一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂及其制备方法 (Apple tissue culture bacteriostatic agent free of sterilization condition and preparation method thereof ) 是由 李强伟 张晓斌 谢金磊 王潇 孟祥勇 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂及其制备方法,涉及组培技术领域,通过在还原铁粉的催化还原下,使得对氯硝基苯中的硝基形成氨基,生成中间体1,之后中间体1与三乙胺发生季铵化反应,生成带有季铵基团的中间体2,之后中间体2与四氯乙烯亲核取代反应,合成中间体3,中间体3具有碳碳双键以及大量季铵基团,经过聚合后,形成高分子的抑菌剂；通过将该抑菌剂添加到苹果组培用的培养基中,达到无菌条件,无需高压灭菌,可以直接利用塑料杯代替组培瓶,简化组培环节,降低组培成本,同时,无菌条件温和,避免了培养基中的激素和营养元素的流失,保证了组培苗的营养吸收,使得组培苗生长健壮,分化率高。(The invention discloses an apple tissue culture bacteriostatic agent without sterilization conditions and a preparation method thereof, and relates to the technical field of tissue culture, wherein under the catalytic reduction of reduced iron powder, nitro in p-chloronitrobenzene forms amino to generate an intermediate 1, then the intermediate 1 and triethylamine are subjected to quaternization reaction to generate an intermediate 2 with a quaternary ammonium group, then the intermediate 2 and tetrachloroethylene are subjected to nucleophilic substitution reaction to synthesize an intermediate 3, the intermediate 3 has a carbon-carbon double bond and a large number of quaternary ammonium groups, and after polymerization, a high-molecular bacteriostatic agent is formed; the bacteriostatic agent is added into a culture medium for apple tissue culture, so that aseptic conditions are achieved, high-pressure sterilization is not needed, a plastic cup can be directly used for replacing a tissue culture bottle, tissue culture links are simplified, tissue culture cost is reduced, meanwhile, the aseptic conditions are mild, loss of hormones and nutrient elements in the culture medium is avoided, nutrient absorption of tissue culture seedlings is guaranteed, and the tissue culture seedlings grow robustly and have high differentiation rate.)
技术领域
本发明涉及组培技术领域，具体涉及一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂及其制备方法。
背景技术
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术，植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术；
而苹果的组织培养是采用无菌培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片等器官以及其组织切片进行离体培养，使之在短期内获得大量遗传性一致的个体的办法，但现有技术中实现无菌培养技术是通过高压灭菌，此方法虽然灭菌效果较好但是需要大量组培瓶，而且高压灭菌时培养基中的激素和营养元素流失严重，导致组培成本大；
因此，亟需一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂来解决以上问题是本发明的关键。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂及其制备方法：通过在还原铁粉的催化还原下，使得对氯硝基苯中的硝基形成氨基，生成中间体1，之后中间体1与三乙胺发生季铵化反应，生成带有季铵基团的中间体2，之后中间体2与四氯乙烯亲核取代反应，合成中间体3，中间体3具有碳碳双键以及大量季铵基团，中间体3经过聚合后，相对分子量增大，电荷密度提高，因此抗菌性能大幅度提高，从而形成高分子的抑菌剂，解决了现有技术中实现无菌培养技术是通过高压灭菌，此方法虽然灭菌效果较好但是需要大量组培瓶，而且高压灭菌时培养基中的激素和营养元素流失严重，导致组培成本大的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂，结构如下：
该种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将还原铁粉、冰醋酸、去离子水加入至安装有冷凝回流管的三口烧瓶中，加热至沸腾并维持3-5min，之后将对氯硝基苯加入至三口烧瓶中，加热回流0.5-2h，反应完全，冰水浴冷却，加入氯化钠，析出晶体，真空抽滤，收集滤饼，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为60-80℃的条件下烘干至恒重，得到中间体1；
反应原理如下：
