阅读说明：本技术 普鲁兰短梗霉发酵产物及其制法及减少真菌病害的微生物制剂与减少农产品真菌病害的方法 (Aureobasidium pullulans fermentation product and preparation method thereof, microbial preparation for reducing fungal diseases and method for reducing fungal diseases of agricultural products ) 是由 洪怡芳 黄乔盈 刘桂郁 赖进此 于 2020-02-21 设计创作，主要内容包括：本公开提供一种普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)的发酵产物,其中普鲁兰短梗霉的发酵产物的形成方法,包括：将至少一种普鲁兰短梗霉以培养基进行发酵培养,以形成发酵液,其中培养基成分包括：酵母萃取物；麦芽萃取物；消化蛋白(Peptone)；以及右旋糖(dextrose)。本公开亦提供一种普鲁兰短梗霉的发酵产物的制备方法,一种微生物制剂及一种减少农产品的真菌病害的方法。(The present disclosure provides a fermentation product of Aureobasidium pullulans (Aureobasidium pullulans), wherein a method for forming the fermentation product of Aureobasidium pullulans comprises: subjecting at least one pullulan to fermentation culture in a culture medium to form a fermentation broth, wherein the culture medium comprises: a yeast extract; a malt extract; digestive proteins (Peptone); and dextrose (dextrose). The present disclosure also provides a method of preparing a fermentation product of aureobasidium pullulans, a microbial preparation and a method of reducing fungal diseases of agricultural products.)

普鲁兰短梗霉发酵产物及其制法及减少真菌病害的微生物制 剂与减少农产品真菌病害的方法

技术领域

本公开提供一种普鲁兰短梗霉的发酵产物及其制备方法。本公开另提供一种微生物组成。本公开又提供一种减少农产品的真菌病害的方法。

背景技术

中国台湾地处热带及亚热带交界，气候温暖潮湿，农产品于采收后到配送至销售市场、由消费者购买的过程中，容易受到侵染型真菌病原菌 (postharvest fungalpathogen)的感染，而造成农产品腐坏。为了避免农产品于采收后的配送过程中的损害，采收后的病害防治与延长保鲜处理是重要的课题。

目前主要的采收后病害防治与延长保鲜技术主要可分为物理、化学与微生物法。物理抑菌保鲜方式是在运送过程中维持低温以避免微生物孳生。此方法不需要使用化学物质，因此不会对人体造成伤害，但仪器设施的投资成本高，且需消耗大量电力，较难普及应用。

化学法是使用化学物质达到抑菌的效果，虽然不需使用仪器设备因此价格低廉，且化学物质的效果显著，然而化学物质残留于农产品上，人体食用后恐有造成毒性的潜在风险，会造成环境及健康问题。

相较于上述方法，微生物法使用源自微生物产生的物质达到抑菌目的，例如微生物来源的乳酸链球菌素(Nisin)、ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine)、纳他霉素(Natamycin)等(Xing et al.,2015,Liu et al.,2015)。微生物法主要要求天然、安全，目前已逐步取代物理或化学方式，但多数微生物抗菌范围较小，对病原菌的控制效果受到局限。

有研究指出，利用微生物防治农产品收获后病害的机制主要可分类为1) 病原菌的营养竞争、2)诱导宿主产生抗病性、或3)微生物本身分泌水解酵素，分解病原菌细胞壁，因而抑制病原菌生长(Davide and Samir,2016)。此外，亦有研究指出1％普鲁兰短梗霉胞外多糖可以降低油桃的失重率和腐烂率，保持果实光泽，达到较好的保鲜效果(欧阳等，2010)。然而，目前尚无针对中国台湾常见的侵染型真菌病害，例如青霉病、炭疽刺盘孢病、灰霉病等的微生物型抑菌保鲜剂。

现有的微生物虽大致符合需求，然而其为单方剂型对病原菌适用范围窄，因此需要能广效抑菌的微生物。

发明内容

本公开提供一种普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)的发酵产物，其中普鲁兰短梗霉的发酵产物的形成方法，包括：将至少一种普鲁兰短梗霉以培养基进行发酵培养，以形成发酵液，其中于该培养基成分包括，包括：酵母萃取物；麦芽萃取物；消化蛋白(peptone)；以及右旋糖(dextrose)。

