阅读说明：本技术 种植体液态存储方法 (Method for storing liquid state of implant ) 是由 邱憬 邵水易 张文思 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：种植体液态存储方法,依次用SiC防水砂纸同方向逐级打磨钛片至表面呈金属光泽,表面划痕一致,再依次以双蒸水、无水乙醇和双蒸水超声清洗；将上步所得钛片经喷砂,再依次置于丙酮、乙醇、蒸馏水中超声清洗并干燥；硝酸,氢氟酸混合液室温处理,双蒸水超声,干燥；盐酸硫酸混合酸80℃水浴处理至起泡后,双蒸水超声清洗；将维生素C溶解于生理盐水中；将所得钛片经双蒸水超声清洗后密闭、避光储存于配制好的维生素C溶液中。本发明提供的植体液态存储方法,钛表面能够被储存液提前活化,具有促进成骨细胞黏附、增殖和分化的作用,更好的促进新骨形成。同时具有良好的润湿性和生物相容性,有广泛的应用价值。(Sequentially polishing titanium sheets step by step in the same direction by using SiC waterproof abrasive paper until the surface presents metal luster and the surface scratches are consistent, and then sequentially ultrasonically cleaning by using double distilled water, absolute ethyl alcohol and double distilled water; sand blasting the titanium sheet obtained in the previous step, then placing the titanium sheet in acetone, ethanol and distilled water in sequence, ultrasonically cleaning and drying; treating the mixed solution of nitric acid and hydrofluoric acid at room temperature, performing double-distilled water ultrasound treatment, and drying; carrying out water bath treatment on hydrochloric acid and sulfuric acid mixed acid at 80 ℃ until foaming, and ultrasonically cleaning by double distilled water; dissolving vitamin C in physiological saline; and (3) carrying out ultrasonic cleaning on the obtained titanium sheet by double distilled water, and then storing the titanium sheet in a prepared vitamin C solution in a closed and lightproof manner. According to the plant fluid storage method provided by the invention, the titanium surface can be activated in advance by the storage fluid, so that the method has the effects of promoting the adhesion, proliferation and differentiation of osteoblasts and better promoting the formation of new bones. Meanwhile, the composite material has good wettability and biocompatibility and has wide application value.)

种植体液态存储方法

技术领域

本发明属于种植体存储领域，具体涉及种植体液态存储方法。

背景技术

临床常用的口腔种植系统Straumann、3i、Nobel Biocare等，均为纯钛种植体。这些系统分别采用大颗粒喷砂-酸蚀（SLA）、双重酸蚀、微弧氧化等技术构建表面微米级粗糙形貌，以促进成骨细胞的黏附、增殖和分化，增加种植体与骨的接触面积和机械嵌合力。然而，纯钛本身缺乏骨诱导性能，与周围骨组织无法形成化学结合，在植入后需要较长时间形成有力的骨结合。针对这一点，国内外学者对钛种植体表面修饰与活化进行了大量研究，期望通过合适的修饰方法，提高种植体的成骨活性，加快植入后的成骨速度，增加骨结合的强度，缩短成骨周期。因此，钛表面的修饰活化技术是口腔种植领域的研究热点之一。

但最近的研究发现，纯钛表面和修饰改性钛表面均存在时间依赖的生物活性老化现象。与新制备钛表面相比，旧的钛表面成骨细胞的黏附数量、增殖活性和成骨功能表型均显著降低。机械抛光、喷砂-酸蚀以及物理沉积钛表面均会发生老化，制备后四周钛表面的骨传导率仅为新制备钛表面的一半以下。钛表面老化后的生物相容性降低，究其原因，可能与亲水性减弱有关。新制备的钛表面具有优异的亲水性，而老化后的钛表面往往是疏水的。有研究证实：新制备钛表面在四周后即可发生老化，其表面接触角可高达60度。而钛表面的亲水性是钛种植体形成骨结合的关键性能之一。不仅如此，钛表面碳元素含量也会随着制备后时间的延长而增高，碳元素主要以碳氢化合物形式在钛表面不断积存，可使碳百分比从20%增加至60%以上。而钛表面的碳元素含量越高，成骨细胞在钛表面的黏附越少，两者呈显著的负相关。因此，碳累积效应也是钛表面老化后影响钛生物相容性的重要因素。