步骤二：将无水乙醇、三乙胺以及中间体1加入至安装有冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在温度为70-80℃，搅拌速率为100-300r/min的条件下搅拌反应8-10h，之后将反应产物在60℃的条件下减压蒸馏去除溶剂，将蒸馏产物用乙酸乙酯以及丙酮分别洗涤2-3次，真空抽滤，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为40-50℃的条件下烘干至恒重，得到中间体2；
反应原理如下：
步骤三：将四氯乙烯、中间体2、无水乙醚加入至安装有恒压滴液漏斗、冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在冰水浴以及搅拌速率为200-500r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，滴加完毕后加热，回流反应6-8h，反应结束后向反应产物中加入去离子水继续搅拌3-5min，之后用乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液并用无水硫酸钠干燥，旋蒸脱溶，得到中间体3；
反应原理如下：
步骤四：将中间体3、去离子水加入到安装有温度计、恒压滴液漏斗、搅拌器以及冷凝管的四口烧瓶中，在搅拌速率为200-300r/min的条件下的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液调节反应体系pH为7-8，升温并回流反应，边搅拌边逐滴加入过硫酸铵溶液，控制滴加时间为2-3h，滴加完毕后继续搅拌反应1-2h，将反应产物加入至甲醇水溶液中洗涤2-3次，过滤将滤饼真空干燥至恒重，得到该免灭菌条件的苹果组培抑菌剂。
反应原理如下：
作为本发明进一步的方案：步骤一中的所述还原铁粉、冰醋酸、去离子水、对氯硝基苯的用量比为1-2mol：20mL：80mL：0.6mol。
作为本发明进一步的方案：所述无水乙醇、三乙胺以及中间体1的用量比为100mL：1.0mol：1.0-1.5mol。
作为本发明进一步的方案：所述四氯乙烯、中间体2、无水乙醚、氢氧化钠溶液、去离子水的用量比为0.1mol：0.4：100mL：20mL：100mL，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为8-10mol/L。
作为本发明进一步的方案：所述中间体3、去离子水、过硫酸铵溶液用量比为1g：10-20mL：15mL，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为8-10mol/L，所述甲醇水溶液的体积分数为50-60％。
本发明的有益效果：
本发明是通过在还原铁粉的催化还原下，使得对氯硝基苯中的硝基形成氨基，生成中间体1，之后中间体1与三乙胺发生季铵化反应，生成带有季铵基团的中间体2，之后中间体2与四氯乙烯亲核取代反应，合成中间体3，中间体3具有碳碳双键以及大量季铵基团，季铵基团带正电，可以吸附到细菌表面，穿透细胞壁，与细胞膜结合，扰乱细胞膜组成，导致胞内物质泄漏，最后细菌死亡，碳碳双键使其具有聚合的条件，而且经过聚合后，相对分子量增大，电荷密度提高，因此抗菌性能大幅度提高，从而形成高分子的抑菌剂，因此，该抑菌剂的抗菌性能优异，添加到苹果组培用的培养基中，通过抑菌剂的作用达到无菌条件，无需高压灭菌，可以直接利用塑料杯代替组培瓶，简化组培环节，降低组培成本，同时，无菌条件温和，避免了培养基中的激素和营养元素的流失，保证了组培苗的营养吸收，使得组培苗生长健壮，分化率高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例为一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将还原铁粉、冰醋酸、去离子水加入至安装有冷凝回流管的三口烧瓶中，加热至沸腾并维持3min，之后将对氯硝基苯加入至三口烧瓶中，加热回流0.5h，反应完全，冰水浴冷却，加入氯化钠，析出晶体，真空抽滤，收集滤饼，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为60℃的条件下烘干至恒重，得到中间体1；控制还原铁粉、冰醋酸、去离子水、对氯硝基苯的用量比为1mol：20mL：80mL：0.6mol；
步骤二：将无水乙醇、三乙胺以及中间体1加入至安装有冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在温度为70℃，搅拌速率为100r/min的条件下搅拌反应8h，之后将反应产物在60℃的条件下减压蒸馏去除溶剂，将蒸馏产物用乙酸乙酯以及丙酮分别洗涤2次，真空抽滤，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为40℃的条件下烘干至恒重，得到中间体2；控制无水乙醇、三乙胺以及中间体1的用量比为100mL：1.0mol：1.0mol；
步骤三：将四氯乙烯、中间体2、无水乙醚加入至安装有恒压滴液漏斗、冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在冰水浴以及搅拌速率为200r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，滴加完毕后加热，回流反应6h，反应结束后向反应产物中加入去离子水继续搅拌3min，之后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用无水硫酸钠干燥，旋蒸脱溶，得到中间体3；控制四氯乙烯、中间体2、无水乙醚、氢氧化钠溶液、去离子水的用量比为0.1mol：0.4：100mL：20mL：100mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为8mol/L；
步骤四：将中间体3、去离子水加入到安装有温度计、恒压滴液漏斗、搅拌器以及冷凝管的四口烧瓶中，在搅拌速率为200r/min的条件下的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液调节反应体系pH为7，升温并回流反应，边搅拌边逐滴加入过硫酸铵溶液，控制滴加时间为2h，滴加完毕后继续搅拌反应1h，将反应产物加入至甲醇水溶液中洗涤2次，过滤将滤饼真空干燥至恒重，得到该免灭菌条件的苹果组培抑菌剂；中间体3、去离子水、过硫酸铵溶液用量比为1g：10mL：15mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为8mol/L，甲醇水溶液的体积分数为50％。
实施例2：