本公开还提供一种减少真菌病害的微生物制剂，包括：如前述的普鲁兰短梗霉的发酵产物，其中减少真菌病害的微生物组成具有减少由真菌造成的真菌病害的功效。

本公开另提供一种发酵产物的制备方法，系使用如前述的普鲁兰短梗霉的发酵产物。

本公开又提供一种减少农产品的真菌病害的方法，将前述的微生物制剂施作于一农产品。

本公开再提供一种新颖的普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)，其为在2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930198。

本公开又提供一种新颖的普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)，其为在2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930199。

附图说明

图1为一实施例的普鲁兰短梗霉发酵产物对于抑制芒果表皮黑斑形成的图表。

图2A-图2B为普鲁兰短梗霉株BCRC 930198以马铃薯右旋糖琼胶在 25℃，培养7天的菌落正面。

图2C为普鲁兰短梗霉株BCRC 930198以麦芽萃取物琼胶在25℃，培养 7天的菌落正面。

图2D-图2H为普鲁兰短梗霉株BCRC 930198的产孢构造与分生孢子的显微构造。图中的粗黑线为比例尺，代表10μm。

图2I为普鲁兰短梗霉株BCRC 930198的结晶体的显微构造。图中的粗黑线为比例尺，代表10μm。

图2J-图2L为普鲁兰短梗霉株BCRC 930198的分生孢子的显微构造。图中的粗黑线为比例尺，代表10μm。

图3A-图3B为普鲁兰短梗霉株BCRC 930199以马铃薯右旋糖琼胶在 25℃，培养7天的菌落正面。

图3C为普鲁兰短梗霉株BCRC 930199以麦芽萃取物琼胶在25℃，培养 7天的菌落正面。

图3D-图3F为普鲁兰短梗霉株BCRC 930199的产孢构造与分生孢子的显微构造。粗黑线为比例尺，代表10μm。

图3G为普鲁兰短梗霉株BCRC 930199的结晶体的显微构造。粗黑线为比例尺，代表10μm。

图3H-图3J为普鲁兰短梗霉株BCRC 930199的分生孢子的显微构造。粗黑线为比例尺，代表10μm。

具体实施方式

鉴于上述课题，于本公开中从中国台湾本土采样、收集保存的普鲁兰短梗霉种资源中，建立普鲁兰短梗霉发酵物抑菌筛选方法，筛选出具有胞外多糖生产潜力的普鲁兰短梗霉，并从中筛选出两株具有抑制真菌的普鲁兰短梗霉，作为广效型天然抗菌的微生物，克服目前微生物保鲜抑菌法所面临的单方剂型对病原菌适用范围窄，而使病害控制效果受局限的问题。

在本公开一第一实施方式中，本公开提供一种普鲁兰短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)的发酵产物。本公开的普鲁兰短梗霉的发酵产物具有抑制真菌生长的功效，但不限于此。

其中形成上述普鲁兰短梗霉的发酵产物的方法，可包括但不限于，将普鲁兰短梗霉以培养基进行发酵培养，以形成发酵液，以获得所述普鲁兰短梗霉的发酵产物。

上述培养基的成分，可包括酵母萃取物、麦芽萃取物、消化蛋白(peptone) 与右旋糖(dextrose)，但不限于此。

酵母萃取物的浓度可为约1-15g/L，例如约1-5g/L、1-8g/L、1.5-10g/L、 2-6g/L，但不限于此。在一实施例中，可为3g/L。

麦芽萃取物的浓度可为约1-15g/L，例如1-5g/L、1-8g/L、1.5-10g/L、 2-6g/L，但不限于此。在一实施例中，可为3g/L。

消化蛋白的浓度可为约1-20g/L，例如1-15g/L、1-10g/L、2-18g/L、3-12g/L，但不限于此。在一实施例中，可为5g/L。

右旋糖的浓度可为约1-50g/L，例如5-30g/L、5-20g/L、3-20g/L、5-18g/L，但不限于此。在一实施例中，可为10g/L。

上述发酵培养的温度并无特别限制只要适合普鲁兰短梗霉生长即可，例如15-30℃之间，例如22-28℃，但不限于此，在一实施例中可为25℃。上述发酵培养的方式也无特别限制，可为批次培养或连续培养。在一实施例中，发酵培养可由一培养槽进行。

