一种淡紫拟青霉微囊悬浮剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种淡紫拟青霉微囊悬浮剂及其制备方法 (Paecilomyces lilacinus microcapsule suspending agent and preparation method thereof ) 是由 钟增明 于 2021-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明提出一种淡紫拟青霉微囊悬浮剂,由用于形成油相的成分、用于形成水相的成分和囊壁材料组成；所述用于形成油相的成分包括淡紫拟青霉浓缩菌液和助剂；所述用于形成水相的成分包括乳化剂、淡紫拟青霉上清液,所述囊壁材料通过囊壁材料预聚体聚合而成,所述囊壁材料预聚体包括异氰酸酯和有机胺。所述助剂包括酸碱调节剂、分散剂、溶剂油、防冻剂、消泡剂、防腐剂、粘度调节剂中的一种或多种；所述淡紫拟青霉浓缩菌液和上清液是分离淡紫拟青霉发酵菌液得到的。本发明提出的淡紫拟青霉微囊悬浮剂,其水相和油相内分别含有淡紫拟青霉菌的代谢产物和有效活菌,与常规粉剂、颗粒剂、水分散剂相比,微囊悬浮剂保质期更长、性能更稳定。(The invention provides a paecilomyces lilacinus microcapsule suspending agent which consists of an oil phase forming component, a water phase forming component and a capsule wall material; the components for forming the oil phase comprise paecilomyces lilacinus concentrated bacterial liquid and an auxiliary agent; the components for forming the water phase comprise an emulsifier and paecilomyces lilacinus supernatant, the capsule wall material is formed by polymerizing a capsule wall material prepolymer, and the capsule wall material prepolymer comprises isocyanate and organic amine. The auxiliary agent comprises one or more of an acid-base regulator, a dispersing agent, solvent oil, an antifreezing agent, a defoaming agent, a preservative and a viscosity regulator; the paecilomyces lilacinus concentrated bacterial liquid and the supernatant are obtained by separating paecilomyces lilacinus fermented bacterial liquid. The paecilomyces lilacinus microcapsule suspending agent provided by the invention contains metabolites and effective viable bacteria of paecilomyces lilacinus in a water phase and an oil phase respectively, and compared with conventional powder, granules and water dispersing agents, the microcapsule suspending agent has the advantages of longer shelf life and more stable performance.)
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉生物菌剂及其制备的方法。
背景技术
淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson）是丝孢菌科、拟青霉属真菌，属于寄生性真菌，其分泌代谢产生多种有机酸、酶、生理活性物质。淡紫拟青霉能寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，淡紫拟青霉孢子萌发后，所产生的菌丝可穿透线虫的卵壳、幼虫及雌性成虫体壁，菌丝在线虫体内吸取营养，进行繁殖，破坏了卵、幼虫及雌性成虫的正常生理代谢，从而导致植物线虫死亡。
