具体实施方式

本发明提供了一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由EV71病毒的P1前体蛋白的四个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4在酵母细胞内自组装获得。在本发明中，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列优选如SEQ ID No.1所示；所述结构蛋白VP2的氨基酸序列优选如SEQ ID No.2所示；所述结构蛋白VP3的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示；所述结构蛋白VP4的氨基酸序列优选如SEQ ID No.4所示。在本发明中，四个结构蛋白经重组载体表达后自动组装为形态均一稳定且具有免疫原性的病毒样颗粒，证明了EV71病毒颗粒的组装仅需要P1蛋白的四个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，不需要3CD蛋白酶，从而进一步简化了肠道病毒EV71型病毒样颗粒的构建方法。

本发明提供了上述病毒样颗粒的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.5～8所示。在本发明中，结构蛋白VP1的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示；结构蛋白VP2的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.6所示；结构蛋白VP3的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.7所示；结构蛋白VP4的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.8所示。本发明选取中国疾控中心2009年1月4日在GenBank中所提交的中国北京流行病毒株C4型BJ08-Z020-1(基因序列为FJ606449.1)。分别选取其P1的四个结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1的基因序列，作为靶抗原基因。然后对此四个基因进行基因序列优化设计，其原则为：尽量使用Hansenula polymorpha最偏爱密码；为了调整整个病毒样颗粒编码基因的GC含量，某些氨基酸使用次偏爱密码，但前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近；同时分析mRNA的二级结构是否形成发卡结构阻碍共翻译，最终保持氨基酸序列不变，将四个基因序列委托第三方进行合成，并克隆在pUC57载体中。

本发明提供了上述编码基因的表达载体，所述表达载体中的编码基因按照VP4-VP2-VP3-VP1的顺序串联表达。在本发明中，所述表达载体优选为汉逊酵母表达载体，所述汉逊酵母表达载体包括原核大肠杆菌元件和汉逊酵母元件两部分，原核部分优选包括ColE1、Amp及多克隆位点MCS部分，酵母部分优选包括启动子(甲醇氧化酶启动子MOXP或甲醛脱氢酶启动子FMDP)、终止子(甲醇氧化酶终止子MOXT)、自主复制序列(HARS)、筛选标记(Ura3)基因。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌能表达上述表达载体。在本发明中，所述重组菌优选以尿嘧啶缺陷型ATCC26012(Ura3-)为宿主菌，经表达载体电转化后筛选获得。

本发明还提供了上述病毒样颗粒、编码基因、表达载体或重组菌在制备肠道病毒EV71型病毒疫苗中的应用。将本发明所述肠道病毒EV71型病毒颗粒制备成疫苗，具有良好的免疫原性。

本发明提供了一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别构建上述VP4、VP2、VP3和VP1的表达盒元件；

(2)将VP4、VP2、VP3和VP1的表达盒元件依次串联到表达载体中，得到重组表达载体；

(3)将所述重组表达载体转化宿主细胞，筛选得到多拷贝转化子；

(4)利用多拷贝转化子表达得到肠道病毒EV71型病毒样颗粒疫苗。

在本发明中，所述步骤(2)表达载体优选为汉逊酵母表达载体；所述步骤(3)宿主细胞优选为尿嘧啶缺陷型ATCC26012；所述步骤(4)表达优选在0.5～1.5％甲醇诱导下进行。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的肠道病毒EV71型病毒样颗粒疫苗。

本发明以多个表达盒串联共表达EV71的VP1、VP2、VP3、VP4等4个结构蛋白，通过密码子的优化以及串联表达盒载体的设计，表达载体转化酵母并获得重组酵母表达菌株，重组菌株通过诱导表达、高压破碎释放病毒样颗粒，然后进行澄清超滤及蔗糖梯度离心的方法获得病毒样颗粒。本发明的方法能够获得纯度高、形态均一、性状稳定的病毒样颗粒，用于手足口病疫苗的制备，具有很好的市场应用价值。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)表达载体构建