上述发酵培养的培养槽的转速可为100-200rpm，但不限于此，在一实施例中可为150rpm。

上述发酵培养的培养时间为24-72小时，但不限于此，在一实施例中可为48小时。

又，在另一实施例中，前述形成上述普鲁兰短梗霉的发酵产物的方法，在形成上述发酵液之后，还可包括使发酵液中的菌体失活的步骤和/或将菌体自发酵液去除。使发酵液中的菌体失活的步骤，包括但不限于例如将发酵产物以酸或碱处理；将菌体自发酵液去除的步骤，包括但不限于过滤菌体获得滤液、或是将发酵产物进行萃取。

用于形成本公开的普鲁兰短梗霉的发酵产物的实施例中所采用的至少一普鲁兰短梗霉的例子可包括，在2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930198(其也为在2018年11月13日保藏于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)的普鲁兰短梗霉，保藏编号为DSM 32955)、保藏编号为BCRC 930199的普鲁兰短梗霉 (其也为在2018年11月13日保藏于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)的普鲁兰短梗霉，保藏编号为DSM32956)等，或上述的任意组合，但不限于此。

在一实施例中，前述普鲁兰短梗霉为在2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and ResearchCenter；BCRC)的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930198。在另一实施例中，前述普鲁兰短梗霉为2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930199。在又另一实施例中，前述普鲁兰短梗霉为BCRC 930198及BCRC930199的组合。

上述本公开的普鲁兰短梗霉的发酵产物，由于本公开的普鲁兰短梗霉的发酵产物具有抑制真菌生长的功效，因此可应用于减少真菌病害的用途，例如能够抑制农产品的真菌病害。

上述真菌病害包括但不限于青霉病、炭疽刺盘孢病、灰霉病、萎凋软腐病、黑根霉病及西红柿早疫病。

上述真菌病害的真菌包括但不限于青霉菌属(Penicillium)真菌、炭疽刺盘孢菌属(Colletotrichum)真菌、灰霉菌属(Botrytis)真菌、萎凋软腐菌属(Fusarium) 真菌、黑根霉菌属(Rhizopus)真菌或链隔孢菌属(Alternaria)真菌等。

上述青霉菌属真菌，可包括但不限于指状青霉菌(Penicillium digitatum)、扩展青霉菌(Penicillium expansum)、贴皮状青霉菌(Penicillium crustosum)及意大利青霉菌(Penicillium italicum)。

上述炭疽刺盘孢菌属可包括但不限于似胶黏孢炭疽刺盘孢菌 (Colletotrichumgloeosporioides)。

上述灰霉菌属可包括但不限于灰霉菌(Botrytis cinerea)。

上述萎凋软腐菌属可包括但不限于镰刀菌(Fusarium incarnatum-equiseti)、及苦瓜萎凋菌(Fusarium oxysporum f.sp.Momordicae)。

上述黑根霉菌属可包括但不限于匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)。

上述链格孢菌属可包括但不限于互生链格孢菌(Alternaria alternata)。

在本公开一第二实施方式中，本公开还提供一种微生物制剂，包含任何前述本公开普鲁兰短梗霉的发酵产物，此微生物制剂可具有减少由真菌造成的真菌病害的功效。

在一实施例中，微生物制剂除了普鲁兰短梗霉的发酵产物的外，还可还包括一稀释液。于本公开的微生物制剂中，稀释液的含量并无特殊限定，可依照需求而定。稀释液的例子可包括水、生理盐水、有机溶剂等，但不限于此。

在一实施例中，微生物制剂不含有防腐剂。由于不含有对人体有害的防腐剂，因此，此微生物制剂能够使用作为不会造成人体伤害的真菌抑菌剂。

在一实施例中，微生物制剂中的普鲁兰短梗霉的发酵产物的含量可为 1-100重量％，例如约5-99重量％、约10-95重量％，但不限于此。

微生物制剂可为液状或粉状，液状使用时可将普鲁兰短梗霉的发酵产物直接使用，或以稀释液稀释使用。粉状时可将普鲁兰短梗霉的发酵产物干燥制成粉末状之后，待使用时，再以稀释剂稀释成所需抑的浓度。