淡紫拟青霉菌不但能抑制线虫侵染，还能促进植物根系及植株营养器官的生长（淡紫拟青霉菌剂的研究开发，潘沧桑，精细与专用化学品，2003，11(6)），宜采用播前拌种、定植时穴施等施用方式。因此，需要有稳定性好、容易分散的淡紫拟青霉菌剂。微生物菌剂的剂型主要有粉剂、颗粒剂、悬浮剂、悬浮乳剂等，对于拌种用菌剂，粉剂和颗粒剂不如液体剂型施用方便；而常见的液体菌剂剂型中悬浮剂或悬浮乳剂则存在稳定性和分散性较差的缺陷。因此，有必要开发出淡紫拟青霉微囊悬浮剂，以提高液体菌剂的稳定性和分散性。
微囊悬浮剂的制备方法包括界面聚合法、复凝聚法和原位聚合法。界面聚合法采用的成囊材料毒性较高，更适于非生物类的材料；复凝聚法所用的囊壁材料为明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠等，天然无毒、生物相容性好，但微囊的包封率不高，胶囊稳定性较差。而用预聚体聚合得到囊壁材料的原位聚合法，其原材料简单易得，囊壁材料无毒、可降解；且该法制备的微胶囊包封率高，稳定性好，抗水渗透能力强，微囊的粒径也更均匀。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种淡紫拟青霉微囊悬浮剂，以提高淡紫拟青霉的施用效果。
本发明的第二个目的是提出所述淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备方法。
为实现本发明上述目的的技术方案为：
一种淡紫拟青霉微囊悬浮剂，由用于形成油相的成分、用于形成水相的成分、囊壁材料组成；
所述用于形成油相的成分包括淡紫拟青霉浓缩菌液和助剂；所述用于形成水相的成分包括乳化剂、淡紫拟青霉上清液；所述囊壁材料通过囊壁材料预聚体聚合而成，所述囊壁材料预聚体包括异氰酸酯和有机胺；所述助剂包括酸碱调节剂、分散剂、溶剂油、防冻剂、消泡剂、防腐剂、粘度调节剂中的一种或多种；
所述淡紫拟青霉浓缩菌液和上清液是分离淡紫拟青霉发酵菌液得到的。
具体地，所述淡紫拟青霉浓缩菌液和上清液是离心分离淡紫拟青霉发酵菌液得到的。
优选地，所述淡紫拟青霉浓缩菌液的浓度为150~300亿/mL；用于形成油相的成分中所述淡紫拟青霉浓缩菌液的质量比例为1~50%。
其中，所述异氰酸酯、有机胺的质量比为1：（1~3）；所述异氰酸酯为TDI（甲苯二异氰酸酯）、异佛尔酮二异氰酸酯三聚体（IPDI）、六亚甲基二异氰酸酯（HDI）、HDI缩二脲、HDI三聚体、TDI三聚体、二环己基甲烷二异氰酸酯（HMDI）及其加成物中的一种或多种；所述有机胺为四乙烯五胺（TEPA）或三乙烯四胺（TETA）。
以异氰酸酯为材料制备的微囊对作物根系生长无抑制作用；所述有机胺优选用三乙烯四胺（TETA），获得的微囊粒径更小。
其中，所述溶剂油为大豆油、正己烷、松脂基溶剂ND-45、苯、甲苯、二甲苯、脂肪烃溶剂油、环己酮、甲酯化植物油、矿物油、芳烃溶剂油、二氯甲烷、石油醚、松子基油、100号溶剂油、150号溶剂油、200号溶剂油中的一种或多种；
所述乳化剂为十二烷基硫酸钠（SDS）、烷基酚聚氧乙烯醚、环氧乙烷环氧丙烷嵌段共聚醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙烯苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙烯基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、烷基萘甲醛缩合物磺酸钠、烷基丁二酸酯磺酸钠、司班和吐温中的一种或多种。
所述分散剂为萘磺酸盐甲醛缩合物、三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚硫酸酯铵盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、EO-PO嵌段共聚物、苯乙烯苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙烯基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、烷基萘甲醛缩合物磺酸钠、聚合羧酸钠、亚甲基萘磺酸盐、聚羧酸盐、木质素磺酸盐、吡咯烷酮、茶皂素、双酚A类分散剂中的一种或多种；
其中，所述酸碱调节剂为硫酸、盐酸、磷酸乙酸、草酸、柠檬酸、硫酸铵、氯化铵、氯化锌、硫酸锌、三乙醇胺、二乙胺、三乙胺、乙二胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的一种或多种；
所述黏度调节剂为聚乙二醇、聚乙烯醇、硅酸镁铝、膨润土、高龄土、硅藻土、凹凸棒土、羧甲基纤维素、黄原胶、羧甲基淀粉、壳聚糖中的一种或多种。
所述防冻剂包括但不限于乙二醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇或尿素中的一种或多种；
所述消泡剂包括但不限于环氧大豆油、环氧亚麻油、脂肪酸、环氧酯、木糖醇中的一种或多种；
所述防腐剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、甲醛和异噻唑啉酮类中的一种或多种。
所述的淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备方法，包括步骤：