本实施例为一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将还原铁粉、冰醋酸、去离子水加入至安装有冷凝回流管的三口烧瓶中，加热至沸腾并维持4min，之后将对氯硝基苯加入至三口烧瓶中，加热回流1h，反应完全，冰水浴冷却，加入氯化钠，析出晶体，真空抽滤，收集滤饼，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为70℃的条件下烘干至恒重，得到中间体1；控制还原铁粉、冰醋酸、去离子水、对氯硝基苯的用量比为1.5mol：20mL：80mL：0.6mol；
步骤二：将无水乙醇、三乙胺以及中间体1加入至安装有冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在温度为75℃，搅拌速率为200r/min的条件下搅拌反应9h，之后将反应产物在60℃的条件下减压蒸馏去除溶剂，将蒸馏产物用乙酸乙酯以及丙酮分别洗涤3次，真空抽滤，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为45℃的条件下烘干至恒重，得到中间体2；控制无水乙醇、三乙胺以及中间体1的用量比为100mL：1.0mol：1.2mol；
步骤三：将四氯乙烯、中间体2、无水乙醚加入至安装有恒压滴液漏斗、冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在冰水浴以及搅拌速率为350r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，滴加完毕后加热，回流反应7h，反应结束后向反应产物中加入去离子水继续搅拌4min，之后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并用无水硫酸钠干燥，旋蒸脱溶，得到中间体3；控制四氯乙烯、中间体2、无水乙醚、氢氧化钠溶液、去离子水的用量比为0.1mol：0.4：100mL：20mL：100mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为9mol/L；
步骤四：将中间体3、去离子水加入到安装有温度计、恒压滴液漏斗、搅拌器以及冷凝管的四口烧瓶中，在搅拌速率为250r/min的条件下的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液调节反应体系pH为7.5，升温并回流反应，边搅拌边逐滴加入过硫酸铵溶液，控制滴加时间为2.5h，滴加完毕后继续搅拌反应1.5h，将反应产物加入至甲醇水溶液中洗涤3次，过滤将滤饼真空干燥至恒重，得到该免灭菌条件的苹果组培抑菌剂；中间体3、去离子水、过硫酸铵溶液用量比为1g：15mL：15mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为9mol/L，甲醇水溶液的体积分数为55％。
实施例3：
本实施例为一种免灭菌条件的苹果组培抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将还原铁粉、冰醋酸、去离子水加入至安装有冷凝回流管的三口烧瓶中，加热至沸腾并维持5min，之后将对氯硝基苯加入至三口烧瓶中，加热回流2h，反应完全，冰水浴冷却，加入氯化钠，析出晶体，真空抽滤，收集滤饼，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为80℃的条件下烘干至恒重，得到中间体1；控制还原铁粉、冰醋酸、去离子水、对氯硝基苯的用量比为2mol：20mL：80mL：0.6mol；
步骤二：将无水乙醇、三乙胺以及中间体1加入至安装有冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在温度为80℃，搅拌速率为300r/min的条件下搅拌反应10h，之后将反应产物在60℃的条件下减压蒸馏去除溶剂，将蒸馏产物用乙酸乙酯以及丙酮分别洗涤3次，真空抽滤，将滤饼放置于真空干燥箱中，在温度为50℃的条件下烘干至恒重，得到中间体2；控制无水乙醇、三乙胺以及中间体1的用量比为100mL：1.0mol：1.5mol；
步骤三：将四氯乙烯、中间体2、无水乙醚加入至安装有恒压滴液漏斗、冷凝回流管以及搅拌器的三口烧瓶中，在冰水浴以及搅拌速率为500r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，滴加完毕后加热，回流反应8h，反应结束后向反应产物中加入去离子水继续搅拌5min，之后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并用无水硫酸钠干燥，旋蒸脱溶，得到中间体3；控制四氯乙烯、中间体2、无水乙醚、氢氧化钠溶液、去离子水的用量比为0.1mol：0.4：100mL：20mL：100mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为10mol/L；
步骤四：将中间体3、去离子水加入到安装有温度计、恒压滴液漏斗、搅拌器以及冷凝管的四口烧瓶中，在搅拌速率为300r/min的条件下的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液调节反应体系pH为8，升温并回流反应，边搅拌边逐滴加入过硫酸铵溶液，控制滴加时间为3h，滴加完毕后继续搅拌反应2h，将反应产物加入至甲醇水溶液中洗涤3次，过滤将滤饼真空干燥至恒重，得到该免灭菌条件的苹果组培抑菌剂；中间体3、去离子水、过硫酸铵溶液用量比为1g：20mL：15mL，氢氧化钠溶液的摩尔浓度为10mol/L，甲醇水溶液的体积分数为60％。
对比例1：
对比例1为植物组培抗菌剂PPM。
对比例2：
对比例2为申请号CN201410781040.4中的种苗组培培养基的抑菌剂。
将实施例1-3以及对比例1-2配置成质量分数为1％，10％的抑菌液，各加3mL到平皿中与10mL的营养琼脂培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，最终PH7.3-7.5)混合，制成抑菌平板。供试病菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合菌)均预先在营养琼脂培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，最终pH7.3-7.5)中培养，用孔径为0.5cm的打孔器在菌落边缘切取生长一致的菌块作为接种体。将接种体移入抑菌平板中央。以无菌蒸馏水作为对照，置25℃恒温培养。用十字交叉法测量菌落直径，并校正，计算抑菌百分率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径)×100％。检测结果如下表所示：
参阅上表数据，根据实施例与对比例1-2比较，可知本发明中的抑菌剂较现有技术中的抑菌剂更适用于苹果组培技术，具有更好的抑菌效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。