在本公开一第三实施方式中，本公开还提供一种减少农产品的真菌菌害的方法。此方法可包括将任何前述本公开的微生物发酵产物施作于农产品。施作的方式并无限制，只需要将本公开的微生物发酵产物与农产品充分接触即可。

在一实施例中，施作为将农产品浸泡于含有普鲁兰短梗霉的发酵产物及稀释液所制备的微生物制剂中，浸泡时间可为1-60分钟，例如20-40分钟，但不限于此。在另一实施例中，浸泡后，将农产品取出之后，可进一步将农产品静置，以使微生物组成于农产品表面形成保护膜。静置的时间可视需要而定，例如可视当时温度、湿度进行调整，例如可为约2小时、1小时、30 分钟、10分钟，但不限于此。在一实施例中，静置时间可为30分钟。

前述农产品包括蔬菜和/或水果。蔬菜包括根茎类、叶菜类。根茎类蔬菜可包括但不限于红萝卜、白萝卜、马铃薯、芋头、番薯、山药等。叶菜类蔬菜可包括但不限于高丽菜、莴苣、美生菜等。蔬菜也可包括南瓜。水果可包括但不限于芒果、莲雾、香蕉、草莓、荔枝、枣子、李子、柑橘类、苹果、梨子、水蜜桃等。

在本公开一第四实施方式中，本公开还提供一种新颖普鲁兰短梗霉，其为于2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930198。普鲁兰短梗霉BCRC 930198的 ITS1-5.8S-ITS2序列为序列识别号:1。

在本公开一第五实施方式中，本公开还提供一种新颖普鲁兰短梗霉，其为2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)的普鲁兰短梗霉，其保藏编号为BCRC 930199。普鲁兰短梗霉BCRC 930199的 ITS1-5.8S-ITS2序列为序列识别号:2。

本公开提供一种防治水果采收后病害的微生物组成，主要通过普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)及其代谢物发酵生产的原料，对于采后水果常见的真菌病害具有抑菌效果，包含青霉病、炭疽刺盘孢病、灰霉病、萎凋软腐病以及黑根霉病等。与目前常见的化学保鲜剂相比，本发明菌株发酵周期短、制备程序简单，具天然、广效性，减少农产品的真菌病害、适合用于农产品保鲜。

为了让本公开的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本公开所述的普鲁兰短梗霉发酵产物及微生物组成以及减少农产品的真菌病害的方法及普鲁兰短梗霉。

[实施例]

[筛选普鲁兰短梗霉潜力菌株]

从由中国台湾本土进行采样、保存的普鲁兰短梗霉株库中，筛选具有抑菌能力的潜力菌株。

首先，将普鲁兰短梗霉甘油管以1％的接菌量接种至液态培养基，液态培养基的组成为去离子水中含有3g/L酵母萃取物、3g/L麦芽萃取物、5g/L 消化蛋白(Peptone)以及10g/L右旋糖(dextrose)。接着以25℃、转速150rpm、培养48小时，获得普鲁兰短梗霉发酵产物。使用此普鲁兰短梗霉发酵产物进行抑菌活性试验。

[抑菌活性试验]

抑菌试验方法，较常使用的有纸锭扩散法(Kirby-Bauer disk-diffusionmethod)以及稀释法(Dilution method)两种，而稀释法又可分为肉汤稀释法 (Brothdilution)及琼酯稀释法(Agar dilution)两种。由先前纸锭扩散法的试验例的结果得知，由于普鲁兰短梗霉发酵产物含有较高的胞外多糖，黏度比一般水溶性试样高，因此发酵产物中所含有的抗菌成分较不易扩散至培养基中。所以，后续试验使用琼酯稀释法作为抑菌活性试验的检测法。