维生素C是胶原蛋白合成和正常骨骼发育所必需的。研究表明，维生素C可减少活性氧引起的氧化应激所导致骨吸收过程。此外，维生素C在羟脯氨酸残基的形成过程中起主要作用，它稳定了胶原的三螺旋结构。值得一提的是，大约90-95%的骨骼是由胶原蛋白组成的。因此，缺乏维生素C会阻碍胶原蛋白的合成，进而导致新骨形成的抑制。研究表明，维生素C还通过下调RANKL的表达抑制骨吸收过程。课题组前期实验将光滑钛密闭、避光储存在含维生素C的生理盐水溶液中，有利于成骨细胞的黏附、增殖和分化。基于上述理由，我们认为将钛种植体密闭、避光储存于含维生素C的溶液中使得钛种植体表面提前活化，钛种植体表面存留的维生素C能够更好的促进骨结合的过程。

随着近年来我国种植体植入数的爆发式增长，防止钛种植体老化的临床重要性日益显现。解决这一问题的关键，在于钛种植体的存储环节。然而，与钛种植体表面修饰研究的如火如荼相比，种植体存储的针对性研究相当匮乏。因此，研究提前活化钛种植体表面技术防止钛种植体表面老化使粗糙钛种植体表面具备亲水表面，使在种植体植入之初能够释放维生素C元素，也许可以更好的促进骨性结合的进程。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对现有钛种植体储存方式不足，提供一种植体液态存储方法。

技术方案：种植体液态存储方法，包括如下步骤：（1）依次用SiC防水砂纸同方向逐级打磨钛片至表面呈金属光泽，表面划痕一致，再依次以双蒸水、无水乙醇和双蒸水超声清洗；（2）将上步所得钛片用Al(OH)₃喷砂，再依次置于丙酮、75vt.%乙醇、蒸馏水中超声清洗并干燥；硝酸，氢氟酸混合液室温处理10min，双蒸水超声15min，干燥；盐酸、硫酸混合酸，80℃水浴处理至起泡后，双蒸水超声清洗；（3）配制含维生素C的生理盐水溶液；（4）将步骤（2）所得钛片经双蒸水超声清洗后密闭、避光储存于配制好的维生素C溶液中。

上述SiC防水砂纸逐级打磨的目数为320目、600目、800目、1200目、1500目。

优选的，上述Al(OH)₃喷砂的压力：0.3MPa，粒度：80目，距离：1.5cm，角度：80度，时间：15s。

优选的，上述硝酸，氢氟酸混合液体积比为双蒸水:0.22wt.%HF:0.57 wt.%HNO₃=1000:2:4。

优选的，上述盐酸、硫酸混合酸按体积比为双蒸水:37 wt.%HCl:98 wt.%H₂SO₄=6:1:1。

优选的，上述维生素C溶液是将维生素C粉末溶于0.9 vt.%生理盐水中，配制成100mM或10mM的含维生素C溶液。

有益效果：本发明提供的种植体液态存储方法，钛表面能够被储存液提前活化，具有促进成骨细胞黏附、增殖和分化的作用， 更好的促进新骨形成。同时具有良好的润湿性和生物相容性，有广泛的应用价值。

附图说明

图1为光滑钛片表面MC3T3-E1成骨细胞接种2h、4h后的粘附形态荧光图像 ；

图2为光滑钛片在不同存储液中储存10天表面接种MC3T3-E1成骨细胞1、3、6天cck-8检测细胞增殖活性对比图；

图3为光滑钛片在不同存储液中储存10天表面接种MC3T3-E1成骨细胞western blot检测OPN、OSX 、OCN 、Runx2成骨相关蛋白的表达电泳图；

