；取100μl菌液涂布到含有对应的抗性的琼脂糖培养板上；
(13)VP1抗原原核表达：挑取平板上的单个菌落，加入10ml LB培养，37℃250rpm过夜培养，1:100～1:500接种到含有对应抗性的LB培养基中，继续培养，待OD600至 1.0左右加入IPTG诱导表达，继续培养2～3小时；4℃，4000rpm离心10分钟，去上清，加入适量PBS重悬，加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10分钟；超声破碎10分钟-30分钟，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况；
(14)VP1抗原纯化：将超声上清菌液，过镍柱纯化，纯化后的蛋白溶液，经脱盐柱处理，所得蛋白溶液经超滤浓缩，获得含有EV71病毒VP1抗原。
其中VP1蛋白对应的核苷酸序列L1为：
ggcgaccgtgtggcggatgttatcgaaagcagcattggtgacagcgtgagccgtgcgctgacccatgcgctgccggcgccgaccggccagaacaccc aagtgagcagccaccgtctggacaccggcaaggttccggcgctgcaagcggcggagattggtgcgagcagcaacgcgagcgatgagagcatgattga aacccgttgcgtgctgaacagccacagcaccgcggaaaccaccctggacagcttctttagccgtgcgggtctggttggcgagatcgatctgccgctgaagggtaccaccaacccgaacggctacgcgaactgggacatcgatattaccggttatgcgcaaatgcgtcgtaaagtggaactgttcacctacatgcgttttgat gcggagttcacctttgttgcgtgcaccccgaccggcgaagtggttccgcagctgctgcaatatatgttcgtgccgccgggtgcgccgaaaccggatagcc gtgaaagcctggcgtggcagaccgcgaccaacccgagcgtgttcgttaaactgagcgatccgccggcgcaagtgagcgttccgtttatgagcccggcgagcgcgtaccaatggttctacgacggttatccgacctttggcgagcacaagcaagaaaaagatctggagtatggtgcgtgcccgaacaacatgatgggcac cttcagcgtgcgtaccgttggtaccagcaagagcaaatacccgctggttgtgcgtatctatatgcgtatgaaacacgttcgtgcgtggattccgcgtccgatg cgtaaccagaactacctgtttaaggcgaacccgaactatgcgggtaacagcatcaaaccgaccggtgcgagccgtaccgcgattaccaccctgtaa；
含有EV71病毒VP1抗原的蛋白序列为L2：
GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMI ETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLKGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMR FDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMS PASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVR AWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGASRTAITTL。
实施例2：含有抗EV71卵黄抗体的鸡蛋的制备方法
(21)将经基因工程获得的VP1抗原进行乳化，所用的佐剂是弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂等。
(22)免疫产蛋母鸡：选用10-40周龄健康产蛋母鸡隔离饲养，进行皮下注射，每只母鸡注射选择2-6个注射点，免疫用抗原量100μg/鸡，首次免疫后，每两周加强免疫一次；
(23)收集最后一次免疫所产的鸡蛋。
实施例3：含有抗EV71卵黄抗体的制备方法
将含有抗EV71卵黄抗体的鸡蛋中分离纯化得到含有抗EV71卵黄抗体，具体为：将含有抗EV71的卵黄抗体鸡蛋经清洗消毒后，开口，让蛋清流出；将蛋黄在普通滤纸上翻滚若干次，去除蛋清，挑破卵黄膜收集卵黄；用2倍的卵黄体积的无菌PBS稀释卵黄，室温搅拌，慢慢加入40％PEG6000溶液，至终浓度为3.5％，继续搅拌30分钟；在4℃下10000rpm离心10分钟，离心后收集上层溶液，经普通滤纸过滤去除不溶物；往上清中继续加入40％PEG6000溶液，至终浓度为9.5％，室温搅拌20min，再次4℃， 10000rpm离心10分钟；沉淀用与卵黄等体积的PBS溶解，再加入40％PEG6000至终浓度为12％，室温搅拌30分钟，再次同样条件离心，弃上清，沉淀用卵黄体积的1/2 的PBS重悬溶解；在4℃下，边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液，搅拌1小时，再次同样条件离心，弃上清；沉淀用卵黄体积的1/10～1/20的PBS重悬溶解；溶解后的用PBS进行透析20小时，每4～6小时更换透析液，收集经过透析的卵黄抗体；收集经过透析的卵黄抗体，稀释50～100倍后，测定280nm的吸光度计算卵黄抗体的含量；得到的卵黄抗体经SDS-PAGE电泳鉴定纯度。