首先依据病原真菌生长最佳条件进行培养，将不同比例的普鲁兰短梗霉发酵产物试样分别与麦芽萃取物琼胶(malt extract agar，MEA)或马铃薯右旋糖琼胶(potatodextrose agar，PDA)培养基混合均匀后倒入培养皿中静置，待培养基凝固，制备含有普鲁兰短梗霉发酵产物的琼胶。接着，将生长于平板上的霉菌以刀片切成约0.5x0.5cm²大小，将此霉菌菌丝块放置于制备好的含有普鲁兰短梗霉发酵产物的琼胶中央表面上，以24～26℃培养7天后观察结果菌丝生长情形，同时比较空白对照组的结果，判读最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。

由上述抑菌活性试验，共筛选6株具潜力的β-葡聚醣生产菌株，挑选其中两株功效最佳的普鲁兰短梗霉，其代号分别为08F0543及08F0544作为后续抑菌实验的菌株。

将普鲁兰短梗霉08F0543及08F0544进行rDNA-内转录间隔(internaltranscribed spacer,ITS)的ITS1-5.8S-ITS2序列片段进行定序分析。

08F0543的ITS1-5.8S-ITS2序列片段为序列识别号:1(完整序列请参照序列表的序列识别号:1)；08F0544的ITS1-5.8S-ITS2序列片段为序列识别号:2(完整序列请参照序列表的序列识别号:2)，两者比对结果皆显示与普鲁兰短梗霉产黑色素变种(Aureobasidium pullulans var.melanogenum)BCRC 34543T(＝ATCC 12536T＝CBS105.22T)以及普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)NRRL Y-12996(＝ATCC 42023)最为接近。序列识别号:1及序列识别号:2与普鲁兰短梗霉NRRL Y-12996(＝ATCC 42023)(GenBank accession no.HQ702508)的序列相比，第59-542的核苷酸相同，由此可知08F0543及 08F0544属于普鲁兰短梗霉；然而，3’端多出58个核苷酸以及5’端多出 80个核苷酸(78％相似度(484/622))。由上述可知，08F0543及08F0544为新颖普鲁兰短梗霉株。

依据参考文献Zalar et al.(2008)鉴定普鲁兰短梗霉株08F0543及08F0544 隶属于普鲁兰短梗霉，菌名为普鲁兰短梗霉产黑色素变种(Aureobasidium pulllulansvar.melanogenum)。

并将此2菌株在2018年10月26日保藏于中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)，08F0543的保藏编号为BCRC 930198(其也为在2018年11 月13日保藏于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ，保藏编号为DSM 32955)， 08F0544的保藏编号为BCRC 930199的普鲁兰短梗霉(其也为在2018年11 月13日保藏于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,DSMZ，保藏编号为DSM 32956)。

针对此两株普鲁兰短梗霉株(保藏编号BCRC 930198、BCRC 930199)与已知的普鲁兰短梗霉株BCRC 930184进行分析。结果如表1。

[表1]

普鲁兰短梗霉株BCRC 930198及BCRC 930199的产黑色素能力与其他普鲁兰短梗霉差异不大，而普鲁兰短梗霉株BCRC 930184为黑色素产量低的菌种。此外，普鲁兰短梗霉株BCRC 930198、BCRC 930199的发酵产物具有显著的抑菌能力，而普鲁兰短梗霉株BCRC930184则是β-葡聚醣产量高的菌株。由上述生理生化特性亦能明白，由前述抑菌活性试验所筛选的普鲁兰短梗霉株BCRC 930198、BCRC 930199与BCRC 930184为不同的普鲁兰短梗霉。

将普鲁兰短梗霉株BCRC 930198接种于麦芽萃取物琼胶及马铃薯右旋糖琼胶，进行形态观察。麦芽萃取物琼胶，25℃培养7天，菌落平滑、黏稠，菌落中心呈黏液状，颜色呈暗红色到红棕色(9B3-E5)，菌落周围新生部分呈白色(图2C)；马铃薯右旋糖琼胶，25℃培养7天，菌落呈暗红色到红棕色(9B3-D4)，菌落会因产生结晶体而呈灰黄色(4B4-C7)，菌落周围新生部分呈白色(图2A、图2B)。在光学显微镜下观察，具有透明及褐色到黑褐色菌丝，透明菌丝平滑、薄壁，具横隔，培养时间增长会逐渐增厚；褐色菌丝，具横隔，可见黑褐色厚壁孢子(chlamydospores)产生，形状为近球形、圆柱形至不规则；产孢细胞(conidiogenouscells)未分化，位于透明菌丝中间或末端，具有小齿(denticle)；有透明及黑褐色分生孢子(conidia)，1-2个细胞，于横隔处稍内缩，形状及大小变化大，常见侧生出芽生殖，单细胞分生孢子大小为 4.7-12.9×2.3-5.2μm。