汉逊酵母表达载体为原核大肠杆菌和汉逊酵母穿梭质粒，原核部分包括ColE1和Amp及多克隆位点MCS部分，酵母部分包括，启动子(甲醇氧化酶启动子MOXP或甲醛脱氢酶启动子FMDP)、终止子(甲醇氧化酶终止子MOXT)、自主复制序列(HARS)、筛选标记(Ura3)等基因；首先以pBR-322质粒为骨架，基因扩增并连接获得原核部分ColE1+Amp+MCS；然后以汉逊酵母染色体DNA为模板扩增获得酵母元件，甲醇氧化酶启动MOXP或FMDP及MOXT、HARS、筛选标记Ura3等基因，然后将两部分元件连接构建两种启动子(MOXP、FMDP)的汉逊酵母表达载体，分别命名为：pMHU和pFHU。

(2)重组表达载体的构建

将合成的目的基因VP4-VP1分别从PUC57载体上酶切连接到汉逊酵母表达载体pMHU和pFHU，构建获得一系列重组表达载体，pMHU(pFHU)-VP4、pMHU(pFHU)-VP2、pMHU(pFHU)-VP3、pMHU(pFHU)-VP1；然后依次将表达盒元件MOXP(FMDP)-VP2-MOXT、MOXP(FMDP)-VP3-MOXT、MOXP(FMDP)-VP1-MOXT，从其表达载体上酶切，并依次连接到pMHU(pFHU)-VP4上呈顺序串联，从而构建两种启动子VP4-VP2-VP3-VP1四种基因表达盒并串联的重组表达载体；然后将重组表达载体转化汉逊酵母表达载体，实现同时在一个菌株中共表达VP4、VP2、VP3和VP1蛋白，并在酵母细胞内自动组装为VLP颗粒。

(3)转化酵母细胞筛选多拷贝转化子

将上述重组表达质粒以电转化方法转化尿嘧啶缺陷型ATCC26012(Ura3-)宿主菌，转化细胞涂于MDL平皿上，33℃孵箱培养一周，将长出的转化菌落转接入10ml MDL液体培养基中33℃摇床传代培养。传代过程中运用PCR的方法筛选重组菌株，即取少量的菌体为模板，以引物MP1：5’-cacggtggtgacatcaatctaaagt-3’(SEQ ID No.9)；引物MT1：5’-tccttccacgtctccttgctagcg-3’(SEQ ID No.10)用于鉴定MOXP菌株；以引物FP1：5’-ccttgcgctctctgccttcatc-3’(SEQ ID No.11)；引物FT1：5’-gcggtatgtccttccacgtctc-3’(SEQ ID No.12)用于鉴定FMDP菌株，重组菌株根据转化的质粒命名，如MOXP为启动子的重组质粒转化后筛选的重组菌株分别命名为HP/pMHU-VP4-1、HP/pFHU-VP4-1；最后将稳定传代培养70-80代，并且经PCR筛选为稳定整合有外源基因的重组菌株，接入YPD培养基中33℃摇床培养，加入冻存液制成主代种子批于-70℃保存菌种。

(4)诱导表达

选择生长性能较稳定的重组菌株进行MDL培养，33℃摇床培养大约24h，OD值长至15～18，将其离心转接到含有1％甲醇的MM培养基(0.67％YNB、0.5％硫酸铵、1％甲醇)中经甲醇诱导72小时后对表达产物进行检测。

(5)表达产物的检测

A：ELISA检测表达产物比活性

以双抗体夹心ELISA法建立检测表达产物活性的方法，步骤如下：4℃包被EV71单克隆抗体过夜；0.5％牛血清白蛋白37℃封闭1h；加入纯化抗原(设阳性、阴性、空白对照、标准品对照)37℃孵育1h；再加入HRP标记的抗EV71兔多克隆抗体37℃孵育1h；37℃孵育1h；加入1％TMB显色10min，2mol/L H₂SO₄终止作用，在酶标分析仪上测定ELISA反应各孔OD_450nm值，结果分析P/N≥2.1，且A_450nm≥0.1，测得抗原的比活为38U/μg。