1）通过液体深层发酵获得淡紫拟青霉发酵液，发酵液中菌含量为20~40亿/mL，
2）通过离心获得浓缩菌液，浓缩菌液的浓度为150~300亿/mL，上清液收集备用，
3）浓缩液与异氰酸酯混和，按顺序加入溶剂油、分散剂，加入助剂并调节pH值至5.5~8.5，搅拌均匀制得油相；上清液与乳化剂、有机胺混和制得水相，把油相和水相混和。
其中，所述液体深层发酵的培养基配方为：蔗糖10克、酵母粉20克、蛋白胨4g、MgSO4·7H2O 0.5克、KH2PO4 0.5克、豆饼粉5克。将上述成分混和并加水至1000毫升，用盐酸调pH到5.6，灭菌后即为发酵培养基。
在制备过程中，控制pH值5.5~8.5可以提供淡紫拟青霉的适宜生存条件。优选控制pH值6.5~8.0。
其中，所述油相、水相的质量比例为1：（0.8~1.2）。助剂占所述油相和水相的总质量的比例可以为0.1~10%。
步骤3）中，在剪切条件下把油相倒入水相，剪切速率优选在1500r/min~5000r/min，以获得较小的微囊粒径；优选剪切速率2000~3000r/min，5min。
淡紫拟青霉培养的步骤包括接种到斜面培养基上培养、摇瓶培养、发酵罐内液体深层发酵等几个主要步骤。斜面培养的培养基的配方可采用本领域已知的配方，例如为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克，将各组分混和溶解，加水定容至1000毫升，用盐酸调pH到5.6，灭菌后即为斜面培养基；
摇瓶培养的培养基配方可以与液体深层培养的培养基配方一样。
进一步优选地，所述液体深层发酵的条件为：取处于对数生长中后期的种子培养物，以5~8％(V/V)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，保持罐温22~28℃、罐压0.1~1.0 kg/cm，搅拌速率100-200rpm，通气量1∶（0.5~0.8），发酵培养时间60~96小时, 优选70~85小时。
采用深层发酵方法，可以在较短的时间内获得较高的活菌数，提高了生产效率。
本发明所述的质量份，可以是克、公斤、斤、吨，或为了操作方便自己定义的质量单位。在同一个配方中，“份”表示的单位质量相同。本发明所述配方，可按比例放大或缩小，或按本领域已知的手段制成液体或固体的培养基。
本发明的有益效果在于：
本发明提出的淡紫拟青霉微囊悬浮剂，其水相和油相内含有淡紫拟青霉菌的代谢产物和有效活菌（分生孢子），与常规粉剂、颗粒剂、水分散剂相比，微囊悬浮剂性能更稳定。
本制备方法制得的悬浮微囊悬浮剂，油相和水相相容性好，油相对分生孢子起到包裹和隔离氧气和水分的作用，使分生孢子处于稳定的休眠状态，显著地延长了淡紫拟青霉分生孢子的储存时间，防治效果大大提高。
本制备方法中，水相采用离心发酵液后的上清液，不但节约了水的用量，而且提高了产品中有效活菌（分生孢子）数，发酵液对植物生长也提供了营养成分。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不应用来限制本发明的范围。实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规技术手段。
实施例中的份数，如无特别说明，均指质量份。如无特别说明，所用比例均为质量比。
淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌种保藏号CGMCC No. 11579，保藏时间为2015年10月30日，地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例1： 液体深层发酵制备淡紫拟青霉发酵菌液
发酵培养基的制备：称取蔗糖10克、酵母粉 20克、蛋白胨4g、MgSO4·7H2O 0.5克、KH2PO4 0.5克、豆饼粉5克，加水至1000毫升，用盐酸调pH到5.6，灭菌后即为发酵培养基。按此配方放大即为在发酵罐内深层发酵的培养基。本实施例培养基体积为5000L。
取处于对数生长中后期的种子培养物，以8％(V/V)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间60小时。
发酵菌液中菌含量为20亿/mL。
实施例2 淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备
本实施例提出的淡紫拟青霉微囊悬浮剂由用于形成油相的成分、用于形成水相的成分和囊壁材料组成；所述用于形成油相的成分包括淡紫拟青霉浓缩菌液和助剂；所述用于形成水相的成分包括乳化剂、淡紫拟青霉上清液；所述囊壁材料通过囊壁材料预聚体聚合而成，所述囊壁材料预聚体包括异氰酸酯和有机胺，所述助剂包括酸碱调节剂、分散剂、溶剂油；所述淡紫拟青霉浓缩菌液和上清液是分离淡紫拟青霉发酵菌液得到的。
所述淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备方法为：
1）通过液体深层发酵工艺获得淡紫拟青霉发酵菌液，发酵菌液中菌含量为20~40亿/mL，
2）通过离心获得浓缩菌液，浓缩菌液的浓度为150~300亿/mL，上清液倒出备用，