将普鲁兰短梗霉株BCRC 930199，接种于麦芽萃取物琼胶及马铃薯右旋糖琼胶，进行形态观察。麦芽萃取物琼胶，25℃培养7天，菌落平滑、黏稠，菌落中心呈黏液状，颜色呈暗红色到红棕色(9B3-E5)，菌落周围新生部分呈白色(图3C)；马铃薯右旋糖琼胶，25℃培养7天，菌落呈暗红色到红棕色 (9B3-D4)，菌落会因产生结晶体而呈灰黄色(4B4-C7)，菌落周围新生部分呈白色(图3A、图3B)。在光学显微镜下观察，具有透明及褐色到黑褐色菌丝，透明菌丝平滑、薄壁，具横隔，培养时间增长会逐渐增厚；褐色菌丝，具横隔，可见黑褐色厚壁孢子(chlamydospores)产生，形状为近球形、圆柱形至不规则；产孢细胞(conidiogenouscells)未分化，位于透明菌丝中间或末端，具有小齿(denticle)；有透明及黑褐色分生孢子(conidia)，1-2个细胞，于横隔处稍内缩，形状及大小变化大，常见侧生出芽生殖，单细胞分生孢子大小为 5.2-9.3×2.0-4.8μm。

[实施例1]

使用所挑选出的两株普鲁兰短梗霉株(保藏编号BCRC 930198、BCRC 930199)的普鲁兰短梗霉的发酵产物进行抑菌活性测试，将结果显示于表3。

发酵产物的制备方法为将普鲁兰短梗霉甘油管以1％的接菌量接种至液态培养基，液态培养基的组成为去离子水中含有3g/L酵母萃取物、3g/L麦芽萃取物、5g/L消化蛋白(Peptone)以及10g/L右旋糖(dextrose)。接着以25℃、转速150rpm、培养48小时，获得普鲁兰短梗霉发酵产物，以此普鲁兰短梗霉发酵产物制备5％、12.5％及25％(体积百分比，v/v％)的发酵液-琼酯培养基。

接菌时，分别使用普鲁兰短梗霉BCRC 930198、BCRC 930199的单独培养以及将BCRC 930198与BCRC 930199以体积比1:1混合的共培养的方式进行，所得到的发酵产物用以进行后续实验。

接着将生长于平板上的霉菌以刀片切成约0.5x0.5cm²大小，将此霉菌菌丝块放置于制备好的含普鲁兰短梗霉发酵产物培养基中央表面上，以24～ 26℃培养7天后观察结果菌丝生长情形，同时比较空白对照组的结果，判读最低抑制浓度(MIC)。将结果显示于表3，X表示无抑菌；△表示培养基变色；○表示完全抑菌。

测试的真菌病原菌包含青霉菌(指状青霉菌BCRC30820、指状青霉菌 BCRC32577、扩展青霉菌BCRC33503、贴皮状青霉菌BCRC32045、意大利青霉菌BCRC32575)、炭疽刺盘孢菌(似胶黏孢炭疽刺盘孢菌 BCRC35178)、灰霉菌(灰霉菌BCRC35340)、萎凋软腐菌(镰刀菌BCRC35290、苦瓜萎凋菌BCRC35046)、黑根霉菌(匍枝根霉菌BCRC35134)以及链隔孢菌(互生链格孢菌BCRC35015)。上述试验病原菌均从食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心取得，菌株信息及其生长条件如表2所示。

[表2]