图4为光滑钛片在不同存储液中储存10天，钛片表面水接触角对比图；

图5为SLA钛片表面MC3T3-E1成骨细胞接种2h、4h后的粘附形态荧光图像；

图6为SLA钛片在不同存储液中储存10天表面接种MC3T3-E1成骨细胞1、3、6天cck-8检测细胞增殖活性；

图7为SLA钛片在不同存储液中储存10天表面接种MC3T3-E1成骨细胞western blot检测OPN、OSX 、OCN 、Runx2成骨相关蛋白的表达电泳图；

图8为SLA钛片在不同存储液中储存10天，钛片表面水接触角对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本方法进一步说明。

实施例1

一种含维生素C的种植体液态储存方法 ，其方法包括下列步骤：

（1）钛片预处理：依次用SiC防水砂纸 (320目、600目、800目、1200目、1500目) 同方向逐级打磨至表面呈金属光泽，表面划痕一致。依次以双蒸水 、无水乙醇和双蒸水超声清洗15 min。

（2）配制含维生素C储存液，将维生素粉溶解于生理盐水中，配制成100mM、10mM的维生素C溶液。

（3）将步骤1的钛片双蒸水超声清洗后密闭、避光储存于配制好的维生素C溶液10天。

实施例2

一种含维生素C的种植体液态储存方法，其方法包括下列步骤 ：

（1）钛片预处理：依次用SiC防水砂纸 (320目、600目、800目、1200目、1500目) 同方向逐级打磨至表面呈金属光泽，表面划痕一致。再依次以双蒸水 、无水乙醇和双蒸水超声清洗 15 min。

（2）在步骤（1）的基础上Al(OH)₃喷砂（压力：0.3MPa，粒度：80目，距离：1.5cm，角度：80度，时间：15s），依次置于丙酮、75vt.%乙醇和蒸馏水中超声清洗，干燥；硝酸，氢氟酸混合液按照体积比为双蒸水:0.22wt.%HF:0.57 wt.%HNO₃=1000:2:4室温处理10min，双蒸水超声15min，干燥; 盐酸、硫酸混合酸按体积比为双蒸水:37 wt.%HCl:98 wt.%H₂SO₄=6:1:1 80摄氏度水浴处理30min，双蒸水超声清洗15min。

（3）配制含维生素C储存液，将维生素粉溶解于生理盐水中，配制成100mM、10mM的维生素C溶液。

（4）将步骤1、2的钛片双蒸水超声清洗后密闭、避光储存于配制好的维生素C溶液10天。

在实施例1、2中，储存于空气和生理盐水为对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的为实验组，用激光共聚焦显微镜拍摄光滑钛片表面MC3T3-E1成骨细胞接种2h、4h后的粘附形态荧光图像。图1和图5可以观察出相于对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片和SLA钛片成骨细胞表面积最大，丝足伸展充分，表明储存于100mM浓度的维生素C存储液有利于成骨细胞的黏附。

在实施例1、2中，储存于空气和生理盐水为对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的为实验组，储存10天后，将MC3-T3-E1成骨细胞系在其表面培养1、3、6天后，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。图2和图6结果表明，储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片表面和SLA钛片表面较对照组具有更好的促进细胞增殖的作用。

在实施例1、2中，储存于空气和生理盐水为对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的为实验组，储存10天后，将MC3-T3-E1成骨细胞系在其表面培养7天后，用WesternBlot检测成骨相关蛋白的表达水平，相比对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片和SLA钛片表面的MC3T3-E1细胞的Runx2、OPN、OSX、OCN蛋白表达水平均显著增强。图3和图7结果表明，储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片和SLA钛片能有效促进MC3T3-E1细胞对成骨相关基因和蛋白的表达。

在实施例1、2中，储存于空气和生理盐水为对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的为实验组，储存10天后，检测光滑钛片表面水接触角，相对于对照组，储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片和SLA表面的水接触角最小。图4和图8结果表明储存于100mM浓度的维生素C存储液的光滑钛片表面的生物相容性最好。

综合上述实验结果，储存于含100mM浓度的维生素C存储液的钛表面能够被储存液提前活化，具有促进成骨细胞黏附、增殖和分化的作用，更好的促进新骨形成。同时具有良好的润湿性和生物相容性，有广泛的应用价值。