3）浓缩液与TDI三聚体混和，按顺序加入分散剂、溶剂油，加入酸碱调节剂调节pH值至5.5~8.5，搅拌均匀制得油相。
4）上清液与乳化剂、三乙烯四胺混和搅拌均匀制得水相，在剪切条件下把油相倒入水相（剪切速率3000r/min，5min）即得淡紫拟青霉微囊悬浮剂。
本实施例中，发酵菌液中菌含量为20亿/mL，离心条件为：10000rpm 15分钟，获得的浓缩菌液的浓度为150亿/mL。分散剂为Sokalan CP（聚羧酸盐），溶剂油为大豆油。
其中，所述TDI三聚体、三乙烯四胺、上清液的用量比为1g：1.5g：100mL，上清液中加有1%（质量比）的SDS。步骤3）中浓缩液、分散剂、溶剂油的质量比为2: 2：35，用酸碱调节剂乙二胺调节pH值至7.5；
步骤4）中，水相和油相按质量比1:1混和。
表1：实施例2淡紫拟青霉微囊悬浮剂检测结果
实施例3：液体深层发酵制备淡紫拟青霉发酵菌液
发酵培养基的制备同实施例1。
取处于对数生长中后期的种子培养物（培养方法同实施例1，2），以8％(V/V)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间72小时。
发酵菌液中菌含量为30亿/mL。
实施例4 淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备
1）通过液体深层发酵工艺获得淡紫拟青霉发酵菌液，发酵菌液中菌含量为20~40亿/mL，
2）通过离心获得浓缩菌液，浓缩菌液的浓度为150~300亿/mL，上清液倒出备用，
3）浓缩液与TDI三聚体混和，按顺序加入分散剂、溶剂油，加入酸碱调节剂调节pH值至5.5~8.5，搅拌均匀制得油相。
4）上清液与乳化剂、三乙烯四胺混和搅拌均匀制得水相，在剪切条件下把油相倒入水相（剪切速率3000r/min，5min）。
本实施例中，发酵菌液中菌含量为30亿/mL，离心条件为：10000rpm 15分钟，获得的浓缩菌液的浓度为200亿/mL。
成分比例同实施例2。
表2：实施例4淡紫拟青霉微囊悬浮剂检测结果
实施例5： 液体深层发酵制备淡紫拟青霉发酵菌液
发酵培养基的制备同实施例1。
取处于对数生长中后期的种子培养物，以8％(V/V)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间84小时。发酵菌液中菌含量为40亿/mL。
实施例6 淡紫拟青霉微囊悬浮剂的制备
1）通过液体深层发酵工艺获得淡紫拟青霉发酵菌液，发酵菌液中菌含量为20-40亿/mL，
2）通过离心获得浓缩菌液，浓缩菌液的浓度为150-300亿/mL，上清液倒出备用，
3）浓缩液与TDI三聚体混和，按顺序加入分散剂、溶剂油，加入酸碱调节剂调节pH值至5.5~8.5，搅拌均匀制得油相；分散剂为Sokalan CP（聚羧酸盐），溶剂油为大豆油。
4）上清液与乳化剂、三乙烯四胺混和搅拌均匀制得水相，在剪切条件下把油相倒入水相。（剪切速率3000r/min，5min）。
本实施例中，发酵菌液中菌含量为40亿/mL，离心条件为：10000rpm 15分钟，获得的浓缩菌液的浓度为300亿/mL。
成分比例同实施例2。
表3：实施例6淡紫拟青霉微囊悬浮剂检测结果
实施例7： 液体深层发酵制备淡紫拟青霉发酵菌液
发酵培养基的制备同实施例1。
取处于对数生长中后期的种子培养物，以8％(V/V)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间90小时。发酵菌液中菌含量为30亿/mL。
生产中发现，发酵时间更长并不能获得会更多的活菌数。因此优选发酵时间70~85小时。
试验例
本试验例比较了不同剂型淡紫拟青霉的储存期。剂型分别为：
淡紫拟青霉水分散剂：实施例5所得发酵菌液离心分离出的浓缩菌液制成菌粉，加入助剂，用常规方法制成水分散剂；
淡紫拟青霉粉剂：实施例5所得发酵菌液离心分离出的浓缩菌液制成菌粉，加入助剂，用常规方法制成粉剂。
实施例6的淡紫拟青霉微囊悬浮剂。
上述剂型制成后用稀释涂布平板法进行活菌计数，经过3个月、6个月、12个月再取样用稀释涂布平板法进行活菌计数。结果见表4。
表4：活菌计数结果
剂型
3个月计数
6个月计数
12个月计数
水分散剂
12亿/mL
不能检测出
不能检测出
粉剂
25亿/g
12亿/g
不能检测出
微囊悬浮剂
37亿/mL
26亿/mL
20亿/mL
注：三个剂型的起始浓度均为40亿/mL（或40亿/克）。
水分散剂在3个月时平板上活菌数只有初始计数的30%，粉剂在3个月时平板上活菌数只为初始计数的约60%，6个月时平板上活菌数为初始计数的20-30%，至12个月时不能检出活菌数；微囊悬浮剂在3个月时平板上活菌数为初始计数的约90%，6个月时平板上活菌数为初始计数的60-70%，至12个月活菌数为初始计数的约50% 。本发明方法制得的悬浮微囊悬浮剂，显著地延长了淡紫拟青霉分生孢子的储存时间，防治效果大大提高。
虽然，上文中已经本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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