BCRC编号	菌株	氧气需求	生长温度	培养基
					30820	指状青霉菌	需氧	25℃	麦芽萃取物琼胶(MEA)
32577	指状青霉菌	需氧	25℃	麦芽萃取物琼胶(MEA)
					33503	扩展青霉菌	需氧	26℃	麦芽萃取物琼胶(MEA)
32045	贴皮状青霉菌	需氧	24℃	麦芽萃取物琼胶(MEA)
					32575	意大利青霉菌	需氧	25℃	麦芽萃取物琼胶(MEA)
35178	似胶黏孢炭疽刺盘孢菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)
					35340	灰霉菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)
35290	镰刀菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)
					35046	苦瓜萎凋菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)
35134	匍枝根霉菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)
					35015	互生链格孢菌	需氧	24℃	马铃薯右旋糖琼胶(PDA)

[表3]

由表3的结果可知，针对青霉菌病原菌(指状青霉菌BCRC30820、指状青霉菌BCRC32577、扩展青霉菌BCRC33503、贴皮状青霉菌BCRC32045、意大利青霉菌BCRC32575)，12.5％的普鲁兰短梗霉BCRC 930198、BCRC 930199以及共培养BCRC 930198与BCRC 930199的发酵液-琼酯培养基分别对于青霉菌有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。

针对炭疽刺盘孢病原菌(似胶黏孢炭疽刺盘孢菌BCRC35178)，12.5％的普鲁兰短梗霉BCRC 930198、BCRC 930199以及共培养两者的发酵液-琼酯培养基对于炭疽刺盘孢病原菌有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。

针对灰霉病原菌(灰霉菌BCRC35340)，25％的普鲁兰短梗霉BCRC 930198的发酵液-琼酯培养基对于灰霉病原有抑菌效果，最低抑制浓度为 25％；12.5％以及25％的普鲁兰短梗霉BCRC 930199以及共培养BCRC 930198与BCRC 930199的发酵液-琼酯培养基对于灰霉病原有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％；12.5％的普鲁兰短梗霉BCRC 930199的发酵液-琼酯培养基对于灰霉病原有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。

针对萎凋软腐病原菌(镰刀菌BCRC35290)，12.5％的普鲁兰短梗霉 BCRC 930198、BCRC 930199以及共培养两者的发酵液-琼酯培养基对于炭疽刺盘孢病原菌有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。然而针对苦瓜萎凋菌 BCRC35046，则普鲁兰短梗霉BCRC 930198、BCRC 930199以及共培养两者的发酵液-琼酯培养基皆无抑菌效果。

针对黑根霉病原菌(匍枝根霉菌BCRC35134)，12.5％的普鲁兰短梗霉 BCRC930198、BCRC 930199以及共培养两者的发酵液-琼酯培养基对于炭疽刺盘孢病原菌有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。

针对链隔孢菌(互生链格孢菌BCRC35015)，12.5％的普鲁兰短梗霉 BCRC 930198、BCRC 930199以及共培养两者的发酵液-琼酯培养基对于链隔孢菌有抑菌效果，最低抑制浓度为12.5％。

由上述结果可知，普鲁兰短梗霉BCRC 930198以及BCRC 930199的发酵液-琼酯培养基分别对于包括青霉菌、炭疽刺盘孢菌、灰霉菌、萎凋软腐病原菌、黑根霉病原菌及链隔孢菌等真菌皆有抑菌效果，是广泛的真菌抑菌剂。

[实施例2]

使用所挑选出的两株普鲁兰短梗霉株(保藏编号BCRC 930198、BCRC 930199)的普鲁兰短梗霉的发酵产物以与实施例1相同的方法制备普鲁兰短梗霉的发酵产物，以此普鲁兰短梗霉发酵产物制备0.01～25％的系列稀释发酵液-琼酯培养基。使用炭疽刺盘孢病原菌(似胶黏孢炭疽刺盘孢菌 BCRC35178)作为测试菌株，以与实施例1相同的方法进行抑菌测试，将结果显示于表4，X表示无抑菌；○表示完全抑菌。

[表4]

由表4的结果可知，普鲁兰短梗霉BCRC 930198发酵产物的最小抑菌浓度为7.5％，普鲁兰短梗霉BCRC 930199发酵产物的最小抑菌浓度为2.5％。由上述结果可知，普鲁兰短梗霉BCRC 930198及BCRC 930199的发酵产物，皆可在低浓度即具有抑制真菌生长的效果。