一、本方法制备的抗EV71卵黄抗体的滴度测定：采用间接ELSIA测定血清或卵黄抗体的滴度，具体步骤如下：将VP1抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至 10ng/ml～100ng/ml，加入酶标板内，每孔100μl，4℃，包被过夜；第二天甩掉包被液，用含有0.05％的吐温20的PBS浸泡冲洗，每次浸泡1分钟，洗板1分钟；用1％的牛血清白蛋白(BSA)封闭，室温1小时，洗板2～5次，加入倍比稀释的血清或卵黄，室温孵育2h，用PBST洗板5次；按1:10000稀释加入辣根过氧化酶(HRP)标记的抗鸡二抗，室温30～60分钟后，洗板4～6次，加入显色剂TMB，室温放置15分钟，2M硫酸终止反应，读取OD450nm下的酶标仪读数；本发明的抗EV71抗体滴度在1：20万以上。
抗EV71卵黄抗体中和效价测定
(一)、细胞准备
(31)将vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，使用胰蛋白酶-EDTA消化后，用血球计数板进行计数；
(32)加入D-MEM将细胞浓度调整至1x10^5/ml，在96孔微量培养板的各孔中加入100μl 细胞悬液，使每孔细胞数为10^4个；
(33)在37℃5％CO2培养箱中孵育24h，用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒滴定。
(二)、实验步骤
1、取已生长相刚达到完全融合的vero细胞96孔微量培养板，将培养液换为无血清的 D-MEM，加入已准备好的抗体样品使终浓度为5％、2％、1％、0.5％、0.05％三个浓度梯度，在37℃5％CO2培养箱中孵育2h；
2、病毒的梯度稀释：新取一块96孔微量培养板，第一列加入EV71-FY8标准毒株，从第二列开始进行梯度稀释，第11列、第12列分别为阴性对照和空白对照。稀释例表如下：
3、病毒的接种：2h后取出已加入抗体样品的96孔微量培养板，按照上表所示的位置对应加入梯度稀释的病毒液10μl/孔(即加入孔板时再稀释10倍病毒)，孔板最终体系为100μl，放回37℃5％CO2培养箱中培养5～10天。
4、逐日观察：5～10天后在显微镜下观察，统计每一列中出现的CPE(cytopathiceffects，细胞病变效应)的孔数。若阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本试验即为有效。
5、累计每一列中出现阳性(即有CPE)的孔数，用Reed-Muench法计算病毒TCID50(50％tissue culture infective dose，半数细胞培养物感染量)；
(三)实验结果
1、EV71-FY8标准毒株的TCID50：
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝0.77
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝-6.77
TCID50＝10-6.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释106.8接种100μl可使50％的细胞发生病变。
2、样品浓度0.05％的实验结果
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝0.81
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝-4.8
TCID50＝10-4.8/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释104.8接种100μl可使50％的细胞发生病变。
3、样品浓度0.5％的实验结果
TCID50＝10-4.7/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释104.7接种100μl可使50％的细胞发生病变。
4、样品浓度1％的实验结果
TCID50＝10-3.7/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释103.7接种100μl可使50％的细胞发生病变。
5、样品浓度2％的实验结果
TCID50＝10-1.7/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释101.7接种100μl可使50％的细胞发生病变。
6、样品浓度5％的实验结果
TCID50＝10-1.5/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释101.5接种100μl可使50％的细胞发生病变。
(四)结果分析
5％浓度和2％的EV71型样品对EV71有明显抑制作用，0.05％、0.5％和1％浓度EV71型相对来看有较弱抑制，样品对病毒的抑制作用随样品浓度升高而增强。
二、本发明产品的效果检测
实验(一)、本发明的抗EV71的卵黄抗体具有更好的中和效果
因目前无抗EV71相关的卵黄抗体销售，我们比较了本专利EV71卵黄抗体与普通型卵黄抗体(江苏康德蛋业有限公司)对EV71病毒的中和效果。
实验方法同抗EV71卵黄抗体中和效价测定
实验结果：
EV71卵黄抗体样本浓度5％的结果
TCID50＝10-1.5/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释101.5接种100μl可使50％的细胞发生病变。
普通卵黄抗体样本浓度5％的结果
TCID50＝10-6.6/0.1ml
含义：抗体样品作用后该标准病毒稀释106.6接种100μl可使50％的细胞发生病变。
实验结果显示抗体EV71的卵黄抗体对EV71病毒有中和作用，而普通型卵黄抗体对EV71 病毒没有中和作用。