B：SDS-PAGE

配制12％分离胶，6％浓缩胶，样品经NaOH、SDS Buffer处理4ul上样，同时点样阳性对照和阴性对照，在恒流下，12mA 20min，24mA 1.5h，电泳完毕，取下胶，考马斯量蓝染色，凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

C：Western Blot鉴定

实验步骤如下：SDS-PAGE；电转移至PVDF膜，以160mA的恒定电流转移2h；封闭：将转移后的PVDF膜置封闭液PBST中37℃封闭过夜；结合：加入鼠抗EV71多克隆抗体(1：3000)作为第一抗体，与PVDF膜37℃结合2h，然后加入HRP-兔抗鼠IgG(1：2500)第二抗体，37℃作用1h；TMB显色直至出现清晰条带，去离子水终止反应。

SDS-PAGE检测结果见图1(1：Marker；2-3:纯化EV71VLP)，Western Blot鉴定结果见图2(1：纯化EV71VLP；2-4重组EV71菌体；5：Marker；)。图1和图2结果表明：EV71病毒P1蛋白的VP0(VP2+VP4)、VP1、VP3等结构蛋白均有特异表达条带。

(6)EV71类病毒颗粒的鉴定

将上述方法筛选鉴定的阳性菌株培养之后，菌体破碎经过蔗糖梯度离心初步纯化之后获得EV71类病毒样颗粒，进行磷钨酸负染色观察。

磷钨酸负染色电镜观察图谱见图3。根据图3可以看出：本发明所述重组表达方法制备的EV71类病毒样颗粒VLP大小为30nm左右，与理论值一致。

(7)EV71疫苗的制备及免疫效果评价

将上述EV71 VLP颗粒吸附铝佐剂，1:1混合，配制获得EV71铝佐剂疫苗，铝最终含量为0.50mg/ml。

EV71疫苗免疫原性的测定，选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠，分为7组，每组10只小鼠。其中1组小鼠，用含有铝佐剂的缓冲液(50mM PB pH7.0)进行免疫(作为阴性对照组)，EV71单价疫苗6组，每组免疫剂量每只为0.5μg、0.25μg、0.125μg、0.0625μg、0.03125μg、0.0156μg腹腔注射1ml,30天后眼球采血，。将采集得到的血液37℃1小时后于4℃放置过夜后，5000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20℃存放。将血清采用细胞病变法测中和抗体，Reed-Muench法计算中和抗体半数有效剂量ED₅₀为0.15μg

以上实验结果表明：利用本发明提供的EV71 VLP制备的疫苗免疫动物，免疫效果良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 众盈生物（青岛）有限公司

<120> 一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒、编码基因、表达载体、重组酵母菌及制备方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser

1 5 10 15

Val Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn

20 25 30

Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu

35 40 45

Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met

50 55 60

Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr

65 70 75 80

Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu

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Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile

100 105 110

Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr

115 120 125

Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr

130 135 140

Gly Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly

145 150 155 160

Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr

165 170 175

Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser

180 185 190

Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly

195 200 205

Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly

210 215 220

Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly

225 230 235 240

Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met

245 250 255

Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr

260 265 270

Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr

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Gly Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

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<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile

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Ile Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser Asp Ser Asp Ala

35 40 45

Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe

50 55 60

Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser Lys Gly Trp Tyr

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Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn

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100 105 110

Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Leu

115 120 125

Pro Glu Tyr Val Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr Gly Thr Glu Asp

130 135 140

Thr His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala Asp Gly Phe Glu

145 150 155 160

Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Ile Ser Gln Leu

165 170 175

Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala

180 185 190

Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ala Leu

195 200 205

Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Ile Ser Pro Leu Asp

210 215 220

Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val Ile Pro Ile Thr Ile Thr Leu Ala

225 230 235 240

Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala Val Thr Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr

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Pro Cys Ile His Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu Leu Cys

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Gln Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn Ala Thr

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Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr Gln Trp

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Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala

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Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Leu Pro

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Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe

145 150 155 160

Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr

165 170 175

His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr Thr Thr

180 185 190

Gly Leu Val Ser Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Ile Gly

195 200 205

Ala Pro Asn Thr Ala Tyr Ile Ile Ala Leu Ala Ala Ala Gln Lys Asn

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Thr Ile Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

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Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

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Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln

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Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp Ile Phe Thr Glu Met

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65

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggagata gagttgccga cgttatcgag tcttctattg gcgactccgt gtctagagct 60

ttgactcacg ctttgccagc tccaacagga caaaacaccc aagtttcgtc tcacagactg 120

gacaccggaa aagttccagc tttgcaagca gcagagattg gagcttcttc taacgcttcc 180

gacgagtcta tgatcgaaac cagatgcgtg ctgaactctc actctacagc agagaccacc 240

ttggactctt tcttctctag agccggactg gttggagaga ttgacttgcc actggaagga 300

actaccaacc caaacggata cgccaattgg gatatcgaca tcaccggata cgctcagatg 360

agaagaaagg tcgagctgtt cacctacatg agattcgacg cagagttcac cttcgttgct 420

tgtactccaa ccggagaagt tgttccacag ttgctgcagt acatgtttgt tccaccaggc 480

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ttcgtgaaat tgtcggaccc accagctcaa gtttcggttc catttatgtc tccagcttcg 600

gcttaccagt ggttttacga cggataccca accttcggag agcataagca ggagaaggac 660

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gcaggaaact ctattaagcc aaccggagct tcgagaacag ctattaccac cctgtaa 897

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtctccat cggcagaagc ttgcggatat tcggatagag tggctcagct gaccattgga 60

aactctacta ttaccaccca ggaggcagct aacattatcg ttggatacgg cgagtggcca 120

tcttattgtt cagactcgga cgctaccgca gttgataaac caaccagacc agacgtgtcg 180

gttaacagat tctacaccct ggacaccaag ctttgggaaa agtcgtcgaa gggttggtat 240

tggaagttcc cagacgtttt gaccgagaca ggagttttcg gacagaacgc tcagttccac 300

tacctgtaca gatcgggatt ttgcatccac gtccagtgta acgcttcgaa attccaccag 360

ggagctttgt tggttgcagt tctgccagag tacgttattg gaaccgttgc aggaggaaca 420

ggaacagagg acactcaccc accatacaaa cagactcaac caggagcaga cggattcgaa 480

ttgcaacacc catacgtgtt ggacgcaggc atcccaatct ctcagctgac cgtttgtcca 540

catcagtgga tcaacctgag aaccaacaac tgcgctacca tcatcgtgcc atacatcaac 600

gctctgccat ttgactcggc tttgaaccat tgcaacttcg gactgctggt ggttccaatt 660

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cctatgtgtt cggagtttgc aggactgaga caggccgtta ctcagtaa 768

<210> 7

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<212> DNA

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<400> 7

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gtttctgctc ctattctgcc aaacttccac ccaactcctt gtatccacat tccaggagag 120

gtgagaaacc tgttggagct ttgtcaggtg gagactatcc tggaggtgaa caacgttcca 180

accaacgcta cctctctgat ggagagactc agattcccag tttcggctca agcaggaaaa 240

ggagagcttt gcgccgtttt tagagcagat ccaggaagaa acggaccttg gcaatctact 300

ctgcttggac agctttgcgg atactacact cagtggtcgg gatctttgga ggttaccttc 360

atgttcaccg gatcttttat ggctaccggc aagatgctga ttgcttacac tccaccagga 420

ggaccattgc caaaggatag agctaccgct atgctgggaa ctcacgttat ttgggacttc 480

ggactgcagt cttcggttac cctggttatt ccttggatct cgaacaccca ttacagagcc 540

cacgctagag acggagtttt cgactactac accacaggac tggtttcgat ttggtaccag 600

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actattcagt aa 732

<210> 8

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

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<400> 9

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<210> 10

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<212> DNA

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<212> DNA

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gcggtatgtc cttccacgtc tc 22