[实施例3]

将实施例1制备的普鲁兰短梗霉BCRC 930198以及BCRC 930199的发酵产物以体积比1:1配置成混合物之后，接着进行碱处理使菌体失活，获得发酵代谢物。具体而言，于发酵产物中添加氢氧化钠(NaOH)，使氢氧化钠的最终浓度为500mM。

使用上述使菌体失活的发酵代谢物，制备25％、50％及75％的发酵代谢物-琼酯培养基，进行抑菌测试。将结果显示于表5，X表示无抑菌；○表示完全抑菌。

[表5]

针对青霉菌的指状青霉菌BCRC30820、扩展青霉菌BCRC33503、贴皮状青霉菌BCRC32045的抑菌结果，随着普鲁兰短梗霉发酵代谢物浓度的提高，平板中央病原菌菌丝生长直径范围显著越小。

普鲁兰短梗霉发酵代谢物对于青霉菌指状青霉菌BCRC32577的抑制浓度为50％；对于青霉菌意大利青霉菌BCRC32575的抑制浓度为75％。

针对灰霉病原菌的灰霉菌BCRC35340、以及萎凋软腐病原菌的苦瓜萎凋菌BCRC35046、镰刀菌BCRC35290及西红柿早疫病的互生链格孢菌 BCRC35015的抑菌结果，随着普鲁兰短梗霉发酵代谢物浓度的提高，平板中央病原菌菌丝生长直径范围显著越小。

针对黑根霉病原菌匍枝根霉菌BCRC35134的抑制结果，普鲁兰短梗霉发酵代谢物对于此菌的抑制浓度为50％。

针对炭疽刺盘孢病原菌似胶黏孢炭疽刺盘孢菌BCRC35178的抑制结果，普鲁兰短梗霉发酵代谢物对于此菌的抑制浓度为75％。

由上述结果可知，即使使普鲁兰短梗霉发酵产物中的菌体失活，保留发酵代谢物，其中的抑菌成分对于真菌病原菌也具有抑制的效果，因此可推测抑菌机制来自普鲁兰短梗霉发酵的二次代谢物。

[实施例4]

似胶黏孢炭疽刺盘孢菌是造成中国台湾水果主要侵染型病害的真菌的一。检验普鲁兰短梗霉发酵产物对于似胶黏孢炭疽刺盘孢菌的抑制生长效果。

将实施例3的普鲁兰短梗霉发酵产物以蒸馏水分别稀释成为25％、50％、 75％以及100％。使用亚托敏(23％水悬剂)(厂商：光华化学)作为正对照组，将芒果分别浸泡各组别的溶液1分钟后，取出静置60分钟。负对照组为不浸泡任何溶液。

之后，以3ml针筒于芒果表皮切割1.6-1.7mm的伤口后，接种似胶黏孢炭疽刺盘孢菌(施打5μL菌液/颗,菌液浓度为7.1x106 CFU/ml)，于13℃放置 15天，分别测量第4、6、8、11及15天的芒果表皮形成黑斑的直径。将结果显示于图1。此外，在第13天观察芒果表皮的结果，有浸泡普鲁兰短梗霉发酵产物的发病率为<30％。

由图1的结果可知，第15天的果实病斑直径比对照组降低了50～80％，能够达到与使用农药处理的相同效果。然而，本公开的普鲁兰短梗霉发酵产物不含防腐剂，是天然的真菌抑制剂。

虽然本发明已以数个优选实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内，当可作任意的变动与修饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

关于生物材料的保藏

1.普鲁兰短梗霉08F0543

中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心

2018年10月26日

保藏编号为BCRC 930198

2.普鲁兰短梗霉08F0544

中国台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心

2018年10月26日

保藏编号为BCRC 930199

序列表（SEQUENCE LISTING）

<110> 财团法人食品工业发展研究所

<120> 普鲁兰短梗霉的发酵产物及其制备方法以及减少真菌病害的微生物制剂与减少农产品的真菌病害的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 622

<212> DNA

<213> 普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）

<400> 1

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<213> 普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）

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