实施例4：利用抗EV71卵黄抗体，制备预防手足口病的制剂
采用本发明的制备的EV71卵黄抗体300mg，保护剂明胶10g，甘氨酸3g，三氯蔗糖5mg，薄荷香精1g，用磷酸氢二钠/柠檬酸调整pH至5.4-5.6,加入水定容至1000ml， 20ml分装制备成喷雾剂。
实施例5：利用抗EV71卵黄抗体，制备预防手足口病的免洗洗手液
采用本发明的制备的EV71卵黄抗体100mg，60g芦荟胶，10g甘油，0.5ml精油。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
序列表
<110> 南京蛋球球生物医学技术合伙企业（有限合伙）
<120> 用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 894
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgaccgtg tggcggatgt tatcgaaagc agcattggtg acagcgtgag ccgtgcgctg 60
acccatgcgc tgccggcgcc gaccggccag aacacccaag tgagcagcca ccgtctggac 120
accggcaagg ttccggcgct gcaagcggcg gagattggtg cgagcagcaa cgcgagcgat 180
gagagcatga ttgaaacccg ttgcgtgctg aacagccaca gcaccgcgga aaccaccctg 240
gacagcttct ttagccgtgc gggtctggtt ggcgagatcg atctgccgct gaagggtacc 300
accaacccga acggctacgc gaactgggac atcgatatta ccggttatgc gcaaatgcgt 360
cgtaaagtgg aactgttcac ctacatgcgt tttgatgcgg agttcacctt tgttgcgtgc 420
accccgaccg gcgaagtggt tccgcagctg ctgcaatata tgttcgtgcc gccgggtgcg 480
ccgaaaccgg atagccgtga aagcctggcg tggcagaccg cgaccaaccc gagcgtgttc 540
gttaaactga gcgatccgcc ggcgcaagtg agcgttccgt ttatgagccc ggcgagcgcg 600
taccaatggt tctacgacgg ttatccgacc tttggcgagc acaagcaaga aaaagatctg 660
gagtatggtg cgtgcccgaa caacatgatg ggcaccttca gcgtgcgtac cgttggtacc 720
agcaagagca aatacccgct ggttgtgcgt atctatatgc gtatgaaaca cgttcgtgcg 780
tggattccgc gtccgatgcg taaccagaac tacctgttta aggcgaaccc gaactatgcg 840
ggtaacagca tcaaaccgac cggtgcgagc cgtaccgcga ttaccaccct gtaa 894
<210> 2
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val
1 5 10 15
Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr
20 25 30
Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile
50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro
85 90 95
Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp
100 105 110
Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr
115 120 125
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly
130 135 140
Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn
165 170 175
Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val
180 185 190
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
195 200 205
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala
210 215 220
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr
225 230 235 240
Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys
245 250 255
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu
260 265 270
Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly
275 280 285
Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